CN104880414B - Tsh免疫层析试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物领域，具体涉及TSH免疫层析试剂盒及其制备方法。其由试剂盒由试纸卡、比色卡和免疫层析结果判读记录仪构成。所述试纸卡结构为：在塑料底板一端粘贴上样垫，上样垫的一端紧密压接含有标记TSHβ亚单位特异性抗体的胶体金垫，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜，NC膜上包被有相互分离的检测线T和质控线C，T线为TSHα亚单位抗体，C线为抗鼠IgG抗体，NC膜的另一端连接吸样垫形成试纸，试纸装入塑料卡内形成试纸卡。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及TSH免疫层析试剂盒及其制备方法。
背景技术
TSH是先天性甲状腺机能低下症检查的首选指标。大约每4千位新生儿中会有一位新生儿的甲状腺机能有严重的缺陷，其他有更多的新生儿有轻微或程度不一的缺陷。几乎所有的发达国家包括我国都实施新生儿筛检，以便发现并治疗先天性甲状腺机能低下症。新生儿甲状腺机能低下TSH的参考值一般为小于10μIU/mL。
促甲状腺激素(TSH)是垂体分泌的促进甲状腺的生长和机能的激素。人类的TSH为一种糖蛋白，含211个氨基酸，糖类约占整个分子的15％。整个分子由α亚单位和β亚单位2条件肽链组成。TSH全面促进甲状腺的机能：包括加强碘泵活性，增强过氧化物酶活性，促进甲状腺球蛋白合成及酪氨酸碘化等各个环节。垂体分泌TSH，一方面受下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素(TRH)的促进性影响，另方面又受到Τ3、Τ4反馈性的抑制性影响，二者互相拮抗，它们组成下丘脑-腺垂体-甲状腺轴。正常情况下，下丘脑分泌的TRH量，决定腺垂体甲状腺轴反馈调节的水平。TRH分泌多，则血中Τ3、Τ4水平的调定点高，当血中Τ3、Τ4超过此调定水平时，则反馈性抑制腺垂体分泌TSH，并降低腺垂体对TRH的敏感性，从而使血中Τ3，Τ4水平保持相对恒定。TSH参考值：2～10μIU/mL。在病理情况下，TSH含量发生变化。增高：原发性甲状腺功能减退、伴有甲状腺功能低下的桥本病、外源性促甲状腺激素分泌肿瘤(肺、乳腺)、亚急性甲状腺炎恢复期。摄人金属锂、碘化钾、促甲状腺激素释放激素可使促甲状腺激素增高；减低：垂体性甲状腺功能低下、非促甲状腺激素瘤所致的甲状腺功能亢进，以及摄入阿司匹林、皮质激素等。
免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，基本原理如下：利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成复合物，然后在NC膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测T线，在一定的条件下，T线的强弱和样品中的浓度呈正相关或负相关，从而实现检测。
专利CN201220399454公开了一种TSH的快速定量免疫层析试剂盒，其具有操作简便、反应快速、适合现场检测和经济实用等优点。但是然而由于胶体金具有强烈的电荷性，通过静电吸附抗体或蛋白，在pH的变化下，很容易造成抗体或蛋白的脱离并且吸附抗体或蛋白后的胶体金不稳定，从而导致该试剂盒的稳定性、灵敏度无法保障。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种TSH的半定量免疫层析检测试剂盒，其由试剂盒由试纸卡、比色卡和免疫层析结果判读记录仪构成。
在本发明的一个实施方案中，所述试纸卡结构为：在塑料底板一端粘贴上样垫，上样垫的一端紧密压接含有标记TSHβ亚单位特异性抗体的胶体金垫，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜，NC膜上包被有相互分离的检测线T和质控线C，T线为TSHα亚单位抗体，C线为抗鼠IgG抗体，NC膜的另一端连接吸样垫形成试纸，试纸装入塑料卡内形成试纸卡。
所述试纸卡的NC膜为孔径9-15微米的多孔样结构膜，上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。所述比色卡是白色背景上印有系列不同深浅红色线条的纸板，用于对检测结果的对比判定。不同深浅的红色线条共5条，分别对应3，10，15，25，55μIU/mL的TSH浓度。
所述免疫层析结果判读记录仪是一种光学检测***，用于对检测结果的定量判定,TSH的检测范围0-5000μIU/mL。
在本发明中，NC膜抗体的包被过程为：以0.1M pH8.0磷酸盐缓冲液(PBS)将TSHα亚单位抗体配制成1-3mg/ml的溶液,将抗鼠IgG配制成1-2mg/ml的溶液,用喷膜仪在NC膜上部和下部以1-1.5μl/cm的参数进行分别划线，包被C、T线，划线后将NC膜在干燥间，温度20-25℃，湿度小于30％，干燥2-5小时。
所述试纸卡，胶体金垫制备过程为：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法(Frens法)制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH7.5，按100ml胶体金溶液加入2.0mg TSHβ亚单位抗体，再缓慢添加0.2M K2CO3将胶体金溶液调至pH9.0，添加K2CO3的时间为5分钟，然后室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，1mg/mlPVP封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用PBS缓冲液(pH值8.0)复溶至50ml，按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间，温度20-25℃，湿度小于30％，干燥2-5小时，制成胶体金垫。
