CN104884094A

CN104884094A - 通过选择性递送寡核苷酸分子至特定神经元类型治疗帕金森病的组合物和方法

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Publication number: CN104884094A
Application number: CN201380068146.3A
Authority: CN
Inventors: M·D·C·卡尔莫纳奥罗斯科; A·P·蒙泰费尔特罗; G·G·阿尔瓦拉多; M·维拉博韦尔; A·博尔托洛齐; F·阿蒂加斯佩雷斯
Original assignee: En Laifu Medical Treatment Co Ltd
Current assignee: En Laifu Medical Treatment Co Ltd
Priority date: 2012-10-26
Filing date: 2013-10-25
Publication date: 2015-09-02
Also published as: WO2014064257A1; MX2015005352A; ES2967530T3; EP2911695B1; JP2015536927A; US9084825B2; US20140120158A1; HK1214179A1; US20160083726A1; AU2013336581A1; EP2911695C0; JP6386461B2; CA2890112A1; EP2911695A1; US10125363B2

Abstract

本发明提供缀合物，其包括：(i)选择性试剂，其特异性结合一种或多种神经递质转运蛋白，所述神经递质转运蛋白选自多巴胺转运蛋白(DAT、)、血清素转运蛋白(SERT)或去甲肾上腺素转运蛋白(NET)，和(ii)核酸，其能够特异性结合与神经递质转运蛋白在相同的细胞中表达的靶分子，其中所述靶分子是α-突触核蛋白或编码α-突触核蛋白的mRNA。本发明的缀合物可用于将核酸递送至感兴趣的细胞，并且因此用于治疗需要下调由靶核酸编码的蛋白质的疾病以及用于递送显像剂至细胞用于诊断目的。

Description

通过选择性递送寡核苷酸分子至特定神经元类型治疗帕金森病的组合物和方法

发明领域

本发明涉及缀合物，其包括：特异性针对感兴趣靶的核酸，和通过它们对中枢神经***中特定细胞表面上的神经递质转运蛋白分子的亲和性使核酸递送至中枢神经***中特定细胞的基团。

背景技术

核酸的使用已经证明有效改变细胞的状态。脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)引入细胞可用于上调或下调细胞中具体基因的表达，从而影响一个或多个生物化学途径。用于改变细胞生理学的基于核酸的技术中，RNA干扰(RNAi)是给出用于在各种生物体中转录后水平调节基因表达的一般概念。可使用称为短干扰或“siRNA”的同源短(21-23bp)dsRNA片段实现RNAi基因沉默。当长dsRNA引入细胞系中时，细胞酶切酶将其切割成短干扰RNA(siRNA)分子。该短干扰RNA分子现在称为引导RNA。引导RNA将引导RNA诱导性沉默复合物(RISC)至同源的靶mRNA。一旦其形成与同源mRNA序列的杂合结构，RISC将切割mRNA。结果，不再产生由mRNA编码的蛋白质，从而引起基因的沉默。RNA干扰指动物中由短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的方法。

但是，开发用于脑病理学的基于RNAi的治疗方法的主要障碍是血脑屏障(BBB)。通过两个屏障***的存在将脑与潜在有毒的物质隔离：血脑屏障(BBB)和血液-脑脊液屏障(BCSFB)。认为BBB是吸收血清配体的主要途径，因为其表面积比BCSFB的表面积大约大5000倍。构成BBB的脑内皮细胞层代表针对CNS的许多不适使用潜在药物的主要障碍。作为一般原则，仅小的亲脂分子可横跨穿越BBB，即，从循环体系血液至脑。具有更大尺寸或更高疏水性的许多药物在治疗CNS不适的动物研究中显示有希望的结果。

除了直接脑内施用，已经描述了不同的策略，用于在CNS中通过全身性施用RNA干扰分子实现基因沉默。例如，Kumar等(Nature，2007，448：39-44)已经描述了siRNA和源自狂犬病病毒糖蛋白的肽的缀合物，该肽包括九聚物精氨酸，以及它们在静脉内注射之后使脑中基因表达沉默的能力。Xia等(Pharmaceutical Research，2007，24：2309-2316)已经描述了包括生物素化的siRNA的缀合物和包括抗生物素蛋白-抗运铁蛋白受体抗体的缀合物，其在全身性递送之后能够沉默中枢神经***中的基因表达。WO200979790描述了包括siRNA和共同称为Angiopeps的一系列肽的缀合物，其能够通过使用低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(LRP-1)的受体介导的转胞吞作用跨越血脑屏障，并且其允许全身性施用包括所述肽的缀合物而递送至CNS。WO2007107789描述了能够引起RNA干扰的化合物的用途，并且其对CNS中存在的靶是特异性的并且通过使用鼻内施用而递送至CNS。

数个报道已经提出与突触核蛋白特异性沉默试剂和不同的分子的缀合物，所述不同的分子帮助缀合物横跨细胞膜或横跨血脑屏障的转移。例如，WO2011087804描述了包括α-突触核蛋白特异性siRNA和源自狂犬病病毒糖蛋白G的肽的缀合物，该肽允许缀合物跨越血脑屏障。WO2012027713描述了α-突触核蛋白特异性dsRNA和不同部分的缀合物，所述不同部分增强dsRNA的活性、细胞分布或吸收，比如脂质部分(胆固醇)、胆酸、硫醚、巯基胆固醇、脂族链(例如十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂、聚胺或聚乙二醇链、金刚烷乙酸、棕榈基部分或硬脂胺或己基氨基-羰基氧胆固醇部分。但是，所有这些缀合物旨在是非特异性递送横跨生物膜或生物屏障，但是未赋予针对其中表达突触核蛋白的细胞的特异性。

但是，尽管所有这些***允许全身性施用的siRNAs递送至CNS，却不允许递送至脑中的特定细胞类型。WO2011131693公开了包括核酸和选择性试剂的缀合物，所述核酸与靶核酸序列互补并且其表达阻止或降低靶核酸的表达，所述选择性试剂能够高亲和性结合神经递质转运蛋白。这些缀合物用于递送具体核酸至感兴趣的细胞。

递送具有已知特异性的siRNA至中枢神经***的可能性将可用于治疗由给定基因的非期望的活性/表达造成的疾病，包括抑郁症、认知障碍、帕金森病、阿尔茨海默氏疾病等。

帕金森病(PD)是中枢神经***的退行性病变，其通常损害患者的运动技能、言语和其他功能。帕金森病的症状源自黑质致密区(SNpc)中显著降低的多巴胺能细胞的活性。这些神经元投射至纹状体并且它们的损失导致改变基底神经节中调节运动的神经电路的活性，本质上抑制直接途径和激发间接途径。直接途径促进运动，间接途径抑制运动，因此这些细胞的损失导致运动机能减退性运动障碍。多巴胺的缺失导致增加丘脑腹前核的抑制，其发送兴奋性投射至运动皮质，因此导致运动功能减退症。

PD的特征在于SNpc中多巴胺能神经元的进行性损失和存在命名为路易体(LB)的细胞内包含体。神经化学上，PD的特点是线粒体复合物I功能障碍和增加的氧化应激指数。已经为PD提出了数个病原性机制，包括氧化和硝化应激、线粒体功能障碍、蛋白质错折叠和聚集，和细胞凋亡。PD是非常零星的但是一些PD病例已经显示是家族连锁的。鉴定的第一个家族连锁PD基因是α-突触核蛋白(α-syn)，其实际上是所有PD患者中LB的主要成分。对于α-突触核蛋白的正常功能知道较少。α-突触核蛋白可结合脂质，并且在神经元中，与突触前小泡和质膜相关联，这可能经由脂膜筏。沉积的病理学形式的α-突触核蛋白聚集并且显示比正常蛋白质更低的溶解度。已经描述了三点突变造成家族PD，而且已经报道了SNCA基因的复制体和三份复制体造成了PD和路易体疾病。所以，即使没有序列变体，α-突触核蛋白给药可与路易体疾病有因果关系。

α-突触核蛋白影响线粒体和可能诱导细胞凋亡。事实上，有不断增加的证据表明α-突触核蛋白和氧化损伤之间的密切关系：突变体α-突触核蛋白的过表达使得神经元对氧化应激和多巴胺和复合物I抑制剂造成的损伤敏感，导致增加体外和体内的蛋白质羰基化和脂质过氧化反应。相反地，线粒体复合物I的功能障碍已经与零星形式的PD相关。复合物I依赖性氧化损伤和有缺陷的线粒体功能是PD中神经退化和细胞死亡的主要原因。因此受损的线粒体功能和ROS产生增加线粒体膜间空间中的细胞色素c库水平，允许其当细胞死亡拮抗因子Bax被激活时快速释放。

总之，PD中的情形将是具有增加ROS产生的神经线粒体功能障碍的情况，其一方面增加a-突触核蛋白积聚和另一方面激活Bax介导的细胞死亡。此外，α-突触核蛋白积聚又将增加细胞ROS产生和诱导神经退化。

对于PD最广泛使用的治疗是各种形式的L-DOPA。但是，仅1-5％的L-DOPA进入多巴胺能神经元。剩余的L-DOPA通常在其他地方代谢成多巴胺，引起各种副作用。多巴脱羧酶抑制剂，如卡比多巴和苄丝肼，也用于治疗PD，因为它们有助于防止L-DOPA在其到达多巴胺能神经元之前代谢并且一般作为卡比多巴/左旋多巴和苄丝肼/左旋多巴的组合制剂给药。而且，多巴胺激动剂是适度有效的并且通过刺激一些多巴胺受体起作用。但是，它们引起多巴胺受体进行性较不敏感，从而最终增加症状。

反义方法也可能是有帮助的，并且已经报道了在大鼠和小鼠脑中起作用。该方法是基于α-突触核蛋白实际上对于在人中CNS功能不是必须的想法，因为其出现在小鼠中，但是也许甚至中等的蛋白质水平降低足以减少PD进展。

但是，尽管开发PD疗法有进展，仍需要特异性能够防止减少黑质致密区域中多巴胺能细胞活性的替代化合物。

发明内容

本发明的发明人已经识别了人α-突触核蛋白mRNA序列中不同的具体区域，当使用沉默分子靶向时，其导致切割α-突触核蛋白mRNA。这已经通过在核糖核酸酶-H介导的试验中测试反义寡核苷酸和通过测试α-突触核蛋白mRNA的下调而显示。而且，优选的沉默核酸的间隙体(gapmer)形式(cuccCTCCACTGTCuucu，SEQ ID NO：2)已经偶联至三倍阻断剂茚达曲林。发明人已经显示茚达曲林当鼻内施用时能够将反义寡核苷酸靶向表达血清素5-HT_1A受体的细胞，并且茚达曲林能够将荧光团靶向包含表达多巴胺转运蛋白(DAT)的细胞的脑区域(例如，黑质体)，靶向包含表达去甲肾上腺素转运蛋白NET的细胞的脑区域(例如基因座coeruleous)和靶向包含表达血清素转运蛋白SERT的细胞的脑区域(例如中缝核和中缝背核)。而且，发明人也已经显示鼻内施用包括茚达曲林和优选的候选物间隙体的缀合物导致通过原位杂交测定的突触核蛋白mRNA的水平下降。

根据本发明的沉默分子具有一些优势。首先，其特异性靶向其中表达待沉默蛋白质的细胞，避免由于在非期望的位置沉默蛋白质的副作用。第二，根据本发明的沉默分子使用神经递质转运蛋白转移横跨细胞膜。

因此，在第一方面中，本发明涉及缀合物，其包括：

i)至少一种选择性试剂，其特异性结合一种或多种神经递质转运蛋白，所述神经递质转运蛋白选自多巴胺转运蛋白(DAT)、血清素转运蛋白(SERT)或去甲肾上腺素转运蛋白(NET)，和

ii)至少一种核酸，其能够特异性结合与神经递质转运蛋白在相同的细胞中表达的靶分子，其中所述靶分子是α-突触核蛋白或编码α-突触核蛋白的mRNA。

在第二方面中，本发明涉及根据本发明的缀合物，其用于药品。

在进一步方面中，本发明涉及根据本发明的缀合物，其用于治疗或预防与路易体的沉积相关的疾病。

在进一步方面中，本发明涉及合成具有结构(III)的缀合物的方法。

其中n、m、p、q、R1、R3、R4和R5如下限定，并且其中所述寡核苷酸是能够特异性结合靶分子的核酸，其中所述靶分子是α-突触核蛋白或编码α-突触核蛋白的mRNA，所述方法包括使具有结构(V)的化合物

与具有式(VI)的羧基修饰的寡核苷酸反应：

在进一步方面中，本发明涉及具有结构(VI)的化合物，其中所述寡核苷酸是能够特异性结合靶分子的核酸，其中所述靶分子是α-突触核蛋白或编码α-突触核蛋白的mRNA。

在进一步方面中，本发明涉及缀合物，其包括：

(i)至少一种选择性试剂，其特异性结合一种或多种神经递质转运蛋白，所述神经递质转运蛋白选自多巴胺转运蛋白(DAT)、血清素转运蛋白(SERT)或去甲肾上腺素转运蛋白(NET)，和

(ii)显像剂。

在最后一方面中，本发明涉及使表达神经递质转运蛋白的细胞显像的方法，其包括使所述细胞与根据本发明的缀合物接触，其中形成缀合物的部分的所述选择性试剂特异性结合由所述细胞表达的神经递质转运蛋白。

本发明的这些和其他目标将在以下详细描述部分被进一步描述，并且它们不旨在限制本发明。除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。与本文所述的那些相似或等价的方法和材料可用于本发明的实践。遍及该说明书和权利要求书，词“包括”和其变型不旨在排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。

附图说明

图1显示已经鼻内接受寡抗5HTIA和茚达曲林的小鼠中没有(R)-(+)-8-羟基-2-(二正丙氨基)四氢萘氢溴酸盐(8-OH-DPAT，选择性5-HT_1AR激动剂)诱导的低体温响应。小鼠接受：i)媒介(PBS)，ii)茚达曲林无义siRNA(IND-ns-siRNA)，iii)30μg茚达曲林-1A77siRNA(IND-1A77-siRNA，iv)30μg舍曲林-1a77siRNA(SERT-1a77-siRNA)或v)100μg茚达曲林-1A77-siRNA(IND-1A77siRNA)。施用8-OH-DPAT(1mg/kg i.p.)之前5min和之后15、30、60和120min测量体温。值显示为每组5只小鼠的体温改变的平均值±SEM。

图2显示为选择候选物分子进行的核糖核酸酶H试验。人α突触核蛋白mRNA的体外转录之后，纯化该mRNA并且进行核糖核酸酶H试验，以测量各个序列作为酶的潜在诱导物的活性。简言之，mRNA(100nM)在具有5倍过多不同分子(500nM)的缓冲液中37℃下温育7.5分钟。其后，停止反应，在琼脂糖凝胶上对样品跑胶并且进行UV可视化。序列对于人、小鼠或二者是特异性的。就它们对诱导核糖核酸酶H活性的抑制(hability)、它们的种间同源性，和缺少与β和γ突触核蛋白的同源性，选择所选的序列(候选物)。

图3显示根据本发明的缀合物的方案。其包括作为选择性试剂的茚达曲林和由C10接头连接的18-碱基间隙体。

图4显示通过根据本发明的候选物分子1232、1233和1234在嗅球(BO)、黑质体(SNc/VTA)、中缝背核(DR)和中缝(MnR)中抑制α-突触核蛋白mRNA表达。

图5显示来自获得自患零星帕金森病(PD)的个体死后脑样品的中间和侧黑质体(SN)的分析。SN展示PD中大量的组织损伤。结果提供了对PD发病机理的理解。

图6显示伸展蛋白mRNA的比对。用CLC序列wiewer软件比对人、猕猴和小鼠伸展蛋白mRNA并且分析以找出它们和候选物1234之间推定的同源性(与人中α-突触核蛋白mRNA共同的15nt的候选物1234显示在框中)。

图7显示根据本发明优选的缀合物分子1233(NLF-PD1233)的方案。

图8显示通过蛋白质印迹的黑质体致密区域(SNc)中α-突触核蛋白水平(A)。针对β-肌动蛋白(B)和酪氨酸羟化酶(TH)(C)对α-突触核蛋白的SNc/VTA水平归一化，和针对β-肌动蛋白对TH水平归一化(D)。N＝8-10。显著性：Newman-Keuls多重比较检验(对PBS*p＜0.05)。作为用于面积提取的对照，TH水平对β-肌动蛋白比平均低2倍的动物未包括在分析中。

图9显示通过蛋白质印迹的纹状体中α-突触核蛋白蛋白质水平(A)。显示了针对β-肌动蛋白(B)和酪氨酸羟化酶(TH)(C)归一化的α-突触核蛋白的纹状体水平，以及针对β-肌动蛋白归一化的TH的水平(D)。N＝8-10。显著性：Newman-Keuls多重比较检验(对PBS*p＜0.05)。作为用于面积提取的对照，TH水平对β-肌动蛋白比平均数低2倍的动物不包括在分析中。

图10显示小鼠中未修饰的1233(NLF-PD-1233)对其3’保护的衍生物的血浆浓度。

图11显示静脉内(IV)施用之后猴子中1233(NLF-PD-1233)的血液浓度。数据表达为平均值。

图12显示鼻内(IN)施用之后猴子中1233(NLF-PD-1233)的CSF(脑脊液)和血液浓度。数据表达为平均值。

图13显示静脉内给药之后小鼠中未修饰的1233(NLF-PD-1233)的组织浓度。

图14显示静脉内给药之后小鼠中未修饰的1233(NLF-PD-1233)加代谢物的组织浓度。

图15显示静脉内给药之后小鼠中1233(NLF-PD-1233)的3’保护的衍生物的组织浓度。

图16显示静脉内给药之后小鼠中1233(NLF-PD-1233)的3’保护的衍生物加代谢物的组织浓度。

图17显示用媒介(PBS)或1233(NLF-PD-1233、连续4天、1mg/kg/天)处理的动物中通过HPLC测量的藜芦定诱发多巴胺释放的微量透析体内试验。

图18显示用媒介(PBS)或1233(NLF-PD-1233、连续4天、1mg/kg/天)处理的动物中通过HPLC测量的细胞外多巴胺的微量透析体内试验。

发明详述

本发明的作者观察到通过共价偶联核酸至能够特异性结合神经递质转运蛋白和更具体地结合所述转运蛋白的抑制剂的分子，特异性靶向所述核酸至表达所述神经递质转运蛋白的感兴趣的细胞是可能的。尤其，作者已经显示，将偶联至选择性试剂的α-突触核蛋白mRNA的具体区域靶向至DAT、SERT或NET神经递质转运蛋白的核酸能够降低α-突触核蛋白mRNA表达水平。

A.本发明的缀合物

在第一方面中，本发明涉及缀合物，其包括：：

如本文所使用，术语“缀合物”指由两种或多种单个化合物的共价连接产生的任何化合物。在本发明中，缀合物指包括选择性试剂和核酸的分子，它们被共价偶联，为直接的所述偶联或经连接化合物。

术语“共价偶联”或“共价连接”意思是核酸和选择性试剂彼此直接共价连接，或通过一个间插部分或多个间插部分比如接头、或桥、或一个间隔子部分或多个部分彼此间接共价连接。

A.1.本发明的缀合物的选择性试剂

如本文所使用，表达“特异性结合一种或多种神经递质转运蛋白的选择性试剂”指结合神经递质转运蛋白的任何物质。该结合特异性允许将连接至所述选择性试剂的分子递送至包含所述神经递质转运蛋白的细胞、组织或器官。以此方式，当施用至动物或与不同类型的细胞群体外接触时，运送所述选择性试剂的缀合物将被特异性引导至所述细胞。

如本文所使用，第一分子与第二分子的特异性结合指第一分子以可测量地不同于非特异性相互作用的方式结合所述第二分子的能力。根据本发明的选择性试剂可显示针对靶(神经递质转运蛋白)的Kd如下：至少约10^-4M、可选地至少约10^-5M、可选地至少约10^-6M、可选地至少约10^-7M、可选地至少约10^-8M、可选地至少约10^-9M、可选地至少约10^-10M、可选地至少约10^-11M、可选地至少约10^-12M或更高。

如本文所使用，术语“神经递质转运蛋白”指属于跨越神经元的细胞膜的一类膜运输蛋白质的蛋白质，并且其主要功能是运送神经递质横跨这些膜和引导其进一步转运至特定细胞内位置。可被本发明的选择性试剂靶向的神经递质转运蛋白包括但不限于存在于神经元和神经胶质细胞的质膜中的吸收载体，其将神经递质从细胞外空间泵送至细胞内。该方法依赖于横跨质膜的Na+梯度，尤其是Na+的协同转运。识别了两个蛋白质家族。一个家族包括GABA的转运蛋白，单胺比如去甲肾上腺素、多巴胺、血清素，和氨基酸比如甘氨酸和脯氨酸。常见的结构组分包括十二个推定的跨膜α-螺旋结构域、细胞质N-和C-末端、和分离跨膜结构域三和四的大的糖基化胞外环。该同源蛋白质家族从Na⁺和Cl^-离子与神经递质的协同转运进入细胞获得其能量(Na⁺/Cl^-神经递质转运蛋白)。第二家族包括用于兴奋性氨基酸比如谷氨酸的转运蛋白。常见的结构组分包括推定的6-10跨膜结构域、细胞质N-和C-末端、和细胞外环中的糖基化。兴奋性氨基酸转运蛋白不取决于Cl-，并且可能需要细胞内K+离子(Na+/K+-神经递质转运蛋白)(Liu，Y.等(1999)Trends Cell Biol.9：356-363)。

