CN104874027B - 多药物可控负载梯度再生骨支架的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种多药物可控负载梯度再生骨支架的制备方法，该方法包括以下步骤：步骤一，成形材料的配置；步骤二，支架制备的路径规划；步骤三，制备宏观骨支架；步骤四，复合载药电纺丝的再生骨支架。本发明提高了支架与自体骨连接的强度及稳定性；该支架的材料具有良好的生物相容性，并且复合了诱导因子，在组织重建中有利于诱导支架向骨软骨多层界面的转化。

Description

多药物可控负载梯度再生骨支架的制备方法

技术领域

本发明属于生物制造领域，具体涉及一种用于修复骨软骨缺损的人工梯度再生骨支架的制备方法，特别涉及一种多药物可控负载梯度再生骨支架的制备方法。

背景技术

由创伤、感染、骨病、骨肿瘤切除等造成的骨缺损一直是困扰人类的一大难题，因此也是研究领域的研究热点。临床上修复骨缺损的方法有骨移植、人工骨、骨组织工程等方法，其中骨移植已被临床证明是修复各类骨缺损的最佳方法，但是骨移植会导致手术创伤，消耗大量手术时间，且往往局限于有限的骨源，以及受限额移植骨形态、大小等。因此，研究组织工程再生骨支架替代人工植骨，以克服自体或异体骨固有的缺点，是临床迫切需要解决的问题。

从介入治疗技术观点来看，理想再生骨支架应该具有以下特点： (1)良好的生物相容性，即能够使材料在成分及结构上与天然骨更为接近；(2)良好的机械性能，即具有足够的支撑力和延展性；(3) 良好的骨传导性，即具有较好的三维微纳尺度孔结构，尤其是它的合适孔径和孔隙间的连通，为成骨细胞的生长提供支撑粘附，为细胞扩散和营养物质以及新陈代谢提供通道；(4)具有骨诱导活性，即能够定向诱导种子细胞分化成骨细胞、软骨细胞等；(5)能够在体内降解消失，在体内降解速度能够与新生骨生长速度相匹配；（6）支架可控加载生长因子，能够促进种子细胞的增殖、分化。

然而，关节骨软骨再生过程涉及到多因子的诱导和多细胞表达作用，以形成骨、矿化软骨、未矿化软骨和胶原纤维等组织，是一个典型的多因素耦合影响的过程。因此，在进行骨软骨组织修复时，具有均匀属性的骨支架结构往往不能满足骨缺损部位细胞的活动和表达需求。构建的再生骨软骨支架除了要满足细胞对支架结构和力学性能的要求，更重要的是能够在骨组织再生过程中的不同阶段，为不同的细胞提供特定的生长环境。构建一种具有物理结构（密质骨、软质骨等）和化学成分（生长因子、蛋白质等）的梯度结构，能梯度的可控释放并输送诱导多细胞生长的药物、蛋白或生长因子的再生骨支架具有非常重要的意义和应用价值。

现有制备再生骨支架修复骨缺损方面的常用方法有：静电纺丝工艺、选择型激光烧结工艺和FDM熔融挤出工艺，但是通过这些方法制备出的再生骨支架有着诸多的缺陷。静电纺丝工艺制备的再生支架多为无纺状纳米纤维膜，难以成形具有明显厚度或外形轮廓的三维立体支架，力学性能较差，内部的孔隙率和孔隙贯通度不佳；选择性激光烧结工艺和熔融挤出工艺在成形支架材料和孔隙结构呈梯度分布的复合支架方面存在较大的局限性，无法为细胞生长、分化提供理想的生物微环境，致使在再生支架的制备方面仍然存在许多待解决的难题。发明内容：

为了克服上述现有技术的缺点，本发明提出一种多药物可控负载梯度再生骨支架的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一，成形材料的配置：多药物可控负载再生梯度骨支架的构建需要宏观梯度骨支架和载药电纺纳米纤维的制备，其制备材料有水凝胶材料，如海藻酸钠和明胶的配比和温度对成形宏观支架的搭接具有重要影响；共混载药和同轴载药电纺材料的选择以及药物的选择和含量，其中药物加载方式直接影响到药物的缓释机制，实现支架上药物的分时缓释，满足骨缺损修复不同阶段的生物化学需求；