在本发明进一步地实施方案中，所述玻璃纤维膜在涂布前需经过处理液浸泡处理5分钟，所述处理液为含有1mg/ml蔗糖的PBS缓冲液，pH值为9.5。
所述试纸卡的装配过程为：在干燥室内，温度20-25℃，湿度小于40％，取塑料底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫，搭胶体金垫的1/5粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/3粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好的塑料板切成3-5mm宽的试纸条,再装入塑料卡内，形成试剂试纸卡。
所述试剂盒，检测方法为：1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；2)10μI血清、血浆样本，样本为全血时吸取20ul样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL样本稀释液(生理盐水或PBS),15-20分钟内用免疫层析结果判读记录仪或比色卡半定量判定结果；4)仪器判定时，设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果；5)用比色卡判定结果时，将试纸卡T线的颜色和比色卡上标准线的颜色深浅进行对比，半定量判定样品的浓度区间。
本发明有益效果是：提供一种利用免疫层析胶体金技术制备的TSH快速定量免疫层析检测试剂盒，能半定量的检测样本中的TSH含量，同时适合血清、血浆和全血样本，并适合临床上单人份检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、稳定性强、适合现场检测和经济实用等优点。
具体实施方式
下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1
TSHα、β亚单位特异性配对抗体购自美国abcam公司；其他试剂均购自sigma公司。
NC膜抗体的包被过程为：以0.1M pH8.0磷酸盐缓冲液(PBS)将TSHα亚单位抗体配制成2mg/ml的溶液,将抗鼠IgG配制成1.5mg/ml的溶液,用喷膜仪在NC膜上部和下部以1.5μl/cm的参数进行分别划线，包被C、T线，划线后将NC膜在干燥间，温度20-25℃，湿度小于30％，干燥4小时。
胶体金垫制备过程为：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法(Frens法)制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH7.5，按100ml胶体金溶液加入2.0mg TSHβ亚单位抗体，再缓慢添加0.2M K2CO3将胶体金溶液调至pH9.0，添加K2CO3的时间为5分钟，然后室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，1mg/mlPVP封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用PBS缓冲液(pH值8.0)复溶至50ml，将玻璃纤维膜浸泡在处理液处理5分钟，处理液为含有1mg/ml蔗糖的PBS缓冲液，pH值为9.5。然后将玻璃纤维膜取出，按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置干燥间，温度20-25℃，湿度小于30％，干燥4小时，制成胶体金垫。
试纸卡组装在干燥室内，温度20-25℃，湿度小于40％，取塑底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫，搭胶体金垫的1/5粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/3粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好塑料板切成3-5mm宽的试纸条,再装入塑料卡内，形成试纸卡。
分别用3，10，15，25，55μIU/mL的TSH标准品对试纸进行测定，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，将相应强度的色带印刷到比色卡上，完成比色卡制备。
实施例2 灵敏度试验
采用0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μIU/mL的TSH标准品对试纸卡进行测定，每个浓度平行进行五次测试。检测方法：1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；2)精确吸取10μI血清、血浆样本，样本为全血时吸取20ul样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL样本稀释液(PBS)，10-15分钟内，分别通过肉眼和BiodotTSR3000读条***对免疫层析结果进行判读。肉眼判定结果通过不同浓度TSH标准品试纸与阴性试纸(TSH为0μIU/mL)的颜色区别进行判定，仪器判定结果通过不同浓度TSH标准品试纸与阴性试纸(TSH为0μIU/mL)的OD590值是否存在显著性差异进行判定结果是否阳性。判定出阳性结果的最低浓度TSH即为试纸卡的灵敏度。