可被本发明的选择性试剂靶向的神经递质转运蛋白也包括存在于细胞内囊泡膜中的神经递质转运蛋白，通常为突触小泡，其主要功能是在突触传递期间囊泡内含物的胞吐之前，从细胞质浓缩神经递质至小泡内。囊泡运输使用横跨由H+-ATP酶产生的囊泡膜的电化学梯度。两个蛋白质家族包括在神经递质至小泡的运输中。一个家族使用主要地质子交换以驱动至分泌小泡内的运输，并且包括用于单胺和乙酰胆碱的转运蛋白。例如，单胺转运蛋白对于细胞质发射器的每个分子交换两个腔的质子。第二家族包括GABA转运蛋白，其依赖于突触小泡内侧的正电荷。两种类型的囊泡转运蛋白显示彼此没有序列相似性，并且具有不同于质膜载体的那些的结构(Schloss，P.等(1994)Curr.Opin.Cell Biol.6：595-599；Liu，Y.等(1999)TrendsCell Biol.9：356-363)。

在优选的实施方式中，选择性试剂不是肽。

可以用本发明的选择性试剂靶向的神经递质转运蛋白的具体类型包括多巴胺转运蛋白(DAT)、血清素转运蛋白(SERT)和去甲肾上腺素转运蛋白(NET)。

术语“多巴胺转运蛋白”或“DAT”或“SLC6A3”指这样的分子，其为从突触间隙运输神经递质多巴胺并且将其沉积在周围细胞内的整合膜蛋白，因此终止神经递质的信号。人SLC6A3(溶质载体家族6，神经递质转运蛋白，多巴胺，成员3)基因以检索号NG_015885.1被保藏在NCBIGenBank中(2012年10月7日的版本)，和人SLC6A3mRNA以检索号NM_001044.4保藏。人多巴胺转运蛋白蛋白质以检索号NP_001035.1被保藏在GenBank中。

如本文所使用，术语“血清素转运蛋白”或“SERT”或“SLC6A4”指这样的多肽，其为使神经递质血清素从突触空间运输至突触前神经元内的整合膜蛋白。人SLC6A4(溶质载体家族4，神经递质转运蛋白，血清素，成员4)基因以检索号NG_011747.1被保藏在NCBI GenBank中(2012年10月21日的版本)，和人SLC6A4mRNA以检索号NM_001045.4被保藏。人血清素转运蛋白蛋白质以检索号NP_001036.1被保藏在GenBank中。人、大鼠、小鼠和牛SERT的序列在SwissProt数据库中提供，检索号分别为P31645、P31652、Q60857和Q9XT49。与靶向5-HT_1AR cDNA的核酸类似，SERT cDN中的任何区域可被靶向，只要它导致显著抑制相应的mRNA水平或编码由所述mRNA编码的蛋白质。因此，在所述细胞与待测试的核酸接触以后，通过测量表达SERT的细胞中SERT mRNA或SERT蛋白质的水平，适合的SERT-特异性核酸可如上所述被识别。

术语“去甲肾上腺素转运蛋白”或“NET”或“SLC6A2”指这样的分子，其为将突触释放的去甲肾上腺素运回至突触前神经元内的跨膜蛋白质。人SLC6A2(溶质载体家族6，神经递质转运蛋白，去甲肾上腺素，成员2)基因以检索号NG_016969.1被保藏在NCBI GenBank中(2012年10月21日的版本)。人去甲肾上腺素转运蛋白的四种转录物被保藏在GenBank中。mRNA转录体变体1(mRNA1)是编码更长的同种型或同种型1的人去甲肾上腺素转运蛋白的转录体变体。该mRNA1以检索号NM_001172504.1被保藏在GenBank中。与变体1相比，mRNA转录体变体2(mRNA2)是包括编码区域的交替的3′外显子的转录体变体。该mRNA2以检索号NM_001172501.1被保藏在GenBank中。与变体1相比，mRNA转录体变体3(mRNA3)是具有包括编码区域的交替的3′外显子的转录体变体。该mRNA3以检索号NM_001043.3被保藏在GenBank中。与变体1相比，mRNA转录体变体4(mRNA4)是具有包括5′和3′编码区域的交替的5′和3′序列的转录体变体。该mRNA4以检索号NM_001172502.1被保藏在GenBank中。四种人蛋白质同种型以检索号NP_001165975.1、NP_001165972.1、NP_001034.1和NP_001165973.1被保藏在GenBank中。

在具体的实施方式中，所述选择性试剂选自三重再摄取抑制剂、去甲肾上腺素多巴胺双重再摄取抑制剂、血清素单一再摄取抑制剂、去甲肾上腺素单一再摄取抑制剂和多巴胺单一再摄取抑制剂。

术语“三重再摄取抑制剂”或“TRI”，也称为血清素、去甲肾上腺素和多巴胺再摄取抑制剂(SNDRI)，指通过分别阻断血清素转运蛋白(SERT)、去甲肾上腺素转运蛋白(NET)和多巴胺转运蛋白(DAT)的作用，同时充当单胺神经递质、血清素(5-HT)、去甲肾上腺素(去甲肾上腺素，NA)和多巴胺(DA)的再摄取抑制剂的分子。这又导致这些神经递质的增加的细胞外浓度，和因此导致血清素能、去甲肾上腺素能或肾上腺素能、和多巴胺能神经传递的增加。在具体的实施方式中，本发明的三重再摄取抑制剂是多巴胺、血清素、去甲肾上腺素三重再摄取抑制剂。

术语“双重再摄取抑制剂”指能够同时抑制两种神经递质转运蛋白的再摄取的分子。在具体的实施方式中，本发明的双重再摄取抑制剂是去甲肾上腺素多巴胺双重再摄取抑制剂。

术语“单一再摄取抑制剂”指能够抑制具体神经递质转运蛋白的再摄取的分子。在本发明的具体实施方式中，所述单一再摄取抑制剂是多巴胺单一再摄取抑制剂。

术语“多巴胺再摄取抑制剂”或“DRI”通过阻断多巴胺转运蛋白(DAT)的作用充当神经递质多巴胺的再摄取抑制剂。这又导致多巴胺的增加的细胞外浓度，和因此多巴胺能神经传递的增加。适合的DRI包括但不限于，药物比如安咪奈丁、苯扎托品/苯托品、丁氯苯丙酮、右哌甲酯、艾***、乙苯托品/Ethybe、乙苄托品(Ponalide)、芬坎法明、芬咖明、克他命、利非他明、美地沙明、美索卡、哌甲酯、奈福泮、诺米芬新、哌苯甲醇、普罗林坦、吡咯戊酮、替来他明和曲吡那敏；研究化学品，比如altropane、安福萘酸、苯环己哌啶、布索芬新、bromantane、DBL-583、dichloropane、双氮奋兴、Dieticyclidine、difluoropine、加环利定、GBR-12、935、茚达曲林、碘氟潘、Iometopane、马尼法辛、瑞达法辛、他美曲林、特索芬辛、托帕利酯(troparil)和伐诺司林。适合的DRI可使用技术人员已知的试验识别，比如测定推定的DRI抑制通过由大鼠纹状体制备的突触小体制剂高亲和性吸收多巴胺的能力，如使用Kula等公开的方法描述(Life Sciences 34：2567-2575，1984)。

如本文所使用，术语“去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂”或“NDRI”，指通过分别阻断去甲肾上腺素转运蛋白(NET)和多巴胺转运蛋白(DAT)的作用，充当用于神经递质去甲肾上腺素和多巴胺的再摄取抑制剂的化合物。这又导致去甲肾上腺素和多巴胺二者的增加的细胞外浓度，并且因此导致肾上腺素能和多巴胺能神经传递的增加。用于本发明的缀合物中的适合的NDRI包括但不限于安咪奈丁(Survector，Maneon，Directin)、丁氯苯丙酮(Wellbutrin，Zyban)、右哌甲酯(Focalin)、芬坎法明(Fencamfamine)(Glucoenergan，Reactivan)、芬咖明(Fencamine)(Altimina，Sicoclor)、利非他明(Lefetamine)(Santenol)、哌甲酯(Ritalin，Concerta)、诺米芬新(Nomifensine)(Merital)、哌苯甲醇(Pipradrol)(Meretran)、普罗林坦(Prolintane)(Promotil，Katovit)，吡咯戊酮(Pyrovalerone)(Centroton，Thymergix)、奈福泮(Nefopam)(Acupan)、加贯叶金丝桃素(adhyperforin)(出现在金丝桃中(St.John′s Wort))、贯叶金丝桃素(hyperforin)(出现在金丝桃中(St.John′s Wort))、***、脱氧哌苯甲醇(Desoxypipradrol)(2-DPMP)、二苯基脯氨醇(Diphenylprolinol)(D2PM)、亚甲基二氧吡咯戊酮(MDPV)、西洛巴明(Cilobamine)、马尼法辛(Manifaxine)(GW-320，659)、瑞达法辛(Radafaxine)(GW-353，162)、他美曲林(Tametraline)(CP-24，441)。

术语“血清素再摄取抑制剂”或“SRI”指能够阻断血清素吸收和包括选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)(其阻断特异性血清素吸收，而基本上不影响其他神经递质)以及非选择性血清素再摄取抑制剂的分子，比如血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)和血清素-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(SNDRI)。

术语“血清素选择性再摄取抑制剂”或“SSRI”指血清素再摄取的选择性抑制剂而基本上不影响其他神经递质再摄取或转运蛋白***。这些化合物主要作用于前突触血清素能细胞，导致神经递质血清素的细胞外水平的增加，从而增加用于结合突触后的受体和逆转脑中该单胺能神经递质***的活性不足的血清素水平。SSRI的示意性非限制性例子包括舍曲林(CAS79617-96-2)、舍曲林结构类似物、氟西汀(CAS 54910-89-3)、氟伏沙明(CAS54739-18-3)、帕罗西汀(CAS 61869-08-7)、吲达品(indapline)(CAS63758-79-2)、齐美利定(zimeldine)(CAS 56775-88-3)、西酞普兰(CAS59729-33-8)和艾司西酞普兰(CAS 219861-08-2)。用于测定给定的化合物是否用作SSRI的试验是例如，减少血清素的离体吸收和拮抗对氯***的血清素-消耗作用而不影响大鼠静脉内[³H]去甲肾上腺素的心脏吸收的能力，如在Koe等(J.Pharmacol.Exp.Ther.，1983，226：686-700)中大体上描述。

术语“血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂”或“SNRI”指能够通过阻断血清素转运蛋白抑制再摄取血清素和通过阻断去甲肾上腺素转运蛋白抑制去甲肾上腺素再摄取的化合物家族。该家族包括下述化合物，比如文拉法辛(CAS 93413-69-5)、去甲文拉法辛(desvenlafaxine)(CAS 93413-62-8)、度洛西汀(duloxetine)(CAS 116539-59-4)、米那普仑(milnacipran)(CAS92623-85-3)、***(Sibutramine)(106650-56-0)、曲马多(CAS 27203-92-5)和比西发定(CAS 71195-57-8)。用于测定给定的化合物是否能够用作SNRI的实验是，例如，减少血清素和去甲肾上腺素被脑突触小体吸收的能力，如大体上在Bolden-Watson C，Richelson E.(Life Sci.1993；52(12)：1023-9)中描述。具体类型的SNRI是具有包含三个环的通式分子结构的SNRI的三环抗抑郁剂。三环抗抑郁剂中突出的是线性三环抗抑郁剂，例如，丙咪嗪、地昔帕明、阿米替林、去甲替林(nortriptyline)、普罗替林(protriptyline)、多虑平、氧丙咪嗪(ketipramine)、米安色林(mianserin)、度硫平(dothiepin)、阿莫沙平(amoxapine)、二苯西平(dibenzepin)、美利曲辛(melitracen)、马普替林、氟哌噻吨(flupentixol)、阿扎吩(azaphen)、噻奈普汀(tianeptine)和显示相似活性的相关化合物。角状三环化合物包括茚决林(indriline)、氯达酮(clodazone)、诺米芬辛(nomifensin)，和相关的化合物。各种其他结构上不同的抗抑郁剂，例如，伊普吲哚(iprindole)、wellbatrin、烟肼酰胺(nialamide)、米那普仑、苯乙肼(phenelzine)和反苯环丙胺(tranylcypromine)已经显示产生相似的活性。它们功能上与三环抗抑郁剂等价并且所以包括在本发明的范围内。因此，本发明人期望术语三环抗抑郁剂包括上述宽范围的抗抑郁剂以及具有它们都具有抗抑郁剂活性的相同性质的相关化合物，并且其包括，但不限于下述化合物：比如阿米替林、氧阿米替林(amitriptylinoxide)、卡马西平、布替林(butriptyline)、氯丙咪嗪、地美替林(demexiptiline)、地昔帕明、二苯西平、二甲他林(dimetacrine)、度硫平/度硫平、多虑平、丙咪嗪、氧米帕明(Imipraminoxide)、伊普吲哚、洛非帕明(Lofepramine)、美利曲辛、美他帕明(Metapramine)、Nitroxazepine、去甲替林、诺昔替林(Noxiptiline)、普瑞巴林、丙吡西平(Propizepine)、普罗替林、奎纽帕明(Quinupramine)和三甲丙咪嗪(Trimipramine)。

术语“去甲肾上腺素再摄取抑制剂”、“NRI”、“NERI”、“肾上腺素能再摄取抑制剂”或“ARI”指通过去甲肾上腺素转运蛋白(NET)的阻断作用能够阻断去甲肾上腺素和肾上腺素的再摄取的化合物家族。该化合物家族包括选择性NRI，其排他性阻断NET而不影响其他单胺转运蛋白，以及非选择性NRI，比如SNRI，其阻断去甲肾上腺素转运蛋白和血清素转运蛋白(见上)，去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)，其阻断去甲肾上腺素和多巴胺转运蛋白(见下)，三环抗抑郁剂和四环抗抑郁剂(见上)。适于本发明的适合的选择性NRI包括但不限于阿托西汀/托莫西汀(Strattera或CAS83015-26-3)、马吲哚(Mazanor，Sanorex或CAS 22232-71-9)、瑞波西汀(Reboxetine)(Edronax，Vestra或CAS 98819-76-2)和维洛沙秦(Viloxazine)(Vivalan或CAS 46817-91-8)。

在具体的实施方式中，本发明的缀合物包括选择性试剂，其为三重再摄取抑制剂。在本发明的优选的实施方式中，所述选择性试剂是具有下述结构(I)的三重再摄取抑制剂和其药学上可接受的形式：

其中

n或m是整数，其每个具有0和6之间的值，包括0和6；

p是具有0和4之间的值的整数，包括0和4；

R₁是氢；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的脂肪族；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的杂脂肪族；取代或未取代、支化或非支化的酰基；取代或未取代、支化或非支化的芳基；取代或未取代、支化或非支化的杂芳基；-C(＝O)R_A；-CO2R_A；-C(＝O)N(R_A)₂或-C(R_A)₃；其中R_A的每次出现独立地为氢、保护基团、脂肪族部分、杂脂肪族部分、酰基部分；芳基部分；杂芳基部分；烷氧基；芳氧基；烷硫基；芳硫基；氨基、烷氨基、二烷氨基、杂芳氧基；或杂芳硫基部分；

R₂是氢；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的脂肪族；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的杂脂肪族；取代或未取代、支化或非支化的酰基；取代或未取代、支化或非支化的芳基；取代或未取代、支化或非支化的杂芳基；-C(＝O)R_B；-CO2R_B；-C(＝O)N(R_B)₂或-C(R_B)₃；其中R_B的每次出现独立地为氢、保护基团、脂肪族部分、杂脂肪族部分、酰基部分；芳基部分；杂芳基部分；烷氧基；芳氧基；烷硫基；芳硫基；氨基、烷氨基、二烷氨基、杂芳氧基；或杂芳硫基部分；

R₃是氢；卤素；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的脂肪族；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的杂脂肪族；取代或未取代、支化或非支化的酰基；取代或未取代、支化或非支化的芳基；取代或未取代、支化或非支化的杂芳基；-OR_C；-C(＝O)R_C；-CO₂R_C；-CN；-SCN；-SR_C；-SOR_C；SO₂R_C；-NO₂；-N₃；-N(R_C)₂；-NHC(＝O)R_C；-NR_CC(＝O)N(R_C)₂；-OC(＝O)OR_C；-OC(＝O)R_C；-OC(＝O)N(R_C)₂；-NR_CC(＝O)OR_C；或-C(R_C)₃；其中R_C的每次出现独立地为氢、保护基团、脂肪族部分、杂脂肪族部分、酰基部分；芳基部分；杂芳基部分；烷氧基；芳氧基；烷硫基；芳硫基；氨基、烷氨基、二烷氨基、杂芳氧基；或杂芳硫基部分；

R₄是取代或未取代、支化或非支化的芳基；或取代或未取代、支化或非支化的杂芳基；

R₅是氢；卤素；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的脂肪族；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的杂脂肪族；取代或未取代、支化或非支化的酰基；取代或未取代、支化或非支化的芳基；取代或未取代、支化或非支化的杂芳基；-OR_E；-C(＝O)R_E；-CO₂R_E；-CN；-SCN；-SR_E；-SOR_E；SO₂R_E；-NO₂；-N₃；-N(R_E)₂；-NHC(＝O)R_E；-NR_EC(＝O)N(R_E)₂；-OC(＝O)OR_E；-OC(＝O)R_E；-OC(＝O)N(R_E)₂；-NR_EC(＝O)OR_E；或-C(R_E)₃其中R_E的每次出现独立地为氢、保护基团、脂肪族部分、杂脂肪族部分、酰基部分；芳基部分；杂芳基部分；烷氧基；芳氧基；烷硫基；芳硫基；氨基、烷氨基、二烷氨基、杂芳氧基；或杂芳硫基部分。

在本发明的更优选的实施方式中，本发明的缀合物的选择性试剂是具有下述结构(II)的三重再摄取抑制剂：

其中具有结构(II)的选择性试剂也被称为(1R，3S)-3-(3，4-二氯苯基)-N-甲基-2，3-二氢-1H-茚-1-胺或茚达曲林。

A.2.本发明的缀合物的核酸

根据本发明的缀合物的第二组分是核酸，其能够特异性结合与神经递质转运蛋白在相同的细胞中表达的靶分子，其中所述靶分子是α-突触核蛋白或编码α-突触核蛋白的mRNA。

如本文所使用，术语“α-突触核蛋白”，指突触核蛋白成员家族(α-突触核蛋白、β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白)的多肽，其包含与可交换的载脂蛋白的A2型脂质-结合结构域类似的高度保守的α-螺旋脂质-结合基序并且其能够形成称为路易体的细胞内聚集，所述路易体出现在某些神经疾病，比如帕金森病、阿尔茨海默氏疾病和路易体疾病中。

人、大鼠、小鼠和牛α-突触核蛋白的序列提供在SwissProt数据库中，检索号分别为P37840、P37377、O55042和Q3T0G8。与靶向5-HT_1AR cDNA的核酸类似，可使用如上述的任何方法识别或选择α-突触核蛋白-特异性核酸并且测试它们诱导相应的mRNA或由所述mRNA编码的蛋白质的水平显著抑制能力。因此，可如上述通过测量所述细胞已经接触待测试的核酸之后，表达α-突触核蛋白的细胞中α-突触核蛋白mRNA的水平或α-突触核蛋白蛋白质水平，识别适合的α-突触核蛋白-特异性核酸。

典型地，本发明的核酸能够抑制靶分子的功能，即抑制α-突触核蛋白的功能。因此，如果靶分子是α-突触核蛋白mRNA，那么核酸通过抑制α-突触核蛋白mRNA的翻译而导致mRNA编码的α-突触核蛋白蛋白质的水平下降而起作用。如果靶分子是α-突触核蛋白，那么核酸(通常是适配体)通过抑制蛋白质的活性起作用。

如本文所使用，术语“核酸”指这样的聚合物，其具有两种或多种脱氧核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸类似物分子以及结构上与天然核酸类似但是与天然核酸(例如，通过化学修饰)在核酸骨架(例如，天然核酸中的磷酸)、核酸糖(例如，用于天然DNA的脱氧核糖和天然RNA中的核糖)和核酸碱基(例如，天然核酸中的腺苷、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸苷)的一种或多种不同的分子。

寡核苷酸可以是双链或单链寡核苷酸，其包括但不限于小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸或核酶。如果使用双链核酸，那么这些包括与靶核酸互补的第一有义链，和与有义链互补的第二反义链，其使得通过第一链和第二链之间的碱基配对形成双链DNA。

术语“反义链”指包括基本上与靶序列互补区域的双链核酸的链，其中互补区域不是与靶序列完全互补的，在反义链5′末端核苷2-7外侧的错配是最可能被容许的。如本文所使用，术语“有义链”指包括基本上与反义链区域互补的区域的dsRNA的链。

在本发明的具体实施方式中，能够特异性结合与神经递质转运蛋白在相同的细胞中表达的靶分子的核酸序列选自间隙体、双链干扰RNA、具有微RNA活性的双链RNA、反义寡核苷酸、抗微RNA、preMiRNA、编码微RNA或shRNA的mRNA、PNA、LNA、核酶和适配体。