步骤二，支架制备的路径规划：根据所需再生骨支架设计支架的层高、层数、纤维间距以及电纺纤维的沉积位置和时间等参数，将一系列参数输入上位机中，利用生物3D打印复合成形试验平台复合挤出成形工艺和静电纺丝技术制备载药再生骨支架；

步骤三，制备宏观骨支架：根据路径规划和支架梯度结构分析与优化结果，利用微量泵挤出水凝胶材料和运动平台的运动，使得支架纤维沉积在运动平台上且每两层成形支架的纤维间距呈现梯度变化，后置处理中要设置合理供料速度、平台运动速度的匹配参数，即可得到宏观骨支架；

步骤四，复合载药电纺丝的再生骨支架：在每成形一定层数的宏观支架后，运动平台移动到静电纺丝工位，将静电纺丝溶液置于注射器中，固定在多喷头切换装置上，连接高压电源，调节***装置的有关参数，如电压、供料速度、接收距离、电纺时间等，根据前置处理的路径规划结果，控制电纺纤维在支架上的沉积位置和静电纺丝工位多喷头装置的切换，实现共混载药和同轴载药的自由切换，最终得到多种药物可控负载的再生骨支架。

优选地，所述步骤一中的水凝胶材料可以是纳米羟基磷灰石、壳聚糖、海藻酸钠、明胶、电纺材料明胶、PVA、PCL、壳聚糖，纳米羟基磷灰石、壳聚糖、海藻酸钠、明胶都为可降解材料，电纺材料明胶、PVA、PCL、壳聚糖都为可降解高分子聚合物。

优选地，所述步骤一中的药物为可分为抗生素类和促进骨生成蛋白生长因子。

优选地，所述不静电纺丝技术实现多种药物的可控负载，由于共混载药和同轴载药的药物释放机制不同导致药物的分时释放，通过生物3D打印复合成形试验平台的静电纺丝工位多喷头装置的自由切换，实现共混电纺和同轴电纺在支架上的复合，根据前置处理的路径规划实现不同载药电纺纤维在支架上预定位置的复合，实现多种药物在支架上的可控负载。

优选地，所述静电纺丝工位多喷头装置的接收距离为10-20cm，电压为10-15kV，供料速度为500-1500µL/h，挤出成型时供料速度为0.2ml/min-0.4ml/min，接收平台水平运动速度为15-25mm/s。

优选地，所述宏观骨支架的挤出成形呈现梯度结构，通过前置处理改变每层纤维间距，调整支架由里向外不同孔隙尺寸的分布，实现支架孔隙率和孔尺寸的变化，以此调控药物在支架上的释放和扩散。

本发明与现有技术相比较具有以下突出实质性特点和显著技术进步：本发明所述基于挤出成形工艺和静电纺丝技术的药物可控负载再生梯度骨支架制备方法，主要目的是针对人工支架因缺乏梯度物理结构和生化因子而不利于多组织再生的问题，提出了一种具有材料、结构和生长因子梯度的再生骨支架成形方法。本发明的宏观骨支架的成形采用挤出成形工艺制备具有不同纤维间距或孔隙尺寸的结构梯度；支架的不同层沉积静电纺丝制备的载药纤维，利用宏观骨支架层间的不同孔隙率形成了生长因子的梯度释放，提高了支架与自体骨连接的强度及稳定性；该支架的材料具有良好的生物相容性，并且复合了诱导因子，在组织重建中有利于诱导支架向骨软骨多层界面的转化。

附图说明

图1为本发明使用的生物3D打印复合成形试验平台的结构示意图。

图2为本发明的工艺路径规划示意图。

图3为宏观梯度再生骨支架的结构示意图。

图4为多药物可控负载梯度再生骨支架的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实例对本发明作进一步详细说明。