另外，分别制备了对比试纸与实施例1制备的试纸进行对比，对比例除胶体金直径不同外，其他均同实施例1。
具体结果如下：
| 胶体金直径(nm) | 肉眼判定灵敏度 | 仪器判定灵敏度 | |
| 实施例1 | 20 | 0.5μIU/mL | 0.1μIU/mL |
| 对比例1 | 10 | 无 | 8.0μIU/mL |
| 对比例2 | 30 | 4.0μIU/mL | 2.0μIU/mL |
实施例3 稳定性试验
将实施例1制备的试纸卡在40℃分别放置1个月和3个月后，按照实施例2的方法测定试纸的灵敏度。
本实施例的对比例如下：
对比例3：胶体金垫制备过程不同于实施例1，其他均与实施例1相同，对比例3胶体金垫制备方法如下：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法(Frens法)制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH7.5，按100ml胶体金溶液加入2.0mg TSHβ亚单位抗体，室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，1mg/mlPVP封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用PBS缓冲液(pH值8.0)复溶至50ml，将玻璃纤维膜浸泡在处理液处理5分钟，处理液为含有1mg/ml蔗糖的PBS缓冲液，pH值为9.5。然后将玻璃纤维膜取出，按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置干燥间，温度20-25℃，湿度小于30％，干燥4小时，制成胶体金垫。
对比例4：胶体金垫制备过程不同于实施例1，其他均与实施例1相同，对比例4胶体金垫制备方法如下：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法(Frens法)制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH7.5，按100ml胶体金溶液加入2.0mg TSHβ亚单位抗体，再缓慢添加0.2M K2CO3将胶体金溶液调至pH8.5，添加K2CO3的时间为5分钟，然后室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，1mg/mlPVP封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用PBS缓冲液(pH值8.0)复溶至50ml，将玻璃纤维膜浸泡在处理液处理5分钟，处理液为含有1mg/ml蔗糖的PBS缓冲液，pH值为9.5。然后将玻璃纤维膜取出，按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置干燥间，温度20-25℃，湿度小于30％，干燥4小时，制成胶体金垫。
对比例5：胶体金垫制备过程不同于实施例1，其他均与实施例1相同，对比例5胶体金垫制备方法如下：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法(Frens法)制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH7.5，按100ml胶体金溶液加入2.0mg TSHβ亚单位抗体，再缓慢添加0.2M K2CO3将胶体金溶液调至pH9.5，添加K2CO3的时间为5分钟，然后室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，1mg/mlPVP封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用PBS缓冲液(pH值8.0)复溶至50ml，将玻璃纤维膜浸泡在处理液处理5分钟，处理液为含有1mg/ml蔗糖的PBS缓冲液，pH值为9.5。然后将玻璃纤维膜取出，按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置干燥间，温度20-25℃，湿度小于30％，干燥4小时，制成胶体金垫。
对比例6：胶体金垫制备过程不同于实施例1，其他均与实施例1相同，对比例6胶体金垫制备方法如下：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法(Frens法)制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH7.5，按100ml胶体金溶液加入2.0mg TSHβ亚单位抗体，再缓慢添加0.2M K2CO3将胶体金溶液调至pH9.5，添加K2CO3的时间为5分钟，然后室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，1mg/mlPVP封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用PBS缓冲液(pH值8.0)复溶至50ml，按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置干燥间，温度20-25℃，湿度小于30％，干燥4小时，制成胶体金垫。