如本文所使用，“反义寡核苷酸”包括反义寡核苷酸或有义寡核苷酸，其包含能够结合靶mRNA(有义)或DNA(反义)序列的单链核酸序列(RNA或DNA)。基于编码给定蛋白质的cDNA序列产生反义或有义寡核苷酸的能力描述在例如Stein和Cohen，Cancer Res.48：2659，(1988)和van der Krol等，BioTechniques 6：958，(1988)中。

如本文所使用，术语“核酶”或“RNA酶”或“催化RNA”指催化化学反应的RNA分子。许多天然核酶催化它们自身磷酸二酯键的水解，或其他RNA中键的水解，但是也发现它们催化核糖体的转氨酶活性、DNA连接酶的连接酶活性，和通过常规的蛋白质酶进行的许多其他化学反应。

如本文所使用，“适配体”指结合靶分子上多于一个位点的核酸配体，其中结合不是“互补的”，即不是由于核酸配体和靶核酸序列之间的碱基对形成。可设计适配体结合任何可想到的靶，包括多肽。适配体提供生物技术和治疗性应用的用途，因为它们提供与通常使用的生物分子——抗体——竞争的分子识别特性。除了它们的选择性识别，适配体提供优于抗体的优势，因为它们可在试管中被充分工程化，容易通过化学合成产生、具备期望的储存特性，和在治疗性应用中几乎不引起免疫原性。适配体可通过重复轮的体外分离、选择和扩增合成，其是现有技术称为“SELEX”(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment)的方法(Shamah等，Acc.Chem.Res.2008，41页，130-8)。可选地，它们可例如通过逐步固相合成。

本发明的核酸可包含核酸碱基、糖和/或核苷酸间键合中的一种或多种的修饰。

对核酸一个或多个骨架残基的修饰可包括下述的一种或多种：2′糖修饰比如2′-O-甲基(2′-OMe)、2′-O-甲氧乙基(2′-MOE)、2′-O-甲氧乙氧基、2′-氟(2′-F)、2′-AIIyI、2′-O-[2-(甲基氨基)-2-氧乙基]、2′-O-(N-氨基甲酸甲酯)；4′糖修饰包括4′-巯基、4′-CH₂-O-2′-桥、4-(CH₂)₂-O-2′-桥；锁定核酸(LNA)；肽核酸(PNA)；嵌入核酸(INA)；扭曲嵌入核酸(TINA)；己糖醇核酸(HNA)；***核酸(ANA)；环己烷核酸(CNA)；环己烯基核酸(CeNA)；苏氨酰(threosyl)核酸(TNA)；吗啉基寡核苷酸；间隙体；Mix-mers；并入富含精氨酸的肽；添加5′-磷酸以合成RNA；RNA适配体(Que-Gewirth NS，Gene Ther.2007年2月；14(4)：283-91.)；用对特异性RNA适配体对象的解毒剂调节的RNA适配体(参考Oney S，Oligonucleotides.2007年秋；17(3)：265-74.)或任何其组合。

对核酸的一个或多个核苷酸间键合的修饰可包括下述的一种或多种：硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯和酰苯胺磷酸酯，或任何其组合。

锁定核酸(LNA)，通常称为难以接近的RNA，是修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分用连接2′和4′碳的额外的桥(O2′，C4′-亚甲基桥)修饰。桥将核糖“锁定”在通常以A-形式的DNA或RNA出现的3′-内结构构象中。当需要时，LNA核苷可与核酸中DNA或RNA碱基混合。这样的寡聚物是商业上可得的。锁定核糖构象增强碱基堆叠和骨架预组织。这显著增加LNA-修饰核酸的热稳定性(解链温度)和杂交亲和性，另外具有改善的错配识别能力。这些特性使得它们对于基于反义的技术非常有用。此外，LNA抗miR寡核苷酸已经在灵长类中测试，具有令人鼓舞的结果和低毒性。

肽核酸(PNA)是与DNA或RNA相似的人工合成聚合物并且用于生物研究和医学治疗。不知道天然存在PNA。DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖骨架，而PNA的骨架由重复的通过肽键连接的N-(2-氨乙基)-甘氨酸单元组成。各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接至骨架。PNA描述为像肽，N-末端在最(左)位置和C-末端在右边。因为PNA的骨架包含不带电的磷酸基团，PNA/DNA链之间的结合比DNA/DNA链之间的结合更强，原因是没有静电排斥。混合碱基PNA分子是根据碱基对识别的DNA分子的真正模拟物。PNA/PNA结合比PNA/DNA结合更强。

Morpholinos是合成分子，其是重新设计的天然核酸结构的产物。结构上，morpholinos和DNA或RNA之间的不同是尽管Morpholinos具有标准核酸碱基，但是那些碱基结合至6-元吗啉环而不是脱氧核糖/核糖环和非离子二氨基磷酸酯亚基间键合代替阴离子磷酸二酯键。Morpholinos有时称为PMO(二氨基磷酸酯吗啉基寡核苷酸)。6-元吗啉环的化学式为O-(CH₂-CH₂)₂-NH。

间隙体或“间隙寡聚化合物”是RNA-DNA-RNA嵌合寡核苷酸探针，其中DNA的窗口或‘缺口’***称为“翼”的其他正常的或修饰的RNA寡核苷酸。该修饰增加寡核苷酸体内稳定性和探针与靶的相互作用的亲和力，从而可有效使用更短的探针。优选地，翼是2’-O-甲基(OMe)或2’-O-甲氧乙基(MOE)修饰的核糖核苷酸，其避免内部片段(block)的核酸酶降解。而且，形成缺口或翼的核苷酸可通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键连接，因此使得其抵抗核糖核酸酶降解。另外，形成翼的核苷也可通过并入3’甲基膦酸酯键连接的碱基修饰。

词语“RNA干扰”或RNAi是可在真核细胞中存在的序列特异性转录后基因抑制的方法。一般而言，该方法涉及由与该序列同源的双链RNA(dsRNA)诱导的具体序列的mRNA的降解。该dsRNA能够通过III型核糖核酸酶(切酶)将所述RNA转化成siRNA引起基因表达的沉默。siRNA链之一是并入称为RNA-诱导沉默复合物(RISC)的核糖核蛋白复合物。RISC复合物使用该单链RNA识别至少部分与并入RISC的siRNA的RNA链互补的mRNA分子，所述RISC降解或进行抑制它们的翻译。因此，并入RISC的siRNA链称为引导链或反义链。称为瞬时链或有义链的另一条链从siRNA消除并且与靶mRNA部分同源。靶mRNA通过RISC复合物的降解导致所述mRNA和从而编码的相应蛋白质的表达水平的降低。此外，RISC可也引起通过抑制靶mRNA的翻译降低表达。

本发明的缀合物的核酸能够特异性结合靶分子α-突触核蛋白，所述α-突触核蛋白在与神经递质转运蛋白相同的细胞中表达，所述神经递质转运蛋白选自DAT、SERT和NET。核酸与靶分子的结合可经Watson-Crick相互作用进行，其中靶分子是包含与该核酸的序列互补的序列的核酸。可选地，当靶分子是多肽时，本发明的缀合物的核酸可也与所述分子相互作用，在该情况下核酸用作适配体。

根据本发明的缀合物包括的核酸特异性结合α-突触核蛋白mRNA的具体靶区域中的α-突触核蛋白。因此，当本发明的缀合物包括的核酸结合α-突触核蛋白mRNA时，所述核酸靶向α-突触核蛋白mRNA的区域，所述区域选自位于人α-突触核蛋白mRNA的448-465位(SEQ ID NO：4)，499-516位(SEQ ID NO：5)和502-519位(SEQ ID NO：6)，其中编号对应相对于如NCBI检索号NM_000345中定义的α-突触核蛋白序列(SEQ ID NO：7)中第一核苷酸的位置。

术语“沉默”和“抑制表达”、“下调表达”“遏制表达”等等就它们本身指靶基因，本文指至少部分抑制靶基因的表达，如通过减少靶mRNA的量所显示，其可分离自其中靶基因被转录的第一细胞或细胞组并且其已经被处理，使得与大体上和第一细胞或细胞组相同但是还未如此处理的第二细胞或细胞组(对照细胞)比较，靶基因的表达被抑制。抑制的程度通常根据如下表达：

[(对照细胞中的mRNA)-(处理的细胞中的mRNA)*100％]/(对照细胞中的mRNA)

可选地，抑制的程度可根据功能上与靶基因表达关联的参数的减少给出，例如，靶基因编码的蛋白质的量或展示某些表型的细胞的量。原则上，可组成地或通过基因组工程化，和通过任何适合的试验，在任何表达靶的细胞中确定靶基因组沉默。但是，当需要参照以便确定给定的核酸是否在某些程度上抑制靶基因的表达并因此包括在本发明中时，在下面实施例中提供的试验和本领域已知的那些应用作这样的参照。例如，在某些情况下，通过施用双链寡核苷酸，靶基因的表达被抑制至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实施方式中，通过施用双链寡核苷酸，靶基因被抑制至少约60％、70％或80％。在一些实施方式中，通过施用双链寡核苷酸，靶基因被抑制至少约85％、90％或95％。

例如，根据本发明的核酸序列可引入表达靶基因α-突触核蛋白的细胞中。可通过使用RT-PCR、RNA印迹或任何其他标准方法检测细胞中靶基因的mRNA水平。可选地，可使用蛋白质印迹、ELISA或任何其他免疫或非免疫学方法测量由靶mRNA编码的多肽的水平。引入siRNA序列之后，mRNA或由靶基因编码的蛋白质的表达水平的巨大变化表示siRNA序列抑制靶基因表达的效力。在一种具体的实施例中，也在引入siRNA序列之前和之后监测其他基因的表达水平。可选择有效抑制靶基因表达但是不显著影响其他基因表达的siRNA序列。在另一具体的实施例中，多个siRNA或其他RNAi序列可引入相同的靶细胞中。这些siRNA或RNAi序列特异性抑制靶基因表达但是不抑制其他基因的表达。在仍另一具体的实施例中，可使用抑制靶基因和其他一种或多种基因表达的siRNA或其他RNAi序列。

根据本发明，能够特异性结合α-突触核蛋白mRNA的核酸靶向具体α-突触核蛋白mRNA中的区域，所述区域选自位于人α-突触核蛋白mRNA的448-465位(SEQ ID NO：4)、499-516位(SEQ ID NO：5)和502-519位(SEQID NO：6)的区域，其中编号对应相对于NCBI检索号NM_000345中定义的α-突触核蛋白序列(SEQ ID NO：7)中第一核苷酸的位置。

在本发明缀合物的具体实施方式中，区域中能够特异性结合编码α-突触核蛋白的mRNA的核酸选自位于人α-突触核蛋白mRNA的448-465位(SEQ ID NO：4)、499-516位(SEQ ID NO：5)和502-519位(SEQ ID NO：6)的区域，其中编号对应相对于NCBI检索号NM_000345中定义的α-突触核蛋白序列(SEQ ID NO：7)中第一核苷酸的位置是反义寡核苷酸或间隙体。

根据本发明的反义寡核苷酸抑制编码待抑制的α-突触核蛋白活性的核酸的转录和/或翻译。反义核酸可结合潜在的药物靶，其通过常规的碱基互补，或例如，在结合双链DNA的情况下通过双螺旋大沟中的特异性相互作用。一般而言，这些方法指现有技术通常使用的技术范围，并且它们包括基于特异性结合寡核苷酸序列的任何方法。

本发明的反义构建体可例如作为表达质粒分布，其当在细胞中转录时，产生与编码α-突触核蛋白的细胞mRNA至少一个独特部分互补的RNA。可选地，反义构建体是离体产生的寡核苷酸探针，当引入细胞时，其产生与mRNA和/或靶核酸基因序列杂交的基因表达抑制。这样的寡核苷酸探针优选地修饰抵抗内源核酸酶例如外切核酸酶和/或内切核酸酶的寡核苷酸并且所以在体内稳定。用作反义寡核苷酸的核酸分子的例子是氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基膦酸酯的DNA类似物(也见美国专利号5176996、5264564和5256775)。另外，用于构建用于反义疗法的寡聚物的一般方法已经在例如Van der Krol等，BioTechniques 6：958-976，1988；和Stein等，Cancer Res 48：2659-2668，1988中论述。

优选地，首先进行体外研究，以量化反义寡核苷酸抑制基因表达的能力。优选地，这些研究使用区分反义基因抑制和寡核苷酸的非特异性生物作用的对照。也优选地，这些研究比较靶RNA或蛋白质的水平与RNA或蛋白质内部对照的水平。使用反义寡核苷酸获得的结果可与使用对照寡核苷酸获得的那些比较。优选地，对照寡核苷酸是大概与待测试的寡核苷酸相同的长度并且寡核苷酸序列与反义序列的差异不大于视为防止与靶序列特异性杂交所需的。

反义寡核苷酸可以是单链或双链DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰形式。寡核苷酸可在碱基基团、糖基团或磷酸骨架中修饰，例如，从而改善分子的稳定性、其杂交能力等。寡核苷酸可包括其他结合基团，比如肽(例如，引导它们至宿主细胞的受体)或利于运输通过细胞膜的试剂(见，例如，Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6553-6556，1989；Lemaitre等，Proc.Natl.Acad.Sci.84：648-652，1987；PCT公开号WO88/09810)或血脑屏障(见例如PCT公开号WO 89/10134)、嵌入试剂(见例如Zon，Pharm.Res.5：539-549，1988)。为了该目的，寡核苷酸可缀合至另一分子，例如肽、传输试剂、杂交触发的切割试剂等。

反义寡核苷酸可包括至少一组修饰的碱基。反义寡核苷酸也可包括至少修饰的糖基团，其选自但不限于***糖、2-氟***糖、木酮糖和己糖。反义寡核苷酸也可包含与中性肽类似的骨架。这样的分子称为肽核酸(PNA)寡聚物并且描述在例如Perry-O’Keefe等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：14670，1996，和Eglom等，Nature 365：566，1993中。在又另一实施方式中，反义寡核苷酸包括至少一种修饰的磷酸骨架。在又另一实施方式中，反义寡核苷酸是α-端基异构体寡核苷酸。

尽管可使用与靶mRNA序列的编码区域互补的反义寡核苷酸，但是也可使用与转录非翻译区域互补的那些。

在一些情况下，可能难以达到足够的细胞内反义浓度来抑制内源mRNA翻译。所以，优选的方法使用重组DNA构建体，其中反义寡核苷酸处在强pol III或pol II启动子的控制下。可选地，可通过引导与基因调节区域(即，启动子和/或增强子)互补的脱氧核糖核苷酸序列形成三螺旋结构，防止身体中靶细胞的基因转录，降低靶基因表达(总体见Helene，AnticancerDrug Des.6(6)：569-84，1991)。在某些实施方式中，反义寡核苷酸是反义吗啉。

间隙体是RNA-DNA-RNA嵌合寡核苷酸探针，其中DNA的窗口或‘缺口’***称为“翼”的另外正常的或修饰的RNA寡核苷酸中。优选地，翼是2’-O-甲基(OMe)或2’-O-甲氧乙基(MOE)修饰的核糖核苷酸，其避免内部片段的核酸酶降解。更优选地，翼是2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸。而且，形成缺口或翼的核苷酸可通过磷酸二酯键或通过硫代磷酸酯键连接，因此使得其抵抗核糖核酸酶降解。另外，形成翼的核苷酸也可通过合并3’甲基膦酸酯键连接的碱基修饰。

在根据本发明的缀合物的具体优选的实施方式中，区域中能够特异性结合编码α-突触核蛋白的mRNA的核酸选自位于人α-突触核蛋白mRNA的448-465位(SEQ ID NO：4)、499-516位(SEQ ID NO：5)和502-519位(SEQID NO：6)的区域，其中编号对应相对于NCBI检索号NM_000345中定义的α-突触核蛋白序列(SEQ ID NO：7)中第一核苷酸的位置，是包括4个2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸片段为侧翼的10个脱氧核苷酸的中间片段的间隙体。

在更优选的实施方式中，间隙体由选自下述的序列组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。

SEQ ID NO 1：cuccAACATTTGTCacuu (ID#1232)

SEQ ID NO 2：cuccCTCCACTGTCuucu (ID#1233)

SEQ ID NO 3：cugcTCCCTCCACTgucu (ID#1234)

在本发明的缀合物的可选的实施方式中，区域中能够特异性结合编码α-突触核蛋白的mRNA的核酸选自位于人α-突触核蛋白mRNA的448-465位(SEQ ID NO：4)、499-516位(SEQ ID NO：5)和502-519位(SEQ ID NO：6)的区域，其中编号对应相对于NCBI检索号NM_000345中定义的α-突触核蛋白序列(SEQ ID NO：7)中第一核苷酸的位置。尤其，干扰RNA选自小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)或微RNA(miRNA)。

术语小干扰RNA(“siRNA”)指诱导RNA干扰途径的小抑制RNA双链体。这些分子的长度可能不同(一般18-30个碱基对)并且包含与它们反义链中靶mRNA不同程度的互补。一些并不是所有的siRNA在有义链的和/或反义链的5′或3′端具有未配对的突出碱基。术语“siRNA”包括两个分开链的双链体。如本文所使用，siRNA分子不限于RNA分子，而是进一步包括具有一个或多个化学修饰的核苷的核酸，比如morpholinos。

根据本发明尤其优选的siRNA靶向α-突触核蛋白mRNA中的区域，所述区域位于499-517位，其中编号对应相对于α-突触核蛋白序列中第一核苷酸的位置，如NCBI检索号NM_000345中所限定。该siRNA的序列为：

siRNA 499-517有义链：agaagacaguggagggagcTT(SEQ ID NO：8)

siRNA 499-517反义链：gcucccuccacugucuucuTT(SEQ ID NO：9)

如本文所使用，术语“shRNA”或“短发夹RNA”指其中两条链通过一条链的3′端和各自另一条链的5′端之间不间断的核苷链连接以形成双链体结构的dsRNA。

术语“微RNA”或“miRNA”指短单链RNA分子，通常长度为约21-23个核苷酸，其能够调节基因表达。miRNA可以是合成的(即，重组的)或天然的。天然miRNA由从DNA转录的基因编码并且由初级转录物(“pri-miRNA”)加工成短茎-环结构(“pre-miRNA”)，和最终成为成熟miRNA。成熟miRNA分子与一个或多个mRNA分子部分互补，并且经与RNA干扰相似的方法，或通过抑制mRNA的翻译下调基因表达。

在另一种实施方式中，本发明的缀合物的核酸是miRNA，其能够特异性沉默α-突触核蛋白mRNA。适合的α-突触核蛋白特异性miRNA包括但不限于miR-7(见Proc.Natl.Acad.Si.USA，2009，106：13052-13057)和miR-153(见J Biol Chem 2010 285(17)：12726-12734)。人miRNA 7-1序列位于NCBI中，检索号为NR_029605(SEQ ID NO：10)，人miRNA 7-2的检索号为NR_029606(SEQ ID NO：11)和人miRNA 7-3的检索号为NR_029607(SEQID NO：12)。人miRNA 153-1位于NCBI中，检索号为NR_029688(SEQ IDNO：13)和miRNA 153-2的检索号为NR_029689(SEQ ID NO：14)。

根据本发明的miR-7序列如下：

UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUG(SEQ ID NO：15)。

根据本发明的miR-153序列如下：

UUGCAUAGUCACAAAAGUGAUC(SEQ ID NO：16)。

成对比对两条给定核酸序列的方法是本领域技术人员广泛熟知的并且可通过BLASTN型标准算法使用默认参数进行[BLAST手册，Altschul，S.，等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894，Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)]。比对多条核酸序列的方法可使用CLUSTALW型标准算法使用默认参数进行(Thompson JD等，Nucleic Acids Res，1994，22：4673-4680)。

当本发明的缀合物的干扰RNA是双链干扰RNA时，根据本发明的缀合物可包括一种选择性试剂或两种选择性试剂。在具体的实施方式中，第一选择性试剂和第二选择性试剂是相同的选择性试剂。在可选的实施方式中，第一选择性试剂不同于第二选择性试剂。本发明的缀合物的第二选择性试剂特异性结合一种或多种神经递质转运蛋白，所述神经递质转运蛋白选自多巴胺转运蛋白(DAT)、血清素转运蛋白(SERT)或去甲肾上腺素转运蛋白(NET)，如先前所描述。当根据本发明的缀合物包括双链干扰RNA和一种选择性试剂时，选择性试剂可缀合至干扰RNA有义链的5’端或至干扰RNA的反义链的5’。当根据本发明的缀合物包括双链干扰RNA和两种选择性试剂时，第一选择性试剂被缀合至干扰RNA有义链的5’端和第二选择性试剂被缀合至干扰RNA反义链的5’。

在具体的实施方式中，根据本发明的缀合物包括干扰RNA、第一选择性试剂和第二选择性试剂。在更具体的实施方式中，缀合物的第二选择性试剂连接至与第一选择性试剂连接的多核苷酸(干扰RNA)的相对端。在具体的实施方式中，缀合物的第二选择性试剂连接至与连接至第一选择性试剂的多核苷酸互补的一个多核苷酸端。在具体的实施方式中，缀合物的第二选择性试剂借助于连接至所述端的多官能接头被连接至连接第一选择性试剂的多核苷酸的相同端。