本发明多药物可控负载梯度再生骨支架的制备方法旨在构建物理结构和化学成分上都呈现梯度变化的复合再生骨支架制备方法，该方法将静电纺丝技术与3D打印挤出成形技术结合，通过共混载药电纺丝和同轴载药电纺丝技术构建药物的纳米纤维载体，并将其可控复合在梯度宏观骨支架上，实现多种药物的可控负载和后期的梯度释放。利用静电纺丝技术在生长因子时间控释方面展现出独特优势，形成的纳米级纤维网结构与细胞外基质环境非常接近，能够实现对细胞迁移，以及细胞粘附，增殖与生长的双重介导，其中形成的共混静电纺丝载药可实现药物的前期突释和有效缓释，满足需要药物前期释放的情况，同轴纳米纤维载体能有效避免生长因子失活和低剂量长期缓释。通过挤出成形技术和载药静电纺丝技术的有效综合方法，形成由载药纳米纤维膜与生物结构体复合的药物控释***；通过宏观支架挤出成形构建结构梯度的骨支架，使得载药电纺纤维出现差异性的降解速度，实现骨再生支架在物理结构的连续梯度分布和药物连续梯度释放。

以上制备方法是基于自主设计的生物3D打印复合成形试验平台，整个平台可分为两大***：生物 CAD/CAM***和生物3D打印综合成形***，生物CAD/CAM***主要负责再生骨支架建模、路径规划和后置处理工作，生物3D 打印综合成形***主要负责再生骨支架的成形打印工作，平台组成架构如图1 所示。该***的组成包括人机交互模块、检测模块、控制模块、驱动模块、执行模块五部分，具体元件包括计算机控制***1、试验平台控制箱2、微量泵手动控制器3、高压电源4、挤出成形工位5、接收平台6、运动模组7、运动平台8、多喷头切换装置9、静电纺丝工位10。利用该平台进行梯度复合支架的制备，即利用3D打印喷头成形支架结构，成形的宏观孔的孔径呈梯度变化；同时利用静电纺丝喷头成形支架的载药微观结构，二者交替往复成形三维梯度复合结构。

多药物可控负载再生梯度骨支架的构建可分为宏观梯度骨支架和载药微尺度纤维的制备，其制备材料有凝胶材料A和电纺材料溶液B、C，其中成形宏观骨支架凝胶材料A为相同质量的纳米羟基磷灰石和壳聚糖或海藻酸钠的粉末均匀混合配置成壳聚糖或海藻酸钠质量分数为3%-5%的混合溶液，然后与质量分数为8%-20%的明胶溶液等质量混合制成骨支架材料；同轴电纺材料溶液B为两种，一种壳层材料溶液为N，N-甲基甲酰胺和二氯甲烷按体积比1：1混合的混合溶液为溶剂配置的聚己内酯（PCL）质量分数为10%的溶液或质量分数为15%的明胶水溶液，另一种芯层材料溶液为以聚乙烯醇（PVA）或壳聚糖为溶质的质量分数为5%-8.8%的水溶液，同时在溶液中添加骨形态发生蛋白（BMP）0.001g/mL-0.06mg/mL；共混电纺材料溶液C为将PVA在水浴中溶解于去离子水配制%8.8PVA溶液，加入%0.5-2%的抗生素的PVA溶液。

本发明多药物可控负载梯度再生骨支架的制备方法在每层栅格宏观结构上沉积一层载药电纺纤维，利用多喷头电纺装置实现多种药物的加载，具有宏微观结构支架构成多级孔隙结构、贯通的大孔结构和高孔隙率的组织工程骨支架，且该再生骨支架是由可降解的高分子聚合物材料所制备。