对比例7：为CN201220399454实施例中制备的试纸卡。
结果如下：
试纸卡放置1个月后的灵敏度结果
| 肉眼判定灵敏度 | 仪器判定灵敏度 | |
| 实施例1 | 0.5μIU/mL | 0.1μIU/mL |
| 对比例3 | 32.0μIU/mL | 16.0μIU/mL |
| 对比例4 | 8.0μIU/mL | 4.0μIU/mL |
| 对比例5 | 16.0μIU/mL | 8.0μIU/mL |
| 对比例6 | 32.0μIU/mL | 16.0μIU/mL |
| 对比例7 | 32.0μIU/mL | 16.0μIU/mL |
试纸卡放置3个月后的灵敏度结果
| 肉眼判定灵敏度 | 仪器判定灵敏度 | |
| 实施例1 | 1.0μIU/mL | 0.5μIU/mL |
| 对比例3 | >64.0μIU/mL | 32.0μIU/mL |
| 对比例4 | 32.0μIU/mL | 8.0μIU/mL |
| 对比例5 | >64.0μIU/mL | >64.0μIU/mL |
| 对比例6 | >64.0μIU/mL | >64.0μIU/mL |
| 对比例7 | >64.0μIU/mL | >64.0μIU/mL |
实施例4 线性试验
采用0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0和64.0μIU/mL的TSH标准品对实施例1制备的试纸卡进行测定，每个浓度平行进行五次测试。采用Biodot TSR3000读条***测定各浓度的OD590，取平均值进行回归。
结果表明，本发明制备的试纸卡线性良好，在1-64.0μIU/mL之间R2>0.99。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
Claims (4)
1.一种促甲状腺激素的半定量免疫层析检测试剂盒，其由试纸卡、比色卡和免疫层析结果判读记录仪构成；所述试纸卡结构为：在塑料底板一端粘贴上样垫，上样垫的一端紧密压接含有标记促甲状腺激素β亚单位特异性抗体的胶体金垫，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜，NC膜上包被有相互分离的检测线T和质控线C， T线为TSHα亚单位抗体，C线为抗鼠IgG抗体，NC膜的另一端连接吸样垫形成试纸，试纸装入塑料卡内形成试纸卡；
所述NC膜抗体的包被过程为：以0.1M pH8.0磷酸盐缓冲液将TSHα亚单位抗体配制成1-3mg/ml的溶液, 将抗鼠IgG配制成1-2mg/ml的溶液, 用喷膜仪在NC膜上部和下部以1-1.5μl/cm的参数进行分别划线，包被C、T线，划线后将NC膜在干燥间，温度20-25°C，湿度小于30%，干燥2-5小时；
胶体金垫制备过程为：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0. 2M K2CO3调至pH7. 5，按100ml胶体金溶液加入2.0mg TSH β亚单位抗体，再缓慢添加0. 2M K2CO3将胶体金溶液调至pH9.0，添加K2CO3的时间为5分钟，然后室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/ml牛血清白蛋白，1mg/mlPVP封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用pH值为8.0的PBS缓冲液复溶至50ml，按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置干燥间，温度20-25°C，湿度小于30%，干燥2-5小时，制成胶体金垫；
所述玻璃纤维膜在涂布前需经过处理液浸泡处理5分钟，所述处理液为含有1mg/ml蔗糖的PBS缓冲液，pH值为9.5。
2.根据权利要求1所述的半定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述试纸卡的NC膜为孔径9-15微米的多孔样结构膜，上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成；所述比色卡是白色背景上印有系列不同深浅红色线条的纸板，用于对检测结果的对比判定；不同深浅的红色线条共5条，分别对应3，10，15，25，55μIU/mL的TSH浓度。
3.根据权利要求1所述的半定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述免疫层析结果判读记录仪是一种光学检测***，用于对检测结果的定量判定, TSH的检测范围0-5000μIU/mL。
4.根据权利要求1所述的半定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于，在干燥室内，温度20-25°C，湿度小于40%，取塑料底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫，搭胶体金垫的1/5粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/3粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好的塑料板切成3-5mm宽的试纸条, 再装入塑料卡内，形成试纸卡。
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