A.3.本发明缀合物的接头区域

核酸和选择性试剂可直接偶联。但是，优选两个部分通过连接基团连接。

本文使用的术语“连接基团”、“接头”、“连接基团”和其语法等价物指连接化合物两个部分的有机部分。选择性试剂可连接至任何核酸中的有义或反义核苷酸，但是其可优选地通过3′末端核苷酸和/或5′末端核苷酸偶联。内部缀合物可直接或间接通过接头在核糖基团的2′位置处附接至核苷酸，或附接至另一适合的位置。

在所述核酸是双链核酸的情况下，缀合物可连接至有义3′末端核苷酸、有义5′末端核苷酸、反义3′末端核苷酸和/或反义5′末端核苷酸。

尽管不希望被定义或惯例限制，但是在本申请中，通过对代表连接缀合物部分与接头的原子和与寡核苷酸相关联的接头通过其连接至寡核苷酸的末端磷酸部分氧原子之间最短距离的原子数量进行计数描述接头的长度。在接头包括一个或多个环结构的情况下，对围绕代表最短路径的环的原子计数是优选的。

在本发明中使用的适合的接头基团包括但不限于修饰的或未修饰的核苷酸、核苷、聚合物、糖、碳水化合物、聚亚烷基类(polyalkylenes)比如聚乙二醇和聚丙二醇、多元醇、聚丙烯、乙烯和丙二醇的混合物、聚烷基胺，聚胺比如聚赖氨酸和牙精胺、聚酯比如聚(丙烯酸乙酯)、聚磷酸二酯、脂肪族类和亚烷基类。而且，基于ω-氨基-1，3-二醇、ω-氨基-1，2-二醇、羟基脯氨醇、ω-氨基-烷醇、二乙醇胺、ω-羟基-1，3-二醇、ω-羟基-1，2-二醇、ω-硫代-1，3-二醇、ω-硫代-1，2-二醇、ω-羧基-1，3-二醇、ω-羧基-1，2-二醇、共羟基-烷醇、ω-硫代-烷醇、ω-羧基-烷醇、官能化的低聚乙二醇、烯丙基胺、丙烯酸、烯丙基醇、炔丙基胺、炔丙基醇和更多的接头/接头化学成分可在该背景下使用，以产生适合长度的接头。

接头也可赋予寡核苷酸缀合物其他期望的特性，改善的水性溶解度、缀合物部分和寡核苷酸之间分开的最佳距离、挠性(或其缺失)、特定的定向、支化等等。

优选地，所述连接基团具有下述结构

其中

m、n和p选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13，

其中m+n+p的和是选自7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18的整数

其中k是0或1。

在优选的实施方式中，p是5，n是2，k是1和m是6，给出具有下述结构的接头：

在另一优选的实施方式中，p是5，n和k是0和m是6，给出具有下述结构的接头：

在具体的实施方式中，接头包括用于选择性试剂的多于一个偶联。在优选的实施方式中，接头是二价或三价接头，即分别可偶联2个或3个分子的选择性试剂。

在多于一个分子的选择性试剂通过接头被偶联至核酸的情况下，所述分子可表示相同或不同的选择性试剂。

在具体的实施方式中，二价或三价接头具有下述式：

其中

m、m’、m”、n、n’、n”、p、p’、p”、r、r’、r”、s、s’、s”、t和u独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13；

k、k’、k”和v独立地选自0和1；和

X¹、X²和X³独立地选自CH₂、O、S、NH、CO、C(O)O和C(O)NH。

取决于上面提到的基团的值，支化接头可以是对称的或不对称的。

在具体的实施方式中，接头是二价的接头，如上面所显示，其中p和p’是5，n和n’是2，k和k’是1并且m和m’是6。在具体的实施方式中，接头是二价的接头，其中p和p’是5，n、n’、k和k’是0并且m和m’是6。

在具体的实施方式中，接头是二价接头，如上面所显示，其中r和r’是4，s和s’是1，t和v是0并且X¹和X²表示C(O)NH。在另一种实施方式中，接头是二价接头，其中r是2，r’是0，s是1，s’是0，t和V是0并且X¹和X²表示CH₂。

在具体的实施方式中，接头是二价的接头，其中p和p’是5，n和n’是2，k和k’是1，m和m’是6，r和r’是4，s和s’是1，t和v是0并且X¹和X²表示C(O)NH。

在另一种实施方式中，接头是二价的接头，其中p和p’是5，n和n’是2，k和k’是1，m和m’是6，r是2，r’是0，s是1，s’是0，t和v是0并且X¹和X²表示CH₂。

在另一种实施方式中，接头是二价的接头，其中p和p’是5，n、n’、k和k’是0和m和m’是6，r和r’是4，s和s’是1，t和v是0亲并且X¹和X²表示C(O)NH。

在另一种实施方式中，接头是二价的接头，其中p和p’是5，n、n’、k和k’是0和m和m’是6，r是2，r’是0，s是1，s’是0，t和v是0并且X¹和X²表示CH₂。

在具体的实施方式中，接头是三价接头，如上面所显示，其中p、p’和p”是5，n、n’和n”是2，k、k’和k”是1并且m、m’和m”是6。在具体的实施方式中，接头是三价接头其中p、p’和p”是5，n、n’、n”、k、k’和k”是0并且m、m’和m”是6。

在具体的实施方式中，如上面所显示，接头是三价接头，其中r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，v是0和X¹、X²和X³表示O。

在另一种实施方式中，接头是三价接头，其中r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，u是3，v是1和X¹，X²和X³表示O。

在具体的实施方式中，接头是三价接头，其中p、p’和p”是5，n、n’和n”是2，k、k’和k”是1，m、m’和m”是6，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，v是0和X¹，X²和X³表示O。

在另一种实施方式中，接头是三价接头，其中p、p’和p”是5，n、n’和n”是2，k、k’和k”是1，m、m’和m”是6，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，u是3，v是1和X¹，X²和X³表示O。

在另一种实施方式中，接头是三价接头，其中p、p’和p”是5，n、n’、n”、k、k’和k”是0，m、m’和m”是6，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，v是0并且X¹、X²和X³表示O。

在另一种实施方式中，接头是三价接头，其中p、p’和p”是5，n、n’、n”、k、k’和k”是0，m、m’和m”是6，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，u是3，v是1并且X¹，X²和X³表示O。

根据本发明具体优选的连接基团具有下述结构：

-L1_d-[(A-L2)_a-(B-L3)_b]_c-

其中：

A和B表示单体单元，其独立地选自单糖、烷基链和(C₂-C₂₀)亚烷基二醇；

a和b是范围从0至50的整数；

c是范围从0和30的整数；

L1、L2和L3是独立地选自磷酸二酯、硫代磷酸酯、氨基甲酸酯、甲基膦酸酯、胍盐、氨基磺酸酯、硫酰胺、缩甲乙醛、硫代缩甲乙醛、砜、酰胺和其混合物的连接化合物；和

d是0或1。

在具体的实施方式中，连接基团具有下述结构：

-L1_d-[(A-L2)_a-(B-L3)_b]_c-

其中b和d是0，c是1，A是烷基链和L2是磷酸二酯键。

A.4.本发明的缀合物的靶向部分

本发明的缀合物的另一修饰包括将一个或多个部分或缀合物化学连接至核酸或保护基团，其增强核酸的活性、细胞分布或细胞吸收。这样的部分包括但不限于脂质部分比如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，199，86，6553-6556)，胆酸(Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1994 4 1053-1060)、硫醚，例如，己基(beryl)-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765-2770)、巯基胆固醇(Oberhauser等，Nucl.AcidsRes.，1992，20，533-538)、脂族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J，1991，10，1111-1118；Kabanov等，FEBSLett.，1990，259，327-330；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75，49-54)、磷脂，例如，二-十六基-rac-丙三醇或三乙基-铵1，2-二-O-十六基-rac-丙三醇-3-H磷酸盐(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea等，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides and Nucleotides，1995，14，969-973)，或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237)，或硬脂胺或己基氨基-羰基氧胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923-937)。

可选地，能够增强细胞分布的部分可以是低分子量化合物或多肽，其通过使用所述生物屏障中存在的特异性转运蛋白使用受体介导的内吞作用，能够特异性转移横跨生物屏障。具有更大数量的受体特异性配体的各种各样的吸收受体和载体是本领域已知的。根据本发明使用的介导内吞作用和/或转胞吞作用的用于受体的优选的配体包括例如用于或特异性结合下述的配体：硫胺素转运蛋白、叶酸受体、维生素B 12受体、脱唾液酸糖蛋白受体、α(2，3)-唾液酸糖蛋白受体(例如，FC5和FC44纳米抗体由llama单结构域抗体(sdAbs)作为受体特异性配体组成)、运铁蛋白-1和-2受体、清除剂受体(A或B类，I、II或III型，或CD36或CD163)、低密度脂蛋白(LDL)受体、LDL相关蛋白1受体(LRP1，B型)、LRP2受体(也称为巨蛋白或糖蛋白330)，白喉毒素受体(DTR，其是肝素-结合表皮生长因子样生长因子的膜结合前体(HB-EGF))、胰岛素受体、***(IGF)受体、瘦蛋白受体、物质P受体、谷胱甘肽受体、谷氨酸受体和甘露糖6-磷酸受体。

为了根据本发明使用而结合这些受体的优选的配体包括例如选自下述的配体：脂蛋白脂肪酶(LPL)、α2-巨球蛋白(α2M)、受体相关的蛋白质(RAP)、乳铁蛋白、去氨普酶、组织和尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂(tPA/uPA)、血纤维蛋白溶酶原活化剂抑制剂(PAI-I)、tPA/uPA：PAI-1络合物、黑素转铁蛋白(或P97)、血小板反应蛋白1和2、肝脂肪酶、因子Vlla/组织因子途径抑制剂(TFPI)、因子VIIIa、因子IXa、Abetal-40、淀粉样蛋白-β前体蛋白质(APP)、Cl抑制剂、补体C3、载脂蛋白E(apoE)、假单胞菌外毒素A、CRM66、HIV-I Tat蛋白质、鼻病毒、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、MMP-13(胶原酶-3)、鞘脂活化剂蛋白质(SAP)、妊娠带蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、αl-抗胰蛋白酶、热休克蛋白96(HSP-96)、血小板衍生生长因子(PDGF)、载脂蛋白J(apoJ，或成簇蛋白)、与apoJ和apoE结合的ABETA、牛胰蛋白酶抑制剂、血管-pepl、极低密度脂蛋白(VLDL)、运铁蛋白、胰岛素、瘦蛋白、***、表皮生长因子、凝集素、拟肽和/或对所述受体特异的人源化的单克隆抗体或肽(例如，结合人运铁蛋白受体的序列HAIYPRH(SEQ ID NO：17)和THRPPMWSPVWP(SEQ ID NO：18)，或抗人运铁蛋白受体(TfR)单克隆抗体A24)、血红蛋白、白喉毒素多肽链的无毒部分、所有或部分白喉毒素B链(包括DTB-组氨酸(如Spilsberg等，2005，Toxicon.，46(8)：900-6)描述)、白喉毒素CRM197的所有或部分无毒突变体、脱脂载脂蛋白B、脱脂载脂蛋白E(例如，结合涂布在纳米颗粒上的polysorb-80之后)、维生素D-结合蛋白、维生素A/视黄醇-结合蛋白、维生素B12/钴胺素血浆载体蛋白、谷胱甘肽和钴胺传递蛋白-B 12。

在具体的实施方式中，本发明的缀合物进一步包括促进缀合物横跨生物膜运输的基团。优选地，基团是两性的。示例性试剂包括但不限于穿透子(penetratin)、包括氨基酸48-60的Tat蛋白质的片段、基于信号序列的肽、PVEC、运送子(transportan)、两性分子模型肽、Arg9、细菌细胞壁渗透肽、LL-37、天蚕素P1、α-防卫蛋白、β-防卫蛋白、bactenectin、PR-39和indolicidin。如果试剂是肽，其可被修饰，包括肽基模拟物、反转异构体、非肽或假肽键，和D-氨基酸的使用。螺旋试剂优选地为α-螺旋试剂，其优选地具有亲脂和疏脂相。

配体可以是肽或拟肽。拟肽(本文也称为寡肽模拟物)是能够折叠成与天然肽相似的限定三维结构的分子。肽或拟肽部分的长度可为约5-50个氨基酸，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长(例如，见表4)。

在本发明另一具体实施方式中，本发明的缀合物进一步包括内体裂解配体。内体裂解配体促进内体的裂解和/或本发明组合物或其组分从内体运输至细胞的细胞质。内体裂解配体可以是多阴离子肽或拟肽，其显示pH-依赖性膜活性和融合性(fusogenicity)。在某些实施方式中，内体裂解配体假设其在内体pH下的活性构象。“活性”构象是其中内体裂解配体促进内体裂解和/或本发明的组合物或其组分从内体运输至细胞的细胞质的构象。示例性内体裂解配体包括GAL4肽(Subbarao等，Biochemistry，1987，26：2964-2972)、EAL肽(Vogel等，J.Am.Chem.Soc.，1996，118：1581-1586)，和它们的衍生物(Turk等，Biochem.Biophys.Acta，2002，1559：56-68)、INF-7肽、Inf HA-2肽、diINF-7肽、diINF3肽、GLF肽、GALA-INF3肽和INF-5肽。在某些实施方式中，内体裂解组分可包含化学基团(例如，氨基酸)，其响应pH的变化而经历电荷或质子化的改变。内体裂解组分可以是直链的或支化的。

A.5.本发明的缀合物的保护基团

在它们运输通过生物体的不同的流体和隔间期间，本发明的缀合物的核酸形成部分必须预防降解因素，比如核酸酶(内切核酸酶/外切核酸酶)。为了该目的，寡核苷酸设计为抵抗酶消化和改善寡核苷酸的体内稳定性和生物利用度。优选地，通过防止核酸酶介导的降解的基团的存在，化学修饰核酸。

为了本发明的目的，“帽结构”或“保护基团”应理解为意思是已经在寡核苷酸的每个末端引入的化学修饰。5′帽的非限制性例子包括反向脱碱基残基(部分)，4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4′-硫代核苷酸，碳环型核苷酸；1，5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯连接；苏型呋喃戊糖基核苷酸；非环状3′，4′-闭联核苷酸；非环状3，4-二羟基丁基核苷酸；非环状3，5-二羟基戊基核苷酸、3′-3′-反向核苷酸部分；3′-3′-反向脱碱基部分；3′-2′-反向核苷酸部分；3′-2′-脱碱基部分；1，4-丁二醇磷酸；3′-氨基磷酸酯；磷酸己酯；氨基己基磷酸；3′-磷酸；3′-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥连或非桥连甲基膦酸酯部分。细节描述在WO97/26270中，其通过引用并入本文。3′-帽包括，例如，4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸：4′-硫代核苷酸、碳环型核苷酸；5′-氨基-烷基磷酸；1，3-二氨基-2-丙基磷酸、3-氨基丙基磷酸；6-氨基己基磷酸；1，2-氨基十二烷基磷酸；羟丙基磷酸；1，5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏型呋喃戊糖基核苷酸；非环状3′，4′-闭联核苷酸；3，4-二羟基丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸，5′-5′-反向核苷酸部分；5′-5′-反向脱碱基部分；5′-氨基磷酸酯；5′-硫代磷酸酯；1，4-丁二醇磷酸；5′-氨基；桥连和/或非桥连5′-氨基磷酸酯，硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯，桥连或非桥连甲基膦酸酯和5′-巯基部分。也见Beaucage和Iyer，1993，Tetrahedron 49，1925；其内容通过引用并入本文。在具体的实施方式中，保护基团包括反向核苷酸部分。在具体的实施方式中，保护基团位于寡核苷酸的3’端。包含末端5’-5’或3’-3’键的反义寡核苷酸高度抵抗外切核酸酶降解。反向核苷酸，比如反向dT可并入寡核苷酸的3’端，产生3′-3′连接，其抑制3’外切核酸酶的降解和通过DNA聚合酶的延伸二者。

在具体的实施方式中，反向核苷酸并入不与选择性试剂连接的本发明的核酸的一端或两端。在具体的实施方式中，反向核苷酸是反向dT。在具体优选的实施方式中，保护基团位于不与选择性试剂连接的本发明核酸的一端或两端，优选地在3’端，和包括反向核苷酸部分，更尤其包括反向dT。

在优选的实施方式中，连接至本发明缀合物的核酸序列的帽结构具有下述通式结构：

M-L1_d-[(A-L2)_a-(B-L3)_b]_c-

其中：

M是H，如上定义的脂质部分或靶向基团；

A和B表示独立地选自单糖和(C₂-C₂₀)亚烷基二醇的单体单元；

a和b是范围从0至50的整数；

c是范围从0和30的整数；

L1、L2和L3是独立地选自磷酸二酯、硫代磷酸酯、氨基甲酸酯、甲基膦酸酯、胍盐、氨基磺酸酯、硫酰胺、缩甲乙醛、硫代缩甲乙醛、砜、酰胺和其混合物的连接化合物；

d是0或1。

如本文所使用，脂质部分指具有亲脂或两性特性的有机化合物的基团，包括但不限于脂肪、脂肪油、香精油、蜡、类固醇类、固醇类、磷脂、糖脂、硫脂、氨基脂、色脂(lipochromes)和脂肪酸，术语“脂质”包括天然存在的和合成产生的脂质二者。脂质部分通常增加寡核苷酸的亲脂特性并且利于体内细胞内吸收寡核苷酸构建体。可使用的适合的脂质包括脂肪酸；脂肪；油；蜡；胆固醇；固醇类；脂肪可溶性维生素，比如维生素A、D、E和K；单甘酯；甘油二酯和磷脂。优选的脂肪酸是选自下述的那些：月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、棕榈酸(C16)、硬脂酸(C18)、二十二烷酸(C22)，和石胆酸和油胺的混合物(lithocholic-oleyamine，C43)。本领域技术人员可根据考虑靶组织、靶细胞、施用路径、期望采用的寡核苷酸等的条件选择脂质。

如本文所使用和本领域熟知的术语“单糖”指简单形式的糖，其由不能进一步分解成更小糖类组成片段或部分的单个糖类单元组成。用于该缀合基团的优选糖部分选自呋喃糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、修饰的单糖、唾液酸和赤藓糖和其混合物。单糖可为其线性或环状形式(半缩醛环状异构体)。呋喃糖是包含基于五元呋喃环的任何简单的糖，比如D-核糖或果糖残基(D-(-)-呋喃果糖)。利用单糖的组合，可获得多个糖结构。果糖寡聚体(FOS)和半乳糖寡糖(GOS)是尤其感兴趣的组合，以及二糖蔗糖或乳糖；或多糖菊粉、糊精、淀粉或糖原。

如本文所使用，术语“亚烷基二醇”、“聚(亚烷基二醇)”、“烯化氧”，包括具有通式-O-[(CH₂)_m-O-]_n-的聚醚聚合物家族，其中m表示每个亚烷基二醇单元中存在的亚甲基基团的数量，和n表示重复单元的数量，并且所以表示聚合物的尺寸或长度。该术语包括但不限于乙二醇、丙二醇、二亚烷基二醇(例如，二甘醇)、三亚烷基二醇(例如，三甘醇)，和乙二醇比如上述乙二醇相应的单-和二-烷基醚，其中烷基醚是具有1至6个碳原子的低级烷基醚(例如，甲醚、***、丙醚等等)。

在另一种实施方式中，其具有(C₂-C₂₀)亚烷基二醇单体单元，其可以是2至20个碳原子的任何直链或支化分子，或，取决于a和b的值，具有数个(C₂-C₂₀)亚烷基二醇单体单元的聚亚烷基二醇聚合物。优选地，亚烷基二醇基团选自C₁₆-C₂₀亚烷基二醇。仍更优选地，亚烷基二醇基团是C₁₈亚烷基二醇。

在具体的实施方式中，本发明的缀合物具有帽结构，其中b和d是0，c是1，A是烷基链和L2是磷酸二酯键。

适合本发明的缀合物的保护基团包括但不限于：

M-L1_d-[(A-L2)_a-(B-L3)_b]_c-

-PEG+糖，对应于上式中M是H，d是0，A是PEG，B是糖，a和b每个是1和L1和L2是磷酸二酯键；

-PEG+(糖)2，对应于上式中A是PEG，B是糖，a是1，b是2，M是H和d是0和L1和L2是磷酸二酯键；

-(PEG)2+糖，对应于上式中A是PEG，B是糖，a是2，b是1，M是H和d是0和L1和L2是磷酸二酯键；

-(PEG)3+糖，对应于上式中A是PEG，B是糖，a是3，b是1，M是H和d是0和L1和L2是磷酸二酯键；

-(PEG)5+糖对应于上式中A是PEG，B是糖，a是5，b是1，M是H和d是0和L1和L2是磷酸二酯键

术语“PEG”和“糖”基本上如上述所使用并且包括呋喃糖作为糖并且选自C3、C9和C18间隔子的PEG。

本发明也考虑缀合物进一步包括与不连接至选择性试剂的多核苷酸的一端或两端连接的保护基团。

B.本发明的缀合物的结构

根据本发明的缀合物的不同组分可以以不同的方式被布置，其形成本发明的部分。因此，选择性试剂可被偶联至核酸的5’端和/或3’端。优选地，选择性试剂被偶联至核酸的5’端。而且，核酸和选择性试剂可直接连接或可通过接头连接。类似地，接头可被偶联至核酸的5’端和/或至3’端。优选地，接头被偶联至核酸的5’端。因此，其中本发明的所述核酸包含单核酸链，可能的布置为：