本发明多药物可控负载梯度再生骨支架的制备方法包括以下步骤：

步骤一，成形材料的配置：多药物可控负载再生梯度骨支架的构建需要宏观梯度骨支架和载药电纺纳米纤维的制备，其制备材料有水凝胶材料，如海藻酸钠和明胶的配比和温度对成形宏观支架的搭接具有重要影响；共混载药和同轴载药电纺材料的选择以及药物的选择和含量，其中药物加载方式（共混或同轴加载）直接影响到药物的缓释机制，实现支架上药物的分时缓释，满足骨缺损修复不同阶段的生物化学需求；其中，步骤一中的水凝胶材料可以是纳米羟基磷灰石、壳聚糖、海藻酸钠、明胶、电纺材料明胶、聚乙烯醇（PVA）、聚己内酯（PCL）、壳聚糖，纳米羟基磷灰石、壳聚糖、海藻酸钠、明胶都为可降解材料，电纺材料明胶、PVA、PCL、壳聚糖都为可降解高分子聚合物。步骤一中的药物为可分为抗生素类（如庆大霉素、***等），该类药物的载入可以减少骨支架在移植过程中由于细菌感染引起的炎性反应；另一类为促进骨生成蛋白生长因子（如骨形态发生蛋白BMP），能够通过生长因子的释放调控成骨细胞的表达和骨生成。

步骤二，支架制备的路径规划：根据所需再生骨支架设计支架的层高、层数、纤维间距以及电纺纤维的沉积位置和时间等参数，将一系列参数输入上位机中，利用生物3D打印复合成形试验平台（如图1所示）复合挤出成形工艺和静电纺丝技术制备载药再生骨支架；其中静电纺丝技术实现多种药物的可控负载，由于共混载药和同轴载药的药物释放机制不同导致药物的分时释放，通过生物3D打印复合成形试验平台的静电纺丝工位多喷头装置的自由切换，实现共混电纺和同轴电纺在支架上的复合，根据前置处理的路径规划实现不同载药电纺纤维在支架上预定位置的复合，实现多种药物在支架上的可控负载。静电纺丝工位多喷头装置的接收距离为10-20cm，电压为10-15kV，供料速度为500-1500µL/h，挤出成型时供料速度为0.2ml/min-0.4ml/min，接收平台水平运动速度为15-25mm/s。

步骤三，制备宏观骨支架：根据路径规划和支架梯度结构分析与优化结果，利用微量泵11挤出水凝胶材料和运动平台的运动，使得支架纤维沉积在运动平台上且每两层成形支架的纤维间距呈现梯度变化，后置处理中要设置合理供料速度、平台运动速度的匹配参数，即可得到宏观骨支架（如图3所示）；其中，宏观骨支架的挤出成形呈现梯度结构，通过前置处理改变每层纤维间距，调整支架由里向外不同孔隙尺寸的分布，实现支架孔隙率和孔尺寸的变化，以此调控药物在支架上的释放和扩散。

步骤四，复合载药电纺丝的再生骨支架：在每成形一定层数的宏观支架后，运动平台移动到静电纺丝工位（如图1所示），将静电纺丝溶液置于注射器中，固定在多喷头切换装置12上（如图2所示），连接高压电源，调节***装置的有关参数，如电压、供料速度、接收距离、电纺时间等，根据前置处理的路径规划结果，控制电纺纤维在支架上的沉积位置和静电纺丝工位多喷头装置的切换，实现共混载药和同轴载药的自由切换，最终得到多种药物可控负载的再生骨支架（如图4所示）。多药物可控负载梯度再生骨支架具有宏观结构的梯度结构和微尺度的载药电纺纳米纤维，通过孔隙率的变化和共混载药与同轴载药实现了药物的时空可控释放。