-包括连接至5’端的选择性试剂的核酸，

-包括连接至3’端的选择性试剂的核酸，

-包括连接至5’端的选择性试剂和连接至3’端的保护基团的核酸，和

-包括连接至5’端的保护基团和连接至3’端的选择性试剂的核酸。

-包括第一和第二选择性试剂的修饰的核酸，所述第一和第二选择性试剂相同或不同，这两种选择性试剂被连接至双官能接头的两端，所述双官能接头被连接至核酸的5’端，

-包括第一和第二选择性试剂的修饰的核酸，所述第一和第二选择性试剂相同或不同，这两种选择性试剂被连接至双官能接头的两端，所述双官能接头被连接至核酸的3’端，

-包括四种选择性试剂的修饰的核酸，所述选择性试剂相同或不同，其中两种选择性试剂被连接至第一双官能接头的两端，所述第一双官能接头被连接至核酸的5’端，并且其中两种选择性试剂被连接至第二双官能接头的两端，所述第二双官能接头被连接至核酸的3’端。

在优选的实施方式中，其中所述缀合物包含单核酸链和两种选择性试剂，所述第一选择性试剂和所述第二选择性试剂二者都是三重再摄取抑制剂(优选地茚达曲林)，并且被连接至核酸的5’端和3’端。

在另一优选的实施方式中，其中所述缀合物包含单核酸链和两种选择性试剂，第一选择性试剂是血清素再摄取抑制剂(SRI)(优选地舍曲林)，和第二选择性试剂是去甲肾上腺素多巴胺双重再摄取抑制剂(NDRI)，并且这两种选择性试剂被连接至核酸的5’端。在更优选的实施方式中，SRI被连接至核酸的5’端和NDRI被连接至核酸的3’端。在另一优选的实施方式中，SRI被连接至核酸的3’端和NDRI被连接至核酸的5’端。

在另一种实施方式中，核酸可包含借助于多官能接头连接至核酸分子一端的多于一个配体。因此，在另一种实施方式中，核酸可包含连接至5’端的双官能接头，其中双官能接头的每一端被偶联至三重再摄取抑制剂(优选地茚达曲林)。在另一种实施方式中，核酸可包含连接至5’端的双官能接头，其中双官能接头的第一端被偶联至SRI(优选地血清素)，并且双官能接头的第二端被连接至NDRI。

在另一种实施方式中，核酸包含连接至5’端或3’端的三官能接头，其中三官能接头的每一端被连接至配体。在优选的实施方式中，三官能接头的三端被连接至三重再摄取抑制剂，其可以相同或不同。在优选的实施方式中，核酸分子被连接至三个茚达曲林分子。

另外，本发明的缀合物可包含调控靶分子的表达的多个核酸链。例如，本发明的构建体可包含至多五个不同的核酸，其通过在给定靶分子的不同区域处靶向的磷酸二酯串联连接。

而且，在其中所述核酸是双链核酸的那些情况中，选择性试剂可被偶联至有义链和/或反义链，并且可直接偶联或通过接头基团连接。

在它们运输通过生物体的不同的流体和隔间期间，形成本发明缀合物的部分的核酸必须预防降解因素，比如核酸酶(内切核酸酶/外切核酸酶)。为了该目的，寡核苷酸设计为抵抗酶消化和改善寡核苷酸的体内稳定性和生物利用度。细胞外切核酸酶使用游离的5’端作为靶。因此，在单链核酸的情况下，当偶联至核酸的5’端时，选择性试剂可作为稳定部分。但是，在包括双链核酸或单链核酸的缀合物的情况中，其中选择性试剂被连接至3’端，缀合物可进一步包括稳定部分或帽结构，其通常为通过外切核酸酶的活性阻止核酸降解的基团。在双链核酸的情况中，存在下述可能的布置：

[1]选择性试剂被连接至一条链的5’端，在该情况下它用于连接帽结构至相对链的5’端。另外，帽结构也可存在于一个或两个3’端中。

[2]选择性试剂被连接至一条链的3’端，在该情况下它用于连接帽结构至有义链和反义链的5’端。另外，帽结构可在游离3’端处存在。

[3]包括多于一种选择性试剂的缀合物在其中的情况中可以相同或不同，选择性试剂被偶联至有义链和反义链的5’端。任选地，帽结构可被偶联至一个或两个游离3’端。

在优选的实施方式中，核酸是双链RNA，其中选择性试剂被连接至反义链的5’端和保护基团被连接至有义链的5’端。在仍更优选的实施方式中，保护基团具有下述结构

M-L1_d-[(A-L2)_a-(B-L3)_b]_c-

其中M是H，d是0，A是聚乙二醇的C18间隔区(spacer)，B是呋喃糖，a是2，b和c是1，和L2和L3是磷酸二酯键。

在另一种实施方式中，核酸可包含借助于多官能接头连接至一条核酸链的一端的多于一个配体。优选地，配体被连接至有义链或反义链的5’端。因此，在另一种实施方式中，核酸可包含连接至有义链的5’端的双官能接头，其中双官能接头的每一端被偶联至三重再摄取抑制剂(优选地茚达曲林)。在另一种实施方式中，核酸可包含连接至有义链的5’端的双官能接头，其中双官能接头的第一端被偶联至SRI(优选地血清素)和双官能接头的第二端被连接至NDRI。在另一种实施方式中，核酸可包含连接至反义链的5’端的双官能接头，其中双官能接头的每一端被偶联至三重再摄取抑制剂(优选地茚达曲林)。在另一种实施方式中，核酸可包含连接至反义链的5’端的双官能接头，其中双官能接头的第一端被偶联至SRI(优选地血清素)和双官能接头的第二端被连接至NDRI。

在另一种实施方式中，核酸包含连接至有义链、反义链或二者的5’端或3’端的三官能接头，其中三官能接头的每一端被连接至配体。在优选的实施方式中，三官能接头的三端被连接至三重再摄取抑制剂，其可以相同或不同。在优选的实施方式中，有义核酸链的5’端被连接至三个茚达曲林分子。

本发明的缀合物包括

(ii)至少一种核酸，其能够特异性结合与神经递质转运蛋白在相同的细胞中表达的靶分子，其中所述靶分子是α-突触核蛋白或编码α-突触核蛋白的mRNA

在更优选的实施方式中，本发明的缀合物具有结构(III)和其药学上可接受的形式

其中

n或m是整数，其每个具有0和6之间的值，包括0和6；

p是具有0和4之间的值的整数，包括0和4；

q是具有0和20之间的值的整数，包括0和20；

在本发明的缀合物的实施方式中，寡核苷酸是反义寡核苷酸或间隙体。在优选的实施方式中，本发明缀合物的间隙体包括4个2’-O甲基修饰的核糖核苷酸的2个片段为侧翼的10个脱氧核苷酸的中间片段。

在根据本发明的缀合物的具体优选的实施方式中，寡核苷酸能够特异性结合区域中编码α-突触核蛋白的mRNA，所述区域选自位于人α-突触核蛋白mRNA的448-465位(SEQ ID NO：4)、499-516位(SEQ ID NO：5)和502-519位(SEQ ID NO：6)的区域，其中编号对应相对于NCBI检索号NM_000345中定义的α-突触核蛋白序列(SEQ ID NO：7)中第一核苷酸的位置。在更优选的实施方式中，间隙体由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的序列组成。

在本发明的缀合物的具体实施方式中，选择性试剂具有结构(II)：

在优选的实施方式中，本发明的缀合物具有下述结构(IV)：

其中寡核苷酸包括能够特异性结合区域中编码α-突触核蛋白的mRNA的核酸，所述区域选自位于人α-突触核蛋白mRNA的448-465位(SEQ IDNO：4)、499-516位(SEQ ID NO：5)和502-519位(SEQ ID NO：6)的区域，其中编号对应相对于NCBI检索号NM_000345中定义的α-突触核蛋白序列(SEQID NO：7)中第一核苷酸的位置。在具体实施方式中，寡核苷酸具有选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的序列。

在仍另一优选的实施方式中，本发明的缀合物包括双链核酸，其中有义链的5’端被偶联至保护基团和反义链的5’端被偶联至选择性试剂，并且其中所述保护基团具有结构：

M-L1_d-[(A-L2)_a-(B-L3)_b]_c-

其中M是H，d是0，A是聚乙二醇的C18间隔区，B是呋喃糖，a是2，b和c是1，和L2和L3是磷酸二酯键。

在本发明的有义链中，保护基团可通过连接化合物连接至寡核苷酸的5’-OH或3’-OH基团。

例如，可能将通常从2个至4个可变数目的式(II)的基团连接至单个寡核苷酸分子，这取决于寡核苷酸是双链或单链，条件是通过5’-OH和/或3’-OH进行连接。还可能将式(I)的若干基团的链连接至寡核苷酸，所述式(I)的基团通过连接化合物比如在分子和/或寡核苷酸之间产生磷酸二酯键的亚磷酰胺衍生物彼此连接。寡核苷酸构建体还可包含连接至寡核苷酸的一端的式(I)的若干基团的链和连接至寡核苷酸的另一端的式(I)的另一基团的链。

本发明的核苷酸构建还可包含多于一种靶向剂，其分布具有在两条寡核苷酸链的5’-OH和3’-OH末端中的所有可能组合或连接至式(I)的基团。而且，如果有多于一种靶向剂，这些可被串联连接至式(I)的基团和/或寡核苷酸。

如果寡核苷酸构建体包含多于一种靶向剂，不同组合是可能的。例如，保护基团可被连接至一条寡核苷酸链的5’-OH或3’-OH末端基团。另一可能的组合包括连接至一条寡核苷酸链的5’-OH基团的药物化合物，和连接至约束至另一条寡核苷酸链的式(I)基团的末端单元的一系列适配体。

C.本发明的药学组合物

发明人已发现本发明的缀合物具有调控通过本发明的缀合物的核酸序列靶向的α-突触核蛋白mRNA的表达的能力。尤其，包括如在NCBU检索号NM_000345中的人α-突触核蛋白mRNA的间隙体靶向区域448-465(SEQ ID NO：4)、499-516(SEQ ID NO：5)和502-519(SEQ ID NO：6)的缀合物可有效诱导在嗅球(BO)、黑质体(SNc/VTA)、中缝背核(DR)中α-突触核蛋白表达的降低(见实施例3和图4)。

因此，本领域技术人员将认识到，本发明的缀合物适合于疾病的治疗，所述疾病可通过存在于本发明的缀合物中的核酸靶向的基因的表达水平即α-突触核蛋白的表达水平的降低获益。因此，在另一方面中，本发明涉及用于药品的根据本发明的缀合物。可选地，本发明涉及根据本发明的缀合物用于药物制造。另外，本发明也涉及包括根据本发明的缀合物和药学上可接受的赋形剂的药学组合物。

适合量的本发明的寡核苷酸构建体可用药学上可接受的赋形剂和/或载体配制以获得药学组合物。包括根据本发明的缀合物的组合物可通过各种路径被递送至对象。示例性路径包括纹状体内、脑室内、鞘内、脑实质内(例如，在纹状体中)、鼻内和眼睛递送。组合物也可例如通过静脉内、皮下或肌肉内注射被全身性地递送，其尤其可用于将缀合物递送至外周神经元。另外，也可能鼻内施用本发明的缀合物，其允许通过非攻击模式的施用全身性施用。另外，心室内施用也可以是适当的。递送的优选路径是直接至脑，例如，进入脑的脑室或下丘脑内，或进入脑的侧面或背部区域。

本发明的药学组合物可包括多种不同的缀合物，其中不同的缀合物包括靶向相同靶分子的不同区域的核酸。因此，药学组合物可包括至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种和更多种不同的缀合物，所述缀合物每种包括不同的核酸。

本领域技术人员熟悉广泛已知和可利用的资源诸如Remington′sPharmaceutical Science(第17版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1985)和Goodman and Gilman′s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics(第8版，Pergamon Press，Elmsford，N.Y.，1990)中讨论的原理和程序，这二者通过引用并入本文。

在本发明的优选的实施方式中，根据标准程序将缀合物配制为适合于递送施用至人类和其他哺乳动物的药学组合物。典型地，用于静脉内或心室内施用的组合物是无菌等渗缓冲水溶液。

必要时，组合物也可包括增溶剂和局部麻醉剂以减轻在注射位点处的任何疼痛。一般而言，该成分单独地或以单位剂量形式混合在一起被提供，例如，作为在指示活性试剂的量的气密密封容器比如安瓿或sachette中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。当要通过输注施用组合物时，它可用包含无菌医药级水或生理盐水的输液瓶分配。当组合物通过注射被施用时，可提供注射用无菌水或生理盐水的安瓿，从而成分可被混合，然后施用。

在除静脉内给药以外的情况中，组合物可包含少量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、凝胶、聚合物、或缓释制剂。组合物可以用传统的粘结剂和载体配制，如本领域已知的。制剂可包括标准载体，比如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、钠糖类、纤维素、碳酸镁等，在药物制剂的制造中具有良好功能的惰性载体。已知各种递送***并且可用于施用本发明的治疗剂，所述治疗剂包括脂质体、微粒、微胶囊等的包装。

在仍另一优选的实施方式中，包含本发明的缀合物的治疗剂可被配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离氨基基团形成的那些，比如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等等的那些，和与游离羧基基团形成的那些，比如源自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因或类似物的那些。

D.本发明的缀合物的治疗性用途

本发明的缀合物可用于治疗可通过敲低细胞中表达神经递质转运蛋白的α-突触核蛋白基因改善的任何疾病，所述神经递质转运蛋白选自DAT、SERT和NET。本领域技术人员将理解，缀合物可用于治疗特征在于细胞中蛋白质α-突触核蛋白的异常表达的疾病(例如，路易体中α-突触核蛋白的积聚)或用于其中α-突触核蛋白蛋白质以正常水平表达但是可通过降低所述靶蛋白质的表达而改善的疾病。

因此，在另一方面中，本发明涉及用于治疗或预防与路易体的沉积相关的疾病的本发明的缀合物，其包括

可选地，本发明涉及根据本发明的缀合物在制造用于治疗与路易体的沉积相关的疾病的药物中的用途。

可选地，本发明涉及在有需要的对象中预防和/或治疗与路易体的沉积相关的疾病的方法，其包括施用至所述对象治疗上有效量的根据本发明的缀合物。

术语“与路易体的沉积相关的疾病”指特征在于α-突触核蛋白代谢不适的病况，其导致形成异常神经α-突触核蛋白包含体。更具体的路易体不适包括帕金森病(PD)、具有路易体的痴呆(DLB)、具有痴呆的PD(PDD)和多***萎缩症。在具体的实施方式中，与路易体的沉积相关的疾病选自帕金森疾病、具有路易体的痴呆和多***萎缩症。

帕金森病(PD)是中枢神经***的退行性病变，其通常损害患者的运动技能、言语和其他功能。帕金森病的症状源自黑质致密区域(SNpc)中显著降低的多巴胺能的细胞活性。这些神经元投射至纹状体并且它们的损失导致调节运动的基底神经节中神经电路的活性的改变，本质上抑制直接途径和激发间接途径。直接途径促进运动和间接途径抑制运动，因此这些细胞的损失导致运动机能减退性运动障碍。多巴胺的缺失导致增加丘脑腹前核的抑制，其发送兴奋性投射至运动皮质，因此导致运动功能减退症。

PD的特征在于SNpc中多巴胺能神经元的进行性损失和存在命名为路易体(LB)的细胞内包含体。神经化学上，PD的特点是线粒体复合物I功能障碍和增加的氧化应激指数。已经为PD提出了数个病原性机制，包括氧化和硝化应激、线粒体功能障碍、蛋白质错折叠和聚集，和细胞凋亡。PD是非常零星的但是一些PD病例已经显示是家族连锁的。鉴定的第一个家族连锁PD基因是α-突触核蛋白(α-syn)，其实际上是所有PD患者中LB的主要成分。对于α-突触核蛋白的正常功能知道较少。α-突触核蛋白可结合脂质，并且在神经元中，与突触前小泡和质膜相关联，可能经由脂膜筏。沉积的病理学形式的α-突触核蛋白聚集并且显示比正常蛋白质更低的溶解度。已经报道了三点突变造成家族PD，而且SNCA基因的复制体和三份复制体造成了PD和路易体疾病。所以，即使没有序列变体，α-突触核蛋白给药可与路易体疾病有因果关系。

具有路易体的痴呆(DLB)也被称为路易体痴呆、弥漫路易体疾病、皮质路易体疾病或路易型的老年痴呆。该疾病与阿尔茨海默氏和帕金森病密切相关并且结构上特征在于存在路易体，其是死后脑组织学可检测的神经元中的α-突触核蛋白团块和泛素蛋白质。

多***萎缩症或MSA是与特定脑区域中神经细胞的退化相关的神经退行性病变。由于细胞退化，患者出现与身体的移动、平衡和其他自主功能相关的问题，比如膀胱控制或血压调节。

在特别优选的实施方式中，心室内或鼻内施用根据本发明的缀合物。

E.本发明的缀合物的合成

本发明的缀合物通常使用有机合成中的标准程序合成。本领域技术人员将认识到，合成的精确步骤将取决于必须被合成的缀合物的精确结构。例如，如果缀合物包括通过其5’端缀合至选择性试剂的单核酸链，那么合成通常通过使氨基-激活的寡核苷酸与活性激活选择性试剂接触进行。

其中缀合物包括双链核酸，然后有义链和反义链使用标准分子生物学程序单独地和体外退火合成。在典型的缀合物中，第一核酸链携带选择性试剂和第二核酸链携带保护基团。在仍更优选的实施方式中，选择性试剂被偶联至第一核酸链的5’端和/或保护基团被连接至第二核酸链的5’端，尽管选择性试剂或保护基团的连接也可在核酸链的3’端进行。

可如下进行缀合物的合成：

[1]通常使用下述步骤合成具有如下结构的缀合物：

选择性试剂-[寡核苷酸]-3’

(i)激活选择性试剂。优选地，选择性试剂中的激活基团是琥珀酰亚胺基团或氨基基团；如果选择性试剂携带伯胺或仲胺，可不需要激活，因为激活的寡核苷酸可与选择性试剂中的氨基基团反应。

(ii)在其5’端上激活寡核苷酸。优选地，寡核苷酸中的激活基团是氨基基团(其中选择性试剂被琥珀酰亚胺基团激活)或羧基基团(其中选择性试剂被氨基激活或包含氨基基团)，和

(iii)在适合于两种激活基团之间的反应的条件下，使激活的选择性试剂与激活的寡核苷酸接触。

[2]通常使用下述步骤合成具有如下结构的缀合物：

保护基团-[有义链]-3’

3’-[反义链]-选择性试剂

(i)激活选择性试剂。优选地，选择性试剂中的激活基团是琥珀酰亚胺或氨基基团，

(ii)在其5’端上激活有义链。优选地，寡核苷酸中的激活基团是氨基基团(其中选择性试剂被琥珀酰亚胺基团激活)或羧基基团(其中选择性试剂被氨基激活)，

(iii)在适合于两种激活基团之间的反应的条件下使激活的选择性试剂与激活的有义链接触，

(iv)添加保护基团至固定化的反义链。该步骤优选地使用寡核苷酸进行，其活性基团被乙酰化或苄基化(呋喃糖基团)、2-氰乙基化(磷酸二酯键)和FMOC(外环氨基基团)阻断。

(v)使有义链和反义链退火

本发明的缀合物可使用本领域技术人员已知的技术制备。缀合物的合成可涉及官能团的选择性保护和脱保护。适合的保护基团对于本领域技术人员是熟知的。例如，在Wuts，P.G.M.和Greene T.W.的Protecting Groups inOrganic Synthesis(第四版Wiley-Interscience)和Kocienski P.J.的ProtectingGroups(第三版Georg Thieme Verlag)中提供了有机化学中保护基团的一般性综述。

在本发明的背景中，下述术语具有如下详细含义：

-术语“C₁-C₆烷基”涉及由碳和氢原子组成的直链或支化烃自由基，其不包含不饱和度，具有一至六个，优选地一至三个(C₁-C₃烷基)碳原子，并且其通过单键被连接至分子其余部分。烷基基团的例子包括但不限于诸如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基的烷基基团。优选地烷基指的是甲基。

-术语“卤素”指溴、氯、碘或氟。

-术语“卤代烷基”指其中至少一个氢原子被卤素替代的如上定义的烷基基团。卤代烷基基团的例子包括但不限于CF₃、CCl₃、CHF₂、CF₂CF₃。优选地卤代烷基指CF₃。

-术语“C₆-C₁₀芳基”指具有6至10个碳原子的芳族基团，包括1或2个芳族核，通过碳-碳键结合或稠和，包括例如苯基、萘基和二苯基。优选地“芳基”指苯基。

-术语“杂环基”指稳定的3-至10-元环自由基，优选5-或6-元环，其由碳原子和一至五个杂原子组成，所述杂原子选自氮、氧和硫，并且其可以是部分或完全饱和的或芳族(“杂芳基”)。为了本发明的目的，杂环可以是单环基、双环基或三环基环体系，其可包括稠环的体系。在具体的实施方式中，杂环基基团是琥珀酰亚胺。

通过以上描述的式(III)表示的本发明的化合物可包括立体异构体，这取决于手性中心的存在。单个异构体、对映体或非对映异构体和其混合物落在本发明的范围内。

除非另外指出，用于本发明中的化合物旨在包括区别仅在于存在一个或多个同位素富集原子的化合物。例如，除用氘或氚置换氢或用富¹³C-或¹⁴C-碳或富¹⁵N-氮置换碳以外具有本结构的化合物在本发明的范围内。

使用氨基-衍生的核酸和激活的三重再摄取抑制剂的合成

在第一种实施方式中，通过将氨基-衍生的核酸偶联至具有结构(I)的化合物或其类似物的激活的衍生物形式可获得根据本发明的缀合物。在具体的实施方式中，激活的衍生物形式是具有结构(I)的化合物的衍生物，其中R₂是H，根据下述结构(VII)：

其中

n或m是整数，其每个具有0和6之间的值，包括0和6；

p是具有0和4之间的值的整数，包括0和4；

q是具有0和20之间的值的整数，包括0和20；

R₅是氢；卤素；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的脂肪族；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的杂脂肪族；取代或未取代、支化或非支化的酰基；取代或未取代、支化或非支化的芳基；取代或未取代、支化或非支化的杂芳基；-OR_E；-C(＝O)R_E；-CO₂R_E；-CN；-SCN；-SR_E；-SOR_E；SO₂R_E；-NO₂；-N₃；-N(R_E)₂；-NHC(＝O)R_E；-NR_EC(＝O)N(R_E)₂；-OC(＝O)OR_E；-OC(＝O)R_E；-OC(＝O)N(R_E)₂；-NR_EC(＝O)OR_E；或-C(R_E)₃其中R_E的每次出现独立地为氢、保护基团、脂肪族部分、杂脂肪族部分、酰基部分；芳基部分；杂芳基部分；烷氧基；芳氧基；烷硫基；芳硫基；氨基、烷氨基、二烷氨基、杂芳氧基；或杂芳硫基部分和

R6是羰基激活自由基。

术语“羰基激活自由基”指使羰基容易亲核加成的羰基取代基。在具体的实施方式中，它与羰基基团一起形成酸酐、酸卤化物或酯基。在优选的实施方式中，羰基激活自由基选自卤素、-OC(O)R、-OR’、-SR”；其中R、R’和R”独立地选自C₁-C₆烷基、卤代烷基、杂环基、芳基和杂芳基。

术语“羰基激活基团”指使羧酸基团的羰基转化为更容易亲核加成的羰基的化合物，比如例如酸酐、羧酸卤化物、碳二亚胺、卤化剂、二硫化物等。在具体的实施方式中，羰基激活基团选自卤化剂、R(O)COC(O)R、RC(O)卤素、R’OH、R”SH、R”SSR”；其中R、R’和R”独立地选自C₁-C₆烷基、卤代烷基、杂环基、芳基和杂芳基。

在具体的实施方式中，羰基激活基团是N-羟基-琥珀酰亚胺。在该情况下，反应优选地在存在进一步羰基激活基团的情况下进行。

适于该方法的羰基激活基团包括碳二亚胺，比如二环己基碳二亚胺(DCC)和二异丙基碳二亚胺(DIC)和***醇，比如1-羟基-苯并***(HOBt)和1-羟基-7-氮杂-苯并***(HOAt)。在优选的实施方式中，式(VII)的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺在存在二异丙基碳二亚胺的情况下反应以提供激活的衍生物。

在具体的实施方式中，R⁶是琥珀酰亚胺氧基基团。所以，在另一种实施方式中，通过将氨基-衍生的核酸偶联至舍曲林或其类似物的激活的衍生物形式可获得根据本发明的缀合物，其中选择性试剂的激活的衍生物是式(VIII)的化合物：

其中R₁、R₃、R₄、R₅、R₆、n、m、p和q是如上定义的

根据具体实施方式，式(VIII)激活的化合物是下述化合物：

根据一种实施方式，根据本发明的化合物可通过包括以下的序列制备：

a)使式(V)的化合物

和式(IX)的酰化剂反应：

其中p是如上定义，Z是卤素或OH和PG是胺保护基团，以产生式(X)的化合物

常用的胺的保护基团包括氨基甲酸酯，比如叔丁基、苄基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基硅乙基、9H-芴基甲基(Fmoc)、烯丙基或硝基苯基氨基甲酸酯；酰胺，比如甲酰胺、乙酰胺、三氟乙酰胺、磺酰胺、三氟甲磺酰基酰胺或叔丁基磺酰基酰胺；和芳基或芳烷基胺，比如对甲氧苯基、苄基、对甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、二甲氧基三苯甲基或一甲氧基三苯甲胺。在具体的实施方式中，式(IX)的酰化剂是9H-芴基甲氧基羰基-6-氨基己酸。

例如，式(V)的化合物可又如在US6455736中描述的制备。尤其，当式(V)的化合物是舍曲林时，它可通过用适合的碱基治疗从相应的氢氯酸(商业上可得的)获得，所述适合的碱基包括有机或无机碱基，诸如碱或碱土碳酸盐或氢氧化物，氨或胺，比如三甲胺、三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、哌啶、吗啉等等。

b)脱保护式(V)的化合物中的氨基保护基团以产生式(XI)的化合物：

适合的脱保护条件是本领域技术人员熟知的，例如在Protecting Groupsin Organic Synthesis(Wuts，P.G.M.和Greene T.W.，第四版Wiley-Interscience)和Protecting Groups(Kocienski P.J.，第三版Georg Thieme Verlag)中。在具体的实施方式中，在存在胺比如哌啶、吗啉、二环己胺、二异丙基乙胺或二甲基氨基吡啶的情况下，优选地在存在哌啶的情况下去除保护基团。

c)使式(XI)的化合物与式(XII)或(XIII)的酰化剂反应：

其中n是如上定义和Z是卤素或OH，产生式(XIV)的化合物：

在具体的实施方式中，酰化剂是琥珀酸酐，

d)用羰基激活基团处理式(XIV)的化合物。

术语“羰基激活基团”指将羧酸基团的羰基转化为更容易亲核加成的羰基的化合物，比如例如酸酐、羧酸卤化物、碳二亚胺、卤化剂、二硫化物等。在具体的实施方式中，羰基激活基团选自卤化剂、R(O)COC(O)R、RC(O)卤素、R’OH、R”SH、R”SSR”；其中R、R’和R”独立地选自C₁-C₆烷基、卤代烷基、杂环基、芳基和杂芳基。

所以，在具体的实施方式中，步骤d)包括在存在进一步羰基激活基团的情况下用N-羟基琥珀酰亚胺处理式(XIV)的化合物。

适于该方法的羰基激活基团包括碳二亚胺，比如二环己基碳二亚胺(DCC)和二异丙基碳二亚胺(DIC)，和***醇，比如1-羟基-苯并***(HOBt)和1-羟基-7-氮杂-苯并***(HOAt)。在优选的实施方式中，式(XIV)的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺在存在二异丙基碳二亚胺的情况下反应以提供激活的衍生物。

根据另一方面，本发明涉及式(X)的中间物，

其中R¹-R⁵、m、n、o、p和PG如上定义。

在优选的实施方式中，R¹是甲基，R²-R⁵是氢，X和Y是氯根，W是氢，p是5和PG是9H-芴基甲氧基羰基。更优选地，式(X)的化合物是下述化合物：

根据另一方面，本发明涉及式(XI)的中间物，

其中R¹-R⁵、m、n、o和p如上定义。

更优选地，式(VII)的化合物是下述化合物：

根据另一方面，本发明涉及式(XIV)的中间物

其中R¹-R⁵、m、n、o、p和q如上定义。

更优选地，式(VII)的化合物是：

根据另一方面，本发明涉及式(XV)的中间物，

其中R¹-R⁶、m、n、o、p和q如上定义。

更优选地，式(XV)的化合物是下述化合物：

按照M.J.Gait.IRL Press-1985编辑的“Oligonucleotide synthesis，apractical approach.”中公开的方法，通过在固体载体上逐步固相合成形成待连接至选择性试剂的siRNA链。

为了缀合该选择性试剂，寡核苷酸需要被氨基衍生。这可在5’端或3’端进行。在优选的实施方式中，选择性试剂被连接至5’端。

根据本发明的合成的一种实施方式，根据本发明的缀合物可通过使选择性试剂和下式的氨基修饰的寡核苷酸反应制备：

使用氨基接头改性剂激活寡核苷酸的一般程序通常按照以下方案：

在将寡核苷酸的5’-OH基团偶联至氨基接头之后，在已知条件下去除胺保护基团。例如，TFA-保护的氨基-衍生物可通过用氨处理脱保护；而MMT-保护的氨基-衍生物可通过用乙酸、氯乙酸、二氯乙酸或三氟乙酸处理被脱保护。

氨基修饰的寡核苷酸的一般合成方法为：

(i)制备接头/修饰分子(真空干燥)的无水乙腈溶液(在大部分商业上可得的amidites中使用0.1M溶液)，并且将其置于合成器的额外的储器(Y)内。

(ii)在开始合成需要的寡核苷酸序列时，在5’端添加Y碱基。这使得来自Y储器的接头/修饰分子能够偶联在寡核苷酸序列的端处。

(iii)使用适合的偶联周期开始合成。相同偶联周期将用于进行接头/修饰分子偶联。

(iv)在寡核苷酸合成结束时，冲洗载体并且最终用气体干燥载体。

(v)从柱去除固体载体并且将其转移至螺帽小瓶内，并且完成2步脱保护。

氨基修饰的寡核苷酸应该被脱保护，用于进一步缀合选择性试剂。为了该目的，如下去除寡核苷酸中所有剩下的保护基团。将包含20％v/v的甲胺(水溶液40％w/v)和80％v/v的饱和氨溶液(包含30-32％w/v的NH₃)的500μl混合物与寡核苷酸(200nmole规模)添加至Eppendorf管。该管被严格密封并且加热45分钟至温度为65℃。该程序消除核苷酸的磷原子中的保护基团(呋喃糖的乙酰化或苯甲酰化和磷酸二酯键的2-氰乙基化)，以及外环氨基基团的保护基团(Bz、Ac、IBu)。该混合物然后被冷却和过滤，并且上清液被干燥。残留的小球与1M三乙胺-HF在65℃下反应3小时以在核苷酸(2’-叔丁基二甲基甲硅烷基-TBDMS)的2’处切割保护基团。最后，所得溶液在Sephadex柱中被脱盐，留下氨基修饰的-5’-寡核苷酸。

在将氨基修饰接头并入3’OH末端的情况中；应该使用相应的聚合物载体(CPG球)，并且合成方案将对应于下图：

(通过使用氢氧化铵或Beckman试剂可进行水解)(甲基胺：氢氧化铵)。

在两种情况中，脱保护步骤是相同的，并且在这种情况中的缀合方法也是相同的，但是具有不同程度的效率。在大部分情况下，5’-氨基衍生化实现较好的结果。

在具体的实施方式中，寡核苷酸预先与二价或三价磷酰胺反应。以此方式，可获得具有两个或三个偶联位置的化合物，从而两个或三个选择性试剂分子可被偶联至寡核苷酸。所述两个或三个选择性试剂分子可以相似或不同。

在具体的实施方式中，相同选择性试剂的两个或三个分子被偶联至寡核苷酸。在另一种实施方式中，两个或三个不同的选择性试剂被偶联至寡核苷酸。

在一种实施方式中，寡核苷酸与二价或三价亚磷酰胺反应。

本领域技术人员已知例如在Protecting Groups in Organic Synthesis(Wuts，P.G.M.和Greene T.W.，第四版Wiley-Interscience)和Protecting Groups(Kocienski P.J.，第三版Georg Thieme Verlag)中的羟基保护基团，以及适合的保护和脱保护条件。

在具体的实施方式中，羟基保护基团选自醚、甲硅烷基醚、酯、磺酸酯、次磺酸酯(sulfenate)、亚磺酸盐、碳酸盐和氨基甲酸酯。在优选的实施方式中，羟基保护基团选自酰基、苯甲酰基、苄基、甲氧基乙基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基(DMT)、甲氧甲基酯(MOM)、甲氧基三苯甲基(MMT)、对甲氧基苄基酯(PMB)、甲硫基甲基醚、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、三苯甲基(Tr)、9H-芴基甲基(Fmoc)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基氧甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚。优选地，PG、PG’和PG”独立地选自H、DMT和Fmoc。

使用羧基-衍生的核酸和激活的三重摄取抑制剂的合成

在可选的优选的实施方式中，本发明的缀合物通过氨基-衍生的选择性试剂和羧基-衍生的寡核苷酸的缀合获得。具体地，本发明的缀合物具有结构(III)和其药学上可接受的形式：

其中

n或m是整数，其每个具有0和6之间的值，包括0和6；

p是具有0和4之间的值的整数，包括0和4；

q是具有0和20之间的值的整数，包括0和20；

R₅是氢；卤素；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的脂肪族；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的杂脂肪族；取代或未取代、支化或非支化的酰基；取代或未取代、支化或非支化的芳基；取代或未取代、支化或非支化的杂芳基；-OR_E；-C(＝O)R_E；-CO₂R_E；-CN；-SCN；-SR_E；-SOR_E；SO₂R_E；-NO₂；-N₃；-N(R_E)₂；-NHC(＝O)R_E；-NR_EC(＝O)N(R_E)₂；-OC(＝O)OR_E；-OC(＝O)R_E；-OC(＝O)N(R_E)₂；-NR_EC(＝O)OR_E；或-C(R_E)₃其中R_E的每次出现独立地为氢、保护基团、脂肪族部分、杂脂肪族部分、酰基部分；芳基部分；杂芳基部分；烷氧基；芳氧基；烷硫基；芳硫基；氨基、烷氨基、二烷氨基、杂芳氧基；或杂芳硫基部分；

并且其中寡核苷酸是能够特异性结合靶分子的核酸，其中所述靶分子是α-突触核蛋白或编码α-突触核蛋白的mRNA。

具有结构(III)的缀合物的合成方法包括使具有结构(V)的化合物：

与具有式(VI)的羧基修饰的寡核苷酸反应：

因此，本发明也涉及具有结构(VI)的化合物，其中寡核苷酸是能够特异性结合靶分子的核酸，其中所述靶分子是α-突触核蛋白或编码α-突触核蛋白的mRNA。在具体的实施方式中，具有结构(VI)的化合物中的寡核苷酸是反义间隙体。尤其，所述间隙体包括4个2’-O甲基修饰的核糖核苷酸的片段为侧翼的10个脱氧核苷酸的中间片段。

在具体的实施方式中，寡核苷酸被靶向α-突触核蛋白mRNA中的区域，所述区域选自位于人α-突触核蛋白mRNA的448-465位(SEQ ID NO：4)、499-516位(SEQ ID NO：5)和502-519位(SEQ ID NO：6)的区域，其中编号对应相对于NCBI检索号NM_000345中定义的α-突触核蛋白序列(SEQ IDNO：7)中第一核苷酸的位置。在优选的实施方式中，具有结构(VI)的化合物中的寡核苷酸由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的序列组成。

常用的胺的保护基团包括氨基甲酸酯，比如叔丁基、苄基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、9H-芴基甲基(Fmoc)、烯丙基或硝基苯基氨基甲酸酯；酰胺，比如甲酰胺、乙酰胺、三氟乙酰胺、磺酰胺、三氟甲磺酰基酰胺或叔丁基磺酰基酰胺；和芳基或芳烷基胺，比如对甲氧苯基、苄基、对甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、二甲氧基三苯甲基或一甲氧基三苯甲胺。在具体的实施方式中，式(VII)的酰化剂是9H-芴基甲氧基羰基-6-氨基己酸。

为了缀合该选择性配体，寡核苷酸需要被羧基衍生。这可在5’端或3’端进行。在优选的实施方式中，选择性配体被连接至5’端。

根据一种实施方式，通过使如上所述的式(V)的化合物和式(VI)的羧基-修饰的寡核苷酸反应可制备式(III)的缀合物。

使用羧基接头改性剂激活寡核苷酸的一般程序通常按照以下方案：

合成羧基修饰的寡核苷酸的一般方法为：

(i)制备无水乙腈中修饰分子的溶液，并且将其置于合成器的额外的储器(Y)内。

(ii)在合成需要的寡核苷酸序列开始时，在5’端添加Y碱基。这使得来自Y储器的接头/修饰分子能够偶联在寡核苷酸序列的端处。

羧基修饰的寡核苷酸应该被脱保护，用于进一步缀合选择性试剂。为了该目的，如下去除寡核苷酸中所有剩下的保护基团。将包含20％v/v的甲胺(水溶液40％w/v)和80％v/v的饱和氨溶液(包含30-32％w/v的NH₃)的500μl混合物与寡核苷酸(200nmole规模)添加至Eppendorf管。该管被严格密封并且加热45分钟至温度为65℃。该程序消除核苷酸的磷原子中的保护基团(呋喃糖的乙酰化或苯甲酰化和磷酸二酯键的2-氰乙基化)和外环氨基基团的保护基团(Bz、Ac、IBu)。该混合物然后被冷却和过滤，并且上清液被干燥。残留的小球与1M三乙胺-HF在65℃下反应3小时以在核苷酸(2’-叔丁基二甲基甲硅烷基-TBDMS)的2’处切割保护基团。最后，所得溶液在Sephadex柱中被脱盐，留下羧基修饰的-5’-寡核苷酸。

在具体的实施方式中，通过本发明的方法合成的缀合物包括的寡核苷酸是反义间隙体。尤其，间隙体包括4个2’-O甲基修饰的核糖核苷酸的片段为侧翼的10个脱氧核苷酸的中间片段。

在优选的实施方式中，通过本发明的方法合成的缀合物包括的寡核苷酸靶向α-突触核蛋白mRNA中的区域，所述区域选自位于人α-突触核蛋白mRNA的448-465位(SEQ ID NO：4)、499-516位(SEQ ID NO：5)和502-519位(SEQ ID NO：6)的区域，其中编号对应相对于NCBI检索号NM_000345中定义的α-突触核蛋白序列(SEQ ID NO：7)中第一核苷酸的位置。尤其，核酸由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的序列组成。

该羧基-激活的寡核苷酸然后与如上定义的式(V)的选择性试剂的激活的衍生物反应。获得具有通式(III)的化合物：

尤其，该化合物(III)包括能够特异性结合靶分子的寡核苷酸，其中所述靶分子是α-突触核蛋白或编码α-突触核蛋白的mRNA。在具体的实施方式中，具有结构(III)的化合物中的寡核苷酸是反义间隙体。尤其，所述间隙体包括4个2’-O甲基修饰核糖核苷酸的片段为侧翼的10个脱氧核苷酸的中间片段。

在具体的实施方式中，寡核苷酸靶向α-突触核蛋白mRNA中的区域，所述区域选自位于人α-突触核蛋白mRNA的448-465位(SEQ ID NO：4)、499-516位(SEQ ID NO：5)和502-519位(SEQ ID NO：6)的区域，其中编号对应相对于NCBI检索号NM_000345中定义的α-突触核蛋白序列(SEQ IDNO：7)中第一核苷酸的位置。在优选的实施方式中，具有结构(IH)的化合物中的寡核苷酸由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的序列组成。

F.诊断性缀合物和其用途

通过使用能够高亲和性结合神经递质转运蛋白的选择性试剂，将治疗性化合物特异性递送至靶细胞的可能性也可应用于递送用于诊断目的的化合物。因此，在另一种实施方式中，本发明提供缀合物，其包括：

(ii)显像剂。

以上详细描述了术语“选择性试剂”和“神经递质转运蛋白”，并且对于本发明的诊断缀合物其可被同等理解。

术语“显像剂”和“造影剂”在本文可互换地使用，并且指生物相容的化合物，其使用通过增加图像的那些不同区域之间的“对比度”，促进图像的不同部分的区别。术语“造影剂”因此包括用于增强图像质量的试剂——虽然如此其可在不存在这种试剂的情况下产生(如在例如MRI的情况下)——以及产生图像所必需的试剂(如在例如核显像的情况下)。适合的造影剂包括但不限于用于放射性核素显像、计算机化断层显像、拉曼光谱显像、磁共振显像(MRI)和光学显像的造影剂。

用于放射性核素显像的造影剂包括通常用正电子-发射器比如¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、⁸²Rb、⁶²Cu和⁶⁸Ga标记的放射性药物。SPECT放射性药物通常用正电子发射器比如⁹⁴mTc、²⁰¹Tl和⁶⁷Ga标记。放射性核素显像模式(正电子发射断层显像(PET)；单光子发射计算机断层显像(SPECT))是映射放射性核素-标记的放射性示踪剂的位置和浓度的诊断横截面显像技术。PET和SPECT可通过测量代谢活性，用于局部化和特征化放射性核素。PET和SPECT提供信息，关于细胞水平比如细胞活力的信息。在PET中，患者摄取或被注射发射正电子的轻微放射性物质，其可随着物质移动通过体内被监测。在一个普通的应用中，例如，用连接的正电子发射器给患者葡萄糖，并且随着它们执行各种任务监测他们的大脑。因为当大脑工作时使用葡萄糖，PET图像显示脑活性高的地方。在本发明的某些实施方式中，体内显像的PET或SPECT的细胞标记为离体。与PET紧密相关的是单光子发射计算机断层显像，或SPECT。这两者之间的主要不同是SPECT使用发射低能量光子的放射性示踪剂，而不是发射正电子的物质。