本发明提出的一种多药物可控负载梯度再生骨支架的制备方法，具体包括以下步骤：

1)配置用于挤出成形的凝胶材料A，材料A为相同质量的纳米羟基磷灰石和壳聚糖或

海藻酸钠、明胶的粉末均匀混合配置成壳聚糖或海藻酸钠质量分数为3%-5%的混合溶液，然后与质量分数为8%-20%的明胶溶液等质量混合制成骨支架材料；配置用于载药同轴和共混电纺纳米纤维的材料溶液B、C，材料溶液B为两种，一种壳层材料溶液为N，N-甲基甲酰胺和二氯甲烷按体积比1：1混合的混合溶液为溶剂配置的聚己内酯（PCL）质量分数为10%的溶液或质量分数为15%的明胶水溶液，另一种芯层材料溶液为以聚乙烯醇（PVA）或壳聚糖为溶质的质量分数为5%-8.8%的水溶液，同时在溶液中添加骨形态发生蛋白（BMP）0.001g/mL-0.06mg/mL；共混电纺材料溶液C为将PVA在水浴中溶解于去离子水配制%8.8PVA溶液，加入%0.5-2%的抗生素的PVA溶液；

2)为了成形梯度复合结构支架，首先要设计制备多药物可控负载再生梯度骨支架的路径规划，在生物3D打印复合成形***的前置处理阶段设定成形支架的特征参数：层高h，成形支架的纤维间距λ，纤维宽度，电纺时间t，前置处理生成相应的成形支架的加工路径文件后，后置处理***设置供料速度、平台运动速度和高压直流电源的电压设定等。

3)将挤出成形材料A装入10mL一次性注射器中，然后装载于自主生物3D打印设备第三轴Z轴上，在挤出成形工位设置喷头与接收平台之间的合理间距，通过接收平台在X、Y轴方向上的运动沉积成形梯度宏观支架；

4)同时将共混载药和同轴载药电纺材料装入10mL一次性注射器中，然后装载于自主生物3D打印设备的第四轴Z轴的多喷头切换装置上，在静电纺丝工位设置喷头与接收板之间的间距为10-20cm，任意切换两种电纺工艺同时在支架上沉积共混电纺纤维膜或同轴载药电纺纤维膜，每层电纺时间为3-5min，得到“夹心”多药物可控负载再生梯度骨支架。

上述步骤中所述挤出成形供料装置为微量注射泵，供料速度为0.2ml/min-0.4ml/min；静

电纺丝供料装置为微量注射泵，芯层电纺溶液供给速度为500µL/h-1500µL/h，壳层电纺溶液供给速度为1000µL/h-3000µL/h，喷头处供电电压达到10kV-15kV；共混电纺溶液的供给速度为1000µL/h-3000µL/h。所述挤出成形喷头或接收平台运动过程中挤出喷头与接受平台的相对速度为15-25mm/s。

本发明的第一个例子如下：设计微纳结构的三维再生骨支架模型如图3，包括挤出工位的宏观支架的整体尺寸30mm×30mm×6mm，第一、二层行距设定为1.5mm，以后每两层增加0.5mm，层层堆积至8层形成四个梯度，电纺纤维的在每两层沉积和时间为5min；配置宏观支架成形材料和电纺溶液，挤出成形的凝胶材料A为相同质量的纳米羟基磷灰石和海藻酸钠的粉末均匀混合配置成海藻酸钠质量分数为3%的混合溶液，然后与质量分数为8%的明胶溶液等质量混合制成骨支架材料；配置用于载药同轴电纺纳米纤维的材料溶液B，壳层材料溶液为N，N-甲基甲酰胺和二氯甲烷按体积比1：1混合的混合溶液为溶剂配置的聚己内酯（PCL）质量分数为10%的溶液，芯层材料溶液为以聚乙烯醇（PVA）为溶质的质量分数为5%的水溶液，同时在溶液中添加骨形态发生蛋白（BMP）0.001g/mL；配置用于载药共混电纺纳米纤维的材料溶液C为以聚乙烯醇（PVA）为溶质的质量分数为8.8%的水溶液，同时在溶液中添加庆大霉素硫酸盐原料药至0.5%。根据模型规划生物3D打印成形***的路径，运动接收平台运动至工位A位置，多喷头切换至共混电纺，静电纺丝供料速度为1200µL/h，喷头加载的电压10kV，在挤压力和静电场力的作用下，电纺丝喷头喷射出纳米纤维，在接收平台上沉积共混载药电纺纤维，该共混载药纤维只沉积在支架的底部和顶层。平台运动至挤出成形工位B位置，挤出成形供料速度0.4ml/min，接收平台运动速度0.5 ml/min，在均匀挤压力的作用下，3D打印成形喷头与接受平台共同作用，在共混载药纤维膜上成形支架的宏观结构，宏观支架每成形两层之后，接收平台移动到工位A位置，多喷头装置切换到同轴电纺喷头，芯层电纺溶液供给速度为800µL/h，壳层电纺溶液供给速度为1600µL/h，喷头处供电电压达到15kV，在支架上沉积同轴载生长因子纳米纤维。层层堆积至8层形成四个梯度，最终得到具有生物活性、结构梯度和生长因子梯度的再生骨支架如图4。