用于CT显像的造影剂包括，例如，碘化的或溴化的造影剂。这些试剂的例子包括碘酞酸盐、iohexyl、泛影酸盐、碘帕醇、乙碘油和碘番酸盐。已报道的钆试剂被用作CT造影剂(见例如，Henson等，2004)。例如，钆喷酸盐(gadopentate)试剂被用作CT造影剂(在Strunk和Schild，2004中讨论)。考虑计算机化断层显像(CT)为本发明的背景中的显像模式。通过采用来自各个角度的一系列X射线，有时大于一千，并且然后将其与计算机结合，CT使得其可能构建身体的任何部分的三维图像。计算机被编程为显示来自任何角度和任何深度处的二维切片。在CT中，当初始CT扫描未诊断时，不透射线造影剂的静脉内注射比如那些本文描述可有助于软组织肿块的识别和描绘。

用于光学显像的造影剂包括例如荧光素、荧光素衍生物、吲哚菁绿、俄勒冈绿、俄勒冈绿的衍生物、若丹明绿、若丹明绿的衍生物、伊红、赤藓红、德克萨斯红、德克萨斯红的衍生物、孔雀绿、纳米金磺基琥珀酰亚胺酯、层叠蓝、香豆素衍生物、萘、吡啶噁唑衍生物、层叠黄染料、dapoxyl染料和本文公开的各种其他荧光性化合物。

在优选的实施方式中，造影剂是能够通过磁共振显像装置显像的化合物。可通过磁共振显像装置显像的造影剂与用于其他显像技术的那些不同。其目的是帮助区分组织组分与相同的信号特征，并且缩短弛豫时间(其在T1-加权自旋回波MR图像上产生较强的信号和T2-加权图像上的较低强度的信号)。MRI造影剂的例子包括钆螯合剂、锰螯合剂、铬螯合剂和铁颗粒。在一个具体实施方式中，MRI造影剂是¹⁹F。CT和MRI二者都提供帮助区分组织边界的解剖学信息。与CT相比，MRI的缺点包括较低的患者耐受性、起搏器和某些其他植入的金属设备的禁忌和与多种原因——不仅仅是运动——有关的人工制品。另一方面，CT是快速的、耐受良好的和容易利用的，但是具有比MRI低的对比分辨率，并且需要碘对照和电离辐射。CT和MRI二者的缺点是这两种显像模式都不提供细胞水平的功能信息。例如，这两种模式都不提供关于细胞活力的信息。磁共振显像(MRI)是比CT新的显像模式，其使用高强度磁铁和无线电频率信号以产生图像。生物组织中最丰富的分子种类是水。水质子核的量子力学的“自旋”最终产生显像实验中的信号。在MRI中，待显像的样品被放置在强静态磁场中(1-12Tesla)和用脉冲的射频(RF)辐射激发自旋以产生样品中的净磁化强度。各种磁场梯度和其他RF脉冲然后对自旋起作用以将空间信息编码为记录的信号。通过收集和分析这些信号，计算三维图像，比如正常地显示在二维切片中的CT图像是可能的。

MRI造影剂包括选自铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)的金属络合物。在优选的实施方式中，通过磁共振显像装置能够显像的化合物是基于钆的化合物。

如本文所使用，术语“基于钆的化合物”意思是，在关于显像使用的情况，可施用至对象的任何包含钆的物质导致血管内增强。在另一种实施方式中，包含钆的造影剂选自钆、喷替酸钆和钆双胺。

待施用的包含钆的造影剂的量以每kg体重约10mg的量变化。在另一实施方式中，在施用包含钆的造影剂之后约45分钟获取第二磁共振图像。本发明也提供进一步包括腹膜内施用生理盐水溶液(例如林格溶液)至对象的步骤的上述方法，其按照步骤(c)或步骤(d)施用。

本发明也提供如上限定的缀合物作为诊断剂的用途，和在其表面上表达神经递质转运蛋白的细胞的检测方法。

根据本发明的诊断性缀合物包括至少一种选择性试剂，其特异性结合一种或多种神经递质转运蛋白，所述神经递质转运蛋白选自DAT，SERT或NET，和显像剂。在具体的实施方式中，选择性试剂是三倍阻断剂，更具体地为具有结构(I)和其药学上可接受的形式的三重再摄取抑制剂

其中

n或m是整数，其每个具有0和6之间的值，包括0和6；

p是具有0和4之间的值的整数，包括0和4

本发明也提供多模态显像方法。本发明的某些实施方式涉及使用涉及测量多个信号的多种显像模式使对象、或对象内的位点显像的方法。在某些实施方式中，多个信号由细胞上或细胞中的单一标记产生。如以上所阐释，本领域技术人员已知的任何显像模式可应用于本显像方法的这些实施方式。

显像模式在施用标记的组合物例如标记的细胞期间或之后的任何时间进行。例如，显像研究可在施用本发明的标记的细胞期间或其之后的任何时间进行，即帮助引导递送至特定位置。

附加显像模式可与第一显像模式同时地，或在第一显像模式之后的任何时间进行。例如，附加显像模式可进行约1秒、约1小时、约1天、或在完成第一显像模式之后的任何更长的时间期间，或在任何这些规定的时间之间的任何时间。在本发明的某些实施方式中，多种显像模式同时地进行，使得它们在施用标记的细胞或试剂之后同时开始。本领域普通技术人员将熟悉本发明考虑的各种显像模式的性能。

在本显像方法的一些实施方式中，相同的显像设备用于进行第一显像模式和第二显像模式。在其他实施方式中，不同的显像设备用于进行不同的显像模式。本领域普通技术人员将熟悉可用于本文所述的显像模式的性能的显像设备。

本发明提供了使用一种或多种显像模式使细胞显像的方法。在一些实施方式中，细胞用多种显像剂标记，并且在其他方面中，细胞用单一标记试剂标记。在某些实施方式中，单一标记试剂是多模式可检测的试剂。

G.包括脂质体和树状聚合物的缀合物

在另一种实施方式中，本发明提供了缀合物，其中脂质体被偶联至一种或多种神经递质转运蛋白，所述神经递质转运蛋白选自多巴胺转运蛋白(DAT)、血清素转运蛋白(SERT)或去甲肾上腺素转运蛋白(NET)。

在另一种实施方式中，本发明提供了缀合物，其中树状聚合物被偶联至一种或多种神经递质转运蛋白，所述神经递质转运蛋白选自多巴胺转运蛋白(DAT)、血清素转运蛋白(SERT)或去甲肾上腺素转运蛋白(NET)。

通过将治疗化合物封装在树状聚合物或脂质体内，缀合物允许将所述化合物选择性递送至表达所述神经递质转运蛋白的细胞。

在优选的实施方式中，选择性试剂选自三重再摄取抑制剂、去甲肾上腺素多巴胺双重再摄取抑制剂、血清素单一再摄取抑制剂、去甲肾上腺素单一再摄取抑制剂和多巴胺单一再摄取抑制剂。在仍更优选的实施方式中，选择性试剂是茚达曲林——具有下述通式的化合物——或其药学上活性盐

其中n、m、p、R₁、R₂、R₃、R₄和R₅如上定义。

脂质体和纳米颗粒是通常用于药物封装的纳米容器的示例性形式。脂质体优选地具有小于200纳米的直径。具有直径在50和150纳米之间的脂质体是优选的。尤其优选的是具有约80纳米的外径的脂质体或其他纳米容器。适合类型的脂质体用中性磷脂制造，比如1-棕榈酰-2-油酰基-sn-丙三醇-3-磷酸胆碱(POPC)、二磷脂酰磷酸胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺基(DSPE)、或胆固醇，连同少量的(1％)阳离子脂质，比如双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)以稳定脂质体内的DNA。

脂质体可以用纳米颗粒或任何其他分子纳米容器替代，其可封装DNA、具有小于200nm的直径，并且当制剂仍在血液时或在从血液至靶细胞的细胞内区室的运输中时保护核酸不与核酸酶接触。而且，代替使用缀合试剂比如PEG链，一种或多种其他聚合物质比如鞘磷脂可被连接至脂质体或纳米容器的表面，并且用于两个目的——提供用于缀合“可运输的肽”的支架和延迟制剂从血液去除，并且优化血浆药物动力学。此外，本发明考虑将DNA递送至具有特定靶受体的细胞或器官的任何基团。脂质体可用于将DNA递送至器官，比如肝、肺和脾。

用于递送本发明的缀合物的其他适合的容器包括树状聚合物。术语“树状聚合物”指具有核并且具有由核发射的支化结构的多个壳的大分子。树状载体的形状和尺寸可变化。在一些情况下，树状载体的形状可以是大致球形或球状的。此外，树状载体可具有范围在约15埃(A)至约250A的直径，与例如从约500道尔顿至约2百万道尔顿的相应范围的分子量。树状聚合物可从各种来源商业上获得(例如，Dendritech，Midland，Michigan)或通过本领域技术人员已知的方法合成。树状分子可粗略地被划分为低分子量和高分子量种类。第一类别包括树状聚合物和树突，而第二类别包括树枝化、超支化聚合物和刷聚合物(也称为瓶刷)。树状聚合物和树突是重复支化、单分散和通常高度对称的化合物。在限定树状聚合物和树突上没有明显的区别。树突通常包含被称为焦点的单个化学可寻址基团。由于缺少摩尔质量分布，高摩尔质量的树状聚合物和树突是大分子，但不是聚合物。树状聚合物的特性被分子表面上的官能团主导。因为树状支架将内部功能与外部功能分离，功能分子的树状封装允许活性位点的分离，该活性位点为模仿生物材料中的活性位点的结构的结构。例如，当其末端基团是亲水基团如羧基基团时，树状聚合物可以是水溶性的。

树状聚合物可通过下述特征被表征：(i)中心核(I)，其可具有一个或多个活性位点和显著尺寸的点状，以便影响树状聚合物的最终拓扑；(ii)连接至中心核的一层或多层支化重复单元；(iii)末端官能团，比如阴离子或阳离子基团，任选地通过连接基团连接至树状聚合物的表面。

本文考虑的树状聚合物可包括赖氨酸、或赖氨酸类似物构建单元。术语“赖氨酸类似物”指具有单峰羧基基团和两个或三个伯胺基团的分子，所述单峰羧基基团用于与构建单元的之前层连接，所述两个或三个伯胺基团与进一步构建单元、阻断基团、接头或芳基酸基团连接。在PCT/AU2007/000352中描述了本文考虑的“赖氨酸类似物”的例子，例如甘氨酰基-赖氨酸。在一些具体的实施例中，树状聚合物仅包括赖氨酸或一种类型的赖氨酸类似物作为构建单元。

本文考虑的其他树状聚合物包括包括聚酰胺基胺(PAMAM)、聚(醚羟胺)(PEHAM)或聚丙烯亚胺构建单元的那些。在其具体的实施例中，树状聚合物仅具有聚酰胺基胺(PAMAM)、聚(醚羟胺)(PEHAM)或聚丙烯亚胺作为构建单元。

核部分可仅包含用于构建单元的1个连接点，或可包含2、3或更多个点，其可以或不可以被进一步用于构建单元的连接。典型地，连接点是游离氨基基团。核部分可由构建单元组成，包括或源自构建单元，或可以是不同于构建单元的分子。示例性核部分在本文被阐释并且在PCT/AU2007/000352被描述。

脂质体和树状聚合物可结合任何适合的药学载体，用于静脉内给药。组合物的静脉内给药是优选的路径，因为它创伤最小。如果期望，其他的施用路径是可能的。适合的药学上可接受的载体包括生理盐水、Tris缓冲液、磷酸缓冲液或任何其他水溶液。适合的剂量可以通过本领域技术人员熟知的程序确定。

根据本发明的缀合物的脂质体和树状聚合物可封装以上提及的能够特异性靶向α-突触核蛋白的任何核酸。另外，脂质体和树状聚合物也可包含适合于治疗帕金森病和在表达神经递质受体的神经元中发挥其作用的化合物。可并入根据本发明的树状聚合物或脂质体的合适的药物包括左旋多巴、多巴胺拮抗因子、MAO-B抑制剂、金刚烷胺和抗胆碱能药。

***

通过阐明提供了下述实施例和附图，并且不旨在限制本发明。

实施例

实施例1.靶向验证：功能

实验设计

为了功能上确定根据本发明分子的靶向，使用包括偶联至茚达曲林的靶向5HT1A受体的反义分子的缀合物。茚达曲林是非选择性单胺转运蛋白抑制剂，其阻断多巴胺、去甲肾上腺素和血清素的再摄取。将分子鼻内施用，以验证茚达曲林靶向中缝核。测试两个不同的浓度(30和100μg/小鼠)并且在施用8-OH-DPAT之后评估低体温症，以功能上确定靶向缝中的5-HT1A受体。鼻内施用分子24小时之后确定基础温度。

8-羟基-2-(二正丙氨基)四氢萘(8-OH-DPAT)是选择性5-HT1A激动剂，其通过激活中缝中的体树状5-HT1A自体受体诱导小鼠的低体温。通过该试验确定是否8-OH-DPAT诱导的低体温可通过茚达曲林阻断，是否能够靶向缝，以及5-HT1A特异性反义。

每只小鼠鼻内施用30和100μg根据本发明的分子并且在24小时之后测量基础温度。腹膜内(i.p.)施用8-OH-DPAT 1mg/kg并且其后5、15、30、60和120分钟测量温度。

结果

观察到用鼻内茚达曲林靶向的寡核苷酸能够到达缝并且在单次应用的施用24小时之后敲低5-HT1A的表达(见图1)。两个浓度都能够阻断单次剂量的8-OH-DPAT造成的温度改变，但是在下述实验中选择30μg/小鼠，原因是4天的标准施用，允许随时间积聚寡核苷酸。

实施例2.靶向验证：定位

实验设计

为了可视化是否靶向黑质体、基因座coeruleus和缝，采用心室内施用标记荧光团Alexa488的茚达曲林-反义。

多巴胺转运蛋白(DAT)表达被定位在黑质体致密区域(SNC)的多巴胺能神经元中。

去甲肾上腺素转运蛋白(NET也称为溶质载体家族6成员2，SLC6A2)表达限于基因座coeruleous(LC)中的去甲肾上腺素能神经元并且不出现在释放多巴胺或肾上腺素的神经元中。

血清素转运蛋白(SERT)表达主要地位于在中缝核的具有中缝背核(DR)高水平的血清素能神经元中。

为了共定位目的，选择酪氨酸羟化酶(TH)和色氨酸羟化酶(TPH)。TH催化合成儿茶酚胺中的限速步骤并且在SN和LC中高表达。TPH参与血清素的合成和缝中的表达。

结果

拍摄了三个感兴趣的区域(SN、LC和DR)的单一平面共焦图像。进行茚达曲林-低聚糖-Alexa488的绿色直接荧光，用抗TH(酪氨酸羟化酶)共染LC和SN，用抗TPH(色氨酸羟化酶)核染色DR和DAPI。在外科手术1小时和24小时之后处死动物，并且在1小时观察到低聚糖的清楚染色。在其他脑区域中未检测到Alexa488荧光。

在较高放大率下的三个区域的单一平面共焦图像显示，在神经元TH(SN和LC)和TPH(DR)中共定位的分子的细胞质和核内染色是阳性的。

因此，在期望的区域中施用仅1小时之后观察到分子的特异性靶向：动物中的SN、LC和DR心室内施用缀合有茚达曲林的低聚糖，其提供靶向寡聚物到达期望区域和内在化至神经元内、到达细胞质和核的的证据。

实施例3.候选物选择

实验设计

通过核糖核酸酶H试验选择总共7个预选物分子。该试验的目标是确定这7种寡核苷酸中哪个促进催化切割mRNA的非特异性内切核酸酶的活性。

为了确定体内mRNA的敲低，每个分析分子在总共五种动物中进行原位杂交。7个预选物分子被分成两组，连续数周施用。在连续4天期间施用总共30μg/小鼠/天。在最后一次施用24小时之后处死动物。

通过蛋白质印迹分析黑质体(SNc/VTA)和纹状体中的α-突触核蛋白蛋白质水平。小鼠用1mg/kg/天的PD-1233和与PD-1233具有相同配体的无义序列鼻内连续处理4天。在最后一次施用之后24小时、3天和7天处死动物。

结果

图2显示核糖核酸酶H试验的结果。

在选择期间使用下述标准：如图2所显示的选定候选物，5个物种(小鼠、大鼠、狗、猴和人)之间94-100％的同源性，与其它突触核蛋白(γ和β)无同源性，和核糖核酸酶H活性的诱导。

为了进行体内研究，选择寡核苷酸的最终化学，如在图3中显示的方案中描述。

第I组选择的预选物的特征显示在表1中。

表1.第I组预选物

原位杂交数据显示黑质体中降低水平的α-syn，其指示与媒介相比α-syn被候选物1234有效敲低，以及候选物1233和1234降低了中缝背核中α-syn水平。

图4显示α-突触核蛋白(α-syn)的mRNA水平的量化，其被计算为在嗅球(BO)、黑质体(SNc/VTA)、中缝背核(DR)和中缝(MnR)中的媒介的百分数。πp＜0.05vs无义(IND-ns-ASO)，*p＜0.05vs媒介，**p＜0.01vs媒介(两个方式ANOVA)。

观察到，候选物1232、1233和1234能够连续4天以30μg/小鼠/天降低靶向区域中α-突触核蛋白的mRNA水平而不影响其他脑区域中的水平。预选物1234在SN(黑质体)中和预选物1233在缝中观察到最高的降低。没有其他脑区域受到影响。

图8显示针对β-肌动蛋白和酪氨酸羟化酶(TH)归一化的α-突触核蛋白的黑质体Nc/VTA水平，以及针对β-肌动蛋白归一化的TH的水平。在最后一次施用之后24小时1233产生α-突触核蛋白水平的显著降低(p＜0.05)，并且3天后恢复该水平。

图9显示针对β-肌动蛋白和酪氨酸羟化酶(TH)归一化的α-突触核蛋白的纹状体水平，以及针对β-肌动蛋白归一化的TH的水平。在最后一次施用之后24小时1233产生α-突触核蛋白水平的显著下降(p＜0.05)，并且3天后恢复该水平。

实施例4：毒性

实验设计

还分析了先前试验的分子是否能够诱导人PBMC(外周血液单核细胞)中的IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IFN-α、IFNγ和TNFα分泌。化合物被作为半对数的6-点稀释液(10、3.16、1.0、0.32、0.1和0.03μM浓度)测试。化合物对PBMC的效果用并行运行的阿尔玛蓝细胞毒性板测试三次。

结果

表2显示分子都不能够诱导PBMC中的免疫应答。

表2.分析分子的免疫应答

Unstim.ctrl.1：未受刺激的对照1；Unstim.Ctrl.2：未受刺激的对照2。Ref.comp.：参考化合物

实施例5：进一步选择候选物

实验设计

通过评估候选物序列与包括人的若干物种的互补性进行最终选择。考虑进一步表征的物种是小鼠、猴和人。通过使用人和小鼠的基因组和转录组数据库和通过使用猴的ref.seq.RNA数据库进行BLAST分析。

结果

观察到，所有三种预选物与人和猴α-突触核蛋白是100％同源的。

尤其，预选物分子1234在小鼠α-突触核蛋白序列的nt2中具有错配，但是这不影响其活性。预选物分子1232和1233与任何其他人基因不具有同源性。预选物1234与多于2个基因具有一定的同源性。需要特别关注伸展蛋白上推定的脱靶作用。该基因在人的大脑和SN中被高度表达。

图5显示获自患零星帕金森疾病(PD)的个体死后脑样品的中间和侧黑质体(SN)的分析。SN展示PD中大量的组织损伤。

图6显示三个物种的伸展蛋白序列的比对(与人α-突触核蛋白mRNA共同的15nt的候选物1234显示在框中)。该比对显示与小鼠序列不具有同源性，和在猴序列中在nt10处具有内部错配，可能降低猴中的核糖核酸酶H活性。

考虑所有这些数据，本发明的发明人选择分子#1233(从现在起，也命名为NLF-PD-1233或PD-1233)作为最佳候选物，序列为：cuccCTCCACTGTCuucu，如在图7中所显示。

实施例6：辅助药效学。NLF-PD-1233的潜在细胞因子诱导

实验设计

人外周血液单核细胞(PBMC)用于研究NLF-PD-1233(1233)诱导IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IFNγ和TNFα分泌的潜能。

在0.03、0.1、0.3、1、3和10μM浓度下测试NLF-PD-1233。使用Luminex多重试剂盒测定细胞因子分泌。伴刀豆球蛋白A(30mg/ml)用作增殖参考化合物。

结果

高至10μM浓度的NLF-PD-1233不诱导IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IFNγ或TNFα从人PBMC的释放。

实施例7：安全性药理学。NLF-PD-1233对中枢神经***(CNS)的潜在效果

实验设计

NLF-PD-1233对CNS的潜在效果在小鼠的功能性观察试验组合(FOB)(Irwin测试)(非GLP)中被评估。

一组六只雄性CD-1小鼠接受单剂量的0.3、1.0或3.0mg/kg的NLF-PD-1233或媒介，通过使用校准移液管施用10μl至每个鼻孔在鼻内接受20μl/动物的总体积。

基于Irwin′s方法(Irwin S 1968Psychopharmacologia(Berl.)13：222-257)观察动物的一般行为、自主和运动效果。体温也被测量。

在给药之后30、60、120、240和360分钟进行观察。另外，在给药前和在每次观察之后立即测量每只小鼠的直肠温度。在给药日之后动物被保持另外7天，在此期间每日观察它们的毒性和死亡率的总体迹象。