本发明的第二个例子如下：设计微纳结构的三维再生骨支架模型如图3，包括挤出工位的宏观支架的整体尺寸30mm×30mm×6mm，第一、二层行距设定为1.5mm，以后每两层增加0.5mm，层层堆积至8层形成四个梯度，电纺纤维的在每两层沉积和时间为5min；配置宏观支架成形材料和电纺溶液，挤出成形的凝胶材料A为明胶60℃水浴溶解于去离子水配制成8%明胶溶液，壳聚糖溶解于去离子水配制%5壳聚糖溶液，搅拌均匀后等质量混合配置成水凝胶骨支架材料；配置用于载药同轴电纺纳米纤维的材料溶液B，壳层材料溶液为N，N-甲基甲酰胺和二氯甲烷按体积比1：1混合的混合溶液为溶剂配置的聚己内酯（PCL）质量分数为10%的溶液，芯层材料溶液为以聚乙烯醇（PVA）为溶质的质量分数为5%的水溶液，同时在溶液中添加骨形态发生蛋白（BMP）0.001g/mL；配置用于载药共混电纺纳米纤维的材料溶液C为以聚乙烯醇（PVA）为溶质的质量分数为8.8%的水溶液，同时在溶液中添加庆大霉素硫酸盐原料药至0.5%。根据模型规划生物3D打印成形***的路径，运动接收平台运动至工位A位置，多喷头切换至共混电纺，静电纺丝供料速度为1200µL/h，喷头加载的电压10kV，在挤压力和静电场力的作用下，电纺丝喷头喷射出纳米纤维，在接收平台上沉积共混载药电纺纤维，该共混载药纤维只沉积在支架的底部和顶层。平台运动至挤出成形工位B位置，挤出成形供料速度0.3ml/min，接收平台运动速度0.2 ml/min，在均匀挤压力的作用下，3D打印成形喷头与接受平台共同作用，在共混载药纤维膜上成形支架的宏观结构，宏观支架每成形两层之后，接收平台移动到工位A位置，多喷头装置切换到同轴电纺喷头，芯层电纺溶液供给速度为800µL/h，壳层电纺溶液供给速度为1600µL/h，喷头处供电电压达到15kV，在支架上沉积同轴载生长因子纳米纤维。层层堆积至8层形成四个梯度，最终得到具有生物活性、结构梯度和生长因子药物梯度的再生骨支架如图4。

Claims (2)

1.多药物可控负载梯度再生骨支架制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：设计微纳结构的三维再生骨支架模型，包括挤出工位的宏观支架的整体尺寸30mm×30mm×6mm，第一、二层行距设定为1.5mm，以后每两层增加0.5mm，层层堆积至8层形成四个梯度，电纺纤维的在每两层沉积和时间为5min；

配置宏观支架成形材料和电纺溶液，挤出成形的凝胶材料A为相同质量的纳米羟基磷灰石和海藻酸钠的粉末均匀混合配置成海藻酸钠质量分数为3％的混合溶液，然后与质量分数为8％的明胶溶液等质量混合制成骨支架材料；