结果

当与媒介对照组相比时，以0.3、1和3mg/kg的剂量水平鼻内施用NLF-PD-1233在雄性小鼠中不产生显著的行为、生理学或体温改变。

所以认为NOEL(未观察到效果的水平)＞3mg/kg。

实施例8：药物动力学

实验设计

杂交试验：研发使用荧光标记肽核酸(PNA)探针的竞争性杂交试验以检测NLF-PD-1233。

结合荧光检测的HPLC：在注射至HPLC内之前，经与荧光标记PNA探针杂交，结合荧光检测的阴离子-交换(AEX)-HPLC方法(5’-Atto425-OO-GAAGACAGTGGAGGGA-3’，SEQ ID NO：19)用于检测血液和组织中的NLF-PD-1233。由于NLF-PD-1233的ODN是已知在血浆中不稳定的未修饰的DNA，ODN通过在序列的3’端处引入反向dT被修饰。NLF-PD-1233的量化下限(LLOQ)显示为血浆中0.6ng/ml和组织中1.5ng/g。

结果

静脉内施用NLF-PD-1233至小鼠之后血浆浓度的测定

未修饰的NLF-PD-1233和3’保护的衍生物被静脉内施用至小鼠。通过杂交试验测定血浆浓度。

在静脉内施用至小鼠1小时之后，未修饰的NLF-PD-1233的血浆浓度是可检测的(见图10)。在静脉内施用至少24小时之后，3’保护的NLF-PD-1233在小鼠的循环中是可检测的。

与3’保护的衍生物对照，这些数据指示未修饰的NLF-PD-1233在血液中被核酸酶快速降解。

静脉内施用NLF-PD-1233至食蟹猴之后血液浓度的测定

NLF-PD-1233以0.3和1mg/kg静脉内施用至猴子，并且通过杂交试验测定血浓度。

观察到NLF-PD-1233浓度的快速下降，在给药1小时后，没有检测到母体化合物(见图11)。检测到若干代谢峰，其图案对于3’-核酸外切溶解消化是典型的。

在鼻内施用NLF-PD-1233至食蟹猴之后CSF浓度的测定

NLF-PD-1233以0.3和3mg/kg的单剂量和每天以1mg/kg，超过14天鼻内施用至猴子。通过杂交试验测定CSF和血液浓度。

CSF(图12A)和血液(图12B)中NLF-PD-1233的浓度是剂量依赖性的，但不是剂量比例的。CSF(脑脊液)中的Cmax是大约100pg/mL(0.3mg/kg)和400pg/mL(3mg/kg)，而血液中的Cmax是大约60pg/mL(0.3mg/kg)和大约3800pg/mL(3mg/kg)。血液中NLF-PD-1233浓度的增加强于CSF的增加(见图12)。

在超过14天多次鼻内给药1mg/kg之后，已经观察到在CSF给药前的样品中的低浓度。CSF中的Cmax大约为400pg/mL。该Cmax与单次施用3mg/kg相似，这可通过在多次给药阶段的积聚效果解释，在给药48小时后仍具有大约150pg/mL的最低浓度。在血液中，Cmax是大约300pg/mL，但是未观察到积聚效果(图12)。

分布

测定小鼠在单次鼻内给药1mg/kg之后NLF-PD-1233的组织分布(每个时间点3只动物)。

在给药15分钟、1小时、6小时和24小时之后收集脑、肝、肾、脾、肺、胃和血浆的样品。

使用结合荧光检测的AEX-HPLC测定NLF-PD-1233的血浆和组织浓度。

在给药1小时和6小时之后在胃中发现NLF-1233的最高浓度，但是在个体动物之间具有高的可变性(表3)。

在给药24小时之后，分析所有组织中的浓度低于或接近试验的检测限度。仅在胃和肝中(仅一只动物)检测到显著量的NLF-PD-1233(表3)。

表3.在鼻内施用至小鼠之后脑、肝、肾、脾、肺、胃中NLFPD-1233的平均浓度(±SD)

异常值未从计算中去除。如果标准偏差(SD)设置为不适用(n.a.)，由于较少数目的高于检测限度的值，值可不被计算。

在所有的母体化合物的浓度高的组织样品中观察到NLF-PD-1233的代谢物。可以假定在具有低浓度的母体化合物的组织中，代谢物也存在，但是低于检测限度。观察的峰图案指示NFL-1233的降解主要被3’-外切核酸酶诱导。

没有观察到暴露于NLF-PD-1233的大量血浆，除在15分钟时间点处有一只动物之外。

在给药1小时和6小时之后检测到脑中NLF-PD-1233的浓度为大约1ng/g。由于脑组织是完全均质的，所以不能得出空间分布的结论。

鼻内递送之后发现动物与动物之间的总体可变性非常高。

在单次静脉内给药1mg/kg之后测定小鼠未修饰的NLF-PD-1233和3’保护的衍生物的组织分布(每个时间点3只动物)。在给药15分钟、1小时、6小时和24小时之后收集脑、肝、脾、肾和血浆的样品。

在对小鼠静脉内给药15分钟之后测量母体化合物未修饰的NLF-PD-1233的低组织浓度。在肝中发现未修饰的NLF-PD-1233的最高浓度。NLF-PD-1233也以低浓度存在于脑中(图13)。

未修饰的NLF-PD-1233加代谢物的组织浓度稍微高于在肝和肾中测量的具有最高浓度的单独母体化合物(图14)。

3’修饰NLF-PD-1233的组织浓度高于未修饰的NLF-PD-1233的组织浓度，这表明针对3’外切核酸酶的稳定性降低了母体化合物的降解(图15)。

与单独母体化合物相比较，NLF-PD-1233加代谢物的3’保护的衍生物的组织浓度稍高(图16)。

实施例9.功能试验

为了确定根据本发明的缀合物是否能够增加中枢神经***中的多巴胺释放，在用缀合物1233处理的小鼠或对照小鼠中测量响应藜芦定(钠通道活化剂)的多巴胺水平或响应诺米芬新(多巴胺再摄取的抑制剂)的细胞外多巴胺水平。

实验设计

进行了微量透析体内试验。动物用媒介(PBS)或1233(连续4天，1mg/kg/天)处理。通过HPLC测量藜芦定诱发多巴胺释放和细胞外多巴胺。

结果

在用媒介(PBS)或1233处理的动物中，通过HPLC测量的藜芦定诱发多巴胺释放的微量透析体内试验显示，在通过用NLF-PD-1233处理降低α-突触核蛋白的水平之后，在药理学挑战之后多巴胺释放显著增加(见图17)。

在用媒介(PBS)或1233处理的动物中，通过HPLC测量的细胞外多巴胺的微量透析体内试验显示，在药理学挑战(诺米芬新，一种去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂)之后释放增加，以及在用NLF-PD-1233处理之后多巴胺水平显著增加(见图18)。

Claims

1.一种缀合物，其包括：

i)至少一种选择性试剂，其特异性结合一种或多种神经递质转运蛋白，所述神经递质转运蛋白选自多巴胺转运蛋白(DAT)、血清素转运蛋白(SERT)或去甲肾上腺素转运蛋白(NET)和

2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述核酸与所述靶分子的结合导致所述α-突触核蛋白的活性的抑制或所述编码α-突触核蛋白的mRNA的沉默。

3.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述选择性试剂选自三重再摄取抑制剂、去甲肾上腺素多巴胺双重再摄取抑制剂、血清素单一再摄取抑制剂、去甲肾上腺素单一再摄取抑制剂和多巴胺单一再摄取抑制剂。

4.根据权利要求3所述的缀合物，其中所述选择性试剂是具有下述结构(I)的三重再摄取抑制剂和其药学上可接受的形式

其中

n或m是整数，其每个具有0和6之间的值，包括0和6；

p是具有0和4之间的值的整数，包括0和4；

R₁是氢；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的脂肪族；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的杂脂肪族；取代或未取代、支化或非支化的酰基；取代或未取代、支化或非支化的芳基；取代或未取代、支化或非支化的杂芳基；-C(＝O)R_A；-CO₂R_A；-C(＝O)N(R_A)₂或-C(R_A)₃；其中R_A的每次出现独立地为氢、保护基团、脂肪族部分、杂脂肪族部分、酰基部分；芳基部分；杂芳基部分；烷氧基；芳氧基；烷硫基；芳硫基；氨基、烷氨基、二烷氨基、杂芳氧基；或杂芳硫基部分；

R₂是氢；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的脂肪族；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的杂脂肪族；取代或未取代、支化或非支化的酰基；取代或未取代、支化或非支化的芳基；取代或未取代、支化或非支化的杂芳基；-C(＝O)R_B；-CO₂R_B；-C(＝O)N(R_B)₂或-C(R_B)₃；其中R_B的每次出现独立地为氢、保护基团、脂肪族部分、杂脂肪族部分、酰基部分；芳基部分；杂芳基部分；烷氧基；芳氧基；烷硫基；芳硫基；氨基、烷氨基、二烷氨基、杂芳氧基；或杂芳硫基部分；

R₅是氢；卤素；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的脂肪族；环状或非环状、取代或未取代、支化或非支化的杂脂肪族；取代或未取代、支化或非支化的酰基；取代或未取代、支化或非支化的芳基；取代或未取代、支化或非支化的杂芳基；-OR_E；-C(＝O)R_E；-CO₂R_E；-CN；-SCN；-SR_E；-SOR_E；SO₂R_E；-NO₂；-N₃；-N(R_E)₂；-NHC(＝O)R_E；-NR_EC(＝O)N(R_E)₂；-OC(＝O)OR_E；-OC(＝O)R_E；-OC(＝O)N(R_E)₂；-NR_EC(＝O)OR_E；或-C(R_E)₃，其中R_E的每次出现独立地为氢、保护基团、脂肪族部分、杂脂肪族部分、酰基部分；芳基部分；杂芳基部分；烷氧基；芳氧基；烷硫基；芳硫基；氨基、烷氨基、二烷氨基、杂芳氧基；或杂芳硫基部分。

5.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述三重再摄取抑制剂具有结构(II)

6.根据权利要求1至5任一项所述的缀合物，其中能够特异性结合与神经递质转运蛋白在相同的细胞中表达的靶分子的所述核酸选自间隙体、双链干扰RNA、具有微RNA活性的双链RNA、反义寡核苷酸、抗微RNA、preMiRNA、编码微RNA或shRNA的mRNA、PNA、LNA、核酶和适配体。

7.根据权利要求6所述的缀合物，其中能够特异性结合α-突触核蛋白mRNA的所述核酸靶向所述α-突触核蛋白mRNA中的区域，所述区域选自位于人α-突触核蛋白mRNA的499-516位(SEQ ID NO：5)、448-465位(SEQ ID NO：4)和502-519位(SEQ ID NO：6)的区域，其中编号对应相对于NCBI检索号NM_000345中定义的α-突触核蛋白序列(SEQ ID NO：7)中第一核苷酸的位置。

8.根据权利要求7所述的缀合物，其中所述核酸是反义寡核苷酸或间隙体。

9.根据权利要求8所述的缀合物，其中所述间隙体包括4个2’-O-甲基修饰核糖核苷酸片段为侧翼的10个脱氧核苷酸的中间片段。

10.根据权利要求9所述的缀合物，其中所述间隙体由选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的序列组成。

11.根据权利要求8至10任一项所述的缀合物，其中所述选择性试剂被缀合至核酸的5’端。

12.根据权利要求8至11任一项所述的缀合物，进一步包括第二选择性试剂，其特异性结合一种或多种神经递质转运蛋白，所述神经递质转运蛋白选自多巴胺转运蛋白(DAT)、血清素转运蛋白(SERT)或去甲肾上腺素转运蛋白(NET)。

13.根据权利要求12所述的缀合物，其中所述第一和第二选择性试剂相同或不同。

14.根据权利要求12或13任一项所述的缀合物，其中所述第一选择性试剂和所述第二选择性试剂特异性结合不同的神经递质转运蛋白。

15.根据权利要求12至14任一项所述的缀合物，其中所述第二选择性试剂被连接至不与所述第一选择性试剂连接的多核苷酸的端，或借助于连接至所述端的多官能接头被连接至与所述第一选择性试剂相同的端。

16.根据权利要求7所述的缀合物，其中所述核酸是干扰RNA。

17.根据权利要求16所述的缀合物，其中所述干扰RNA是siRNA、shRNA或miRNA。

18.根据权利要求17所述的缀合物，其中所述干扰RNA包括选自SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的序列。

19.根据权利要求17所述的缀合物，其中所述干扰RNA是选自miR-7(SEQ ID NO：15)和miR-153(SEQ ID NO：16)的miRNA。

20.根据权利要求16至19任一项所述的缀合物，其中所述干扰RNA是双链RNA，并且其中所述选择性试剂被缀合至有义链的5’端或反义链的5’端，或其中所述干扰RNA包含缀合至所述有义链和所述反义链的5’端的两种选择性试剂。

21.根据权利要求16至20任一项所述的缀合物，进一步包括第二选择性试剂，其特异性结合一种或多种神经递质转运蛋白，所述神经递质转运蛋白选自多巴胺转运蛋白(DAT)、血清素转运蛋白(SERT)或去甲肾上腺素转运蛋白(NET)。

22.根据权利要求21所述的缀合物，其中所述第一和第二选择性试剂相同或不同。

23.根据权利要求21或22任一项所述的缀合物，其中所述第一选择性试剂和所述第二选择性试剂特异性结合不同的神经递质转运蛋白。

24.根据权利要求21至23任一项所述的缀合物，其中所述第二选择性试剂被连接至：

(i)被连接至所述第一选择性试剂的核酸的相对端，

(ii)与被连接至所述第一选择性试剂的多核苷酸互补的核酸的一端，和/或

(iii)借助于连接至所述端的多官能接头被连接至所述第一选择性试剂的所述核酸的相同端。

25.根据权利要求1至15任一项所述的缀合物，其中所述选择性试剂和所述核酸通过连接基团被连接。

26.根据权利要求25所述的缀合物，其中所述连接基团是多官能分子，其允许多于一种选择性试剂与每个核酸缀合。

27.根据权利要求25所述的缀合物，其中所述连接基团具有结构

-L1_d-[(A-L2)_a-(B-L3)_b]_c-

其中：

A和B表示独立地选自单糖、烷基链和(C₂-C₂₀)亚烷基二醇的单体单元；

a和b是范围从0至50的整数；

c是范围从0和30的整数；

d是0或1。

28.根据权利要求27所述的缀合物，其中b和d是0，c是1，A是烷基链和L2是磷酸二酯键。

29.根据权利要求1至28任一项所述的缀合物，进一步包括连接至不与所述选择性试剂连接的核酸的一个或多个端的保护基团。

30.根据权利要求29所述的缀合物，其中所述保护基团包括反向核苷酸部分。

31.根据权利要求29或30任一项所述的缀合物，其中所述保护基团包括反向dT。

32.根据权利要求1至31任一项所述的缀合物，进一步包括促进横跨生物膜运输的基团。

33.根据权利要求1至32任一项所述的缀合物，进一步包括内体裂解肽。

34.根据权利要求1至33任一项所述的缀合物，其中所述缀合物具有结构(III)，和其药学上可接受的形式，

其中n、m、p、R₁、R₃、R₄和R₅如权利要求4所限定，并且其中q是具有0和20之间的值的整数，包括0和20。

35.根据权利要求29至31任一项所述的缀合物，其中所述寡核苷酸是反义寡核苷酸或间隙体。

36.根据权利要求35所述的缀合物，其中所述间隙体包括4个2’-O甲基修饰的核糖核苷酸的2个片段为侧翼的10个脱氧核苷酸的中间片段。

37.根据权利要求34至36任一项所述的缀合物，其中所述寡核苷酸靶向α-突触核蛋白mRNA中的区域，所述区域选自位于人α-突触核蛋白mRNA的499-516位(SEQ ID NO：5)、448-465位(SEQ ID NO：4)和502-519位(SEQ ID NO：6)的区域，其中编号对应相对于NCBI检索号NM 000345中定义的α-突触核蛋白序列(SEQ ID NO：7)中第一核苷酸的位置。

38.根据权利要求37所述的缀合物，其中所述核酸由选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的序列组成。

39.根据权利要求38所述的缀合物，其中所述选择性试剂具有结构(II)

40.根据权利要求34至39任一项所述的缀合物，具有结构(IV)

41.根据权利要求1至40任一项所述的缀合物，其用于药品中。

42.根据权利要求1至40任一项所述的缀合物，其用于治疗或预防与路易体的沉积相关的疾病。

43.根据权利要求42所述使用的缀合物，其中与路易体的沉积相关的所述疾病选自帕金森病、路易体痴呆和多***萎缩症。

44.根据权利要求42或43所述使用的缀合物，其中所述缀合物被心室内或鼻内施用。

45.一种用于合成具有结构(III)的缀合物的方法，

其中n、m、p、q、R₁、R₃、R₄和R₅如权利要求34所限定，并且其中所述寡核苷酸是能够特异性结合靶分子的核酸，其中所述靶分子是α-突触核蛋白或编码α-突触核蛋白的所述mRNA，所述方法包括使具有结构(V)的化合物

与具有式(VI)的羧基修饰的寡核苷酸反应：

46.一种具有结构(VI)的化合物

其中所述寡核苷酸是能够特异性结合靶分子的核酸，其中所述靶分子是α-突触核蛋白或编码α-突触核蛋白的所述mRNA。

47.根据权利要求45所述的方法或根据权利要求46所述的化合物，其中所述寡核苷酸是反义间隙体。

48.根据权利要求47所述的方法或化合物，其中所述间隙体包括4个2’-O甲基修饰的核糖核苷酸的片段为侧翼的10个脱氧核苷酸的中间片段。

49.根据权利要求45至48任一项所述的方法或化合物，其中所述寡核苷酸靶向α-突触核蛋白mRNA中的区域，所述区域选自位于人α-突触核蛋白mRNA的499-516位(SEQ ID NO：5)、448-465位(SEQ IDNO：4)和502-519位(SEQ ID NO：6)的区域，其中编号对应相对于NCBI检索号NM_000345中定义的α-突触核蛋白序列(SEQ ID NO：7)中第一核苷酸的位置。

50.根据权利要求49所述的方法或化合物，其中所述核酸由选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的序列组成。

51.一种缀合物，其包括：

ii)显像剂。

52.根据权利要求51所述的缀合物，其中所述选择性试剂选自三重再摄取抑制剂、去甲肾上腺素多巴胺双重再摄取抑制剂、血清素单一再摄取抑制剂、去甲肾上腺素单一再摄取抑制剂和多巴胺单一再摄取抑制剂。

53.根据权利要求52所述的缀合物，其中所述选择性试剂是三重再摄取抑制剂。

54.根据权利要求53所述的缀合物，其中所述三重再摄取抑制剂具有结构(I)和其药学上可接受的形式

其中n、m、p、R₁、R₂、R₃、R₄和R₅如权利要求4所限定。

55.根据权利要求51至54任一项所述的缀合物，其中所述显像剂是磁共振显像造影剂。

56.根据权利要求55所述的缀合物，其中所述磁共振显像造影剂是基于钆的化合物。

57.一种用于使表达神经递质转运蛋白的细胞显像的方法，其包括使所述细胞与权利要求49至54任一项所述的缀合物接触，其中形成所述缀合物的部分的所述选择性试剂特异性结合由所述细胞表达的所述神经递质转运蛋白。

58.根据权利要求51至56任一项所述的缀合物，其用作诊断剂。

59.一种治疗或预防在有需要的对象中与路易体的沉积相关的不适的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据权利要求1至40任一项所述的缀合物至所述对象。

60.根据权利要求59所述的方法，其中与路易体的沉积相关的疾病选白：帕金森病、路易体痴呆和多***萎缩症。

61.根据权利要求59或60所述的方法，其中所述缀合物被心室内或鼻内施用。

62.一种缀合物，其包括：

ii)纳米转运蛋白，其包括能够特异性结合与神经递质转运蛋白在相同的细胞中表达的靶分子的核酸，其中所述靶分子是α-突触核蛋白或编码α-突触核蛋白的mRNA，或可用于在有需要的对象中治疗与路易体的沉积相关的疾病的药物，其中所述纳米转运蛋白是脂质体或树状聚合物。

63.根据权利要求62所述的缀合物，其中所述选择性试剂选自三重再摄取抑制剂、去甲肾上腺素多巴胺双重再摄取抑制剂、血清素单一再摄取抑制剂、去甲肾上腺素单一再摄取抑制剂和多巴胺单一再摄取抑制剂。

64.根据权利要求63所述的缀合物，其中所述选择性试剂是三重再摄取抑制剂。

65.根据权利要求64所述的缀合物，其中所述三重再摄取抑制剂具有结构(I)和其药学上可接受的形式

其中n、m、p、R₁、R₂、R₃、R₄和R₅如权利要求4所限定。

66.根据权利要求62至65任一项所述的缀合物，其用于治疗与路易体的沉积相关的疾病。

67.根据权利要求66所述使用的缀合物，其中与路易体的沉积相关的疾病选自：帕金森病、路易体痴呆和多***萎缩症。

68.一种治疗或预防在有需要的对象中与路易体的沉积相关的不适的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据权利要求1至40或62-65任一项所述的缀合物至所述对象。

69.根据权利要求68所述的方法，其中与路易体的沉积相关的疾病选自：帕金森病、路易体痴呆和多***萎缩症。

70.根据权利要求68或69所述的方法，其中所述缀合物被心室内或鼻内施用。