配置用于载药同轴电纺纳米纤维的材料溶液B，壳层材料溶液为N，N-甲基甲酰胺和二氯甲烷按体积比1：1混合的混合溶液为溶剂配置的聚己内酯质量分数为10％的溶液，芯层材料溶液为以聚乙烯醇为溶质的质量分数为5％的水溶液，同时在溶液中添加骨形态发生蛋白0.001g/mL；

配置用于载药共混电纺纳米纤维的材料溶液C为以聚乙烯醇为溶质的质量分数为8.8％的水溶液，同时在溶液中添加庆大霉素硫酸盐原料药至0.5％；根据模型规划生物3D打印成形***的路径，运动接收平台运动至工位A位置，多喷头切换至共混电纺，静电纺丝供料速度为1200μL/h，喷头加载的电压10kV，在挤压力和静电场力的作用下，电纺丝喷头喷射出纳米纤维，在接收平台上沉积共混载药电纺纤维，该共混载药纤维只沉积在支架的底部和顶层；

平台运动至挤出成形工位B位置，挤出成形供料速度0.4ml/min，接收平台运动速度0.5ml/min，在均匀挤压力的作用下，3D打印成形喷头与接受平台共同作用，在共混载药纤维膜上成形支架的宏观结构，宏观支架每成形两层之后，接收平台移动到工位A位置，多喷头装置切换到同轴电纺喷头，芯层电纺溶液供给速度为800μL/h，壳层电纺溶液供给速度为1600μL/h，喷头处供电电压达到15kV，在支架上沉积同轴载生长因子纳米纤维；层层堆积至8层形成四个梯度，最终得到具有生物活性、结构梯度和生长因子梯度的再生骨支架。

2.多药物可控负载梯度再生骨支架制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：设计微纳结构的三维再生骨支架模型，包括挤出工位的宏观支架的整体尺寸30mm×30mm×6mm，第一、二层行距设定为1.5mm，以后每两层增加0.5mm，层层堆积至8层形成四个梯度，电纺纤维的在每两层沉积和时间为5min；

配置宏观支架成形材料和电纺溶液，挤出成形的凝胶材料A为明胶60℃水浴溶解于去离子水配制成8％明胶溶液，壳聚糖溶解于去离子水配制5％壳聚糖溶液，搅拌均匀后等质量混合配置成水凝胶骨支架材料；

配置用于载药同轴电纺纳米纤维的材料溶液B，壳层材料溶液为N，N-甲基甲酰胺和二氯甲烷按体积比1：1混合的混合溶液为溶剂配置的聚己内酯质量分数为10％的溶液，芯层材料溶液为以聚乙烯醇为溶质的质量分数为5％的水溶液，同时在溶液中添加骨形态发生蛋白0.001g/mL；

配置用于载药共混电纺纳米纤维的材料溶液C为以聚乙烯醇为溶质的质量分数为8.8％的水溶液，同时在溶液中添加庆大霉素硫酸盐原料药至0.5％；

根据模型规划生物3D打印成形***的路径，运动接收平台运动至工位A位置，多喷头切换至共混电纺，静电纺丝供料速度为1200μL/h，喷头加载的电压10kV，在挤压力和静电场力的作用下，电纺丝喷头喷射出纳米纤维，在接收平台上沉积共混载药电纺纤维，该共混载药纤维只沉积在支架的底部和顶层,平台运动至挤出成形工位B位置，挤出成形供料速度0.3ml/min，接收平台运动速度0.2ml/min，在均匀挤压力的作用下，3D打印成形喷头与接受平台共同作用，在共混载药纤维膜上成形支架的宏观结构，宏观支架每成形两层之后，接收平台移动到工位A位置，多喷头装置切换到同轴电纺喷头，芯层电纺溶液供给速度为800μL/h，壳层电纺溶液供给速度为1600μL/h，喷头处供电电压达到15kV，在支架上沉积同轴载生长因子纳米纤维,层层堆积至8层形成四个梯度，最终得到具有生物活性、结构梯度和生长因子药物梯度的再生骨支架。