CN104872379B

CN104872379B - 一种在玉米-豆粕型日粮中添加鱼溶浆的发酵物及其发酵方法

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Publication number: CN104872379B
Application number: CN201510250140.9A
Authority: CN
Inventors: 马成; 李慧芬; 王娇; 张明俊; 赵志强; 王晓伟
Original assignee: Qingdao Shangde Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Shangde Biotechnology Co ltd
Priority date: 2015-05-18
Filing date: 2015-05-18
Publication date: 2018-07-24
Anticipated expiration: 2035-05-18
Also published as: CN104872379A

Abstract

本发明提供了一种在玉米‑豆粕型日粮中添加鱼溶浆的发酵物及其发酵方法，各组分添加量按每克玉米‑豆粕型日粮分别为：布拉酵母2×10⁹个/g；解淀粉芽杆菌HFJ‑7 4×10⁹个/g；植物乳杆菌5×10⁹个/g；α‑淀粉酶20U/g；纤维素酶10U/克；NSP复合酶10U/g；蛋白酶100U/g；添加鱼溶浆，调节料水比，密封发酵。本发明工艺简单，成本低廉，最终产品低温烘干，经发酵后呕吐毒素和霉菌毒素均未检测到，抗原蛋白明显减少，同时富含大量益生菌及其代谢产物，可以有效抑制致病性大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长繁殖，提高动物免疫力，并且在添加鱼溶浆后饲料有浓郁的鱼腥味，对动物有良好的诱食性。

Description

一种在玉米-豆粕型日粮中添加鱼溶浆的发酵物及其发酵方法

技术领域

本发明属于畜牧饲料技术领域，具体涉及一种在玉米-豆粕型日粮中添加鱼溶浆的发酵物及其发酵方法。

背景技术

我国畜禽是以玉米-豆粕型饲料为主，其中玉米是畜禽主要的能量来源，豆粕是畜禽日粮中蛋白质的主要来源。

玉米在所有谷物中能值最高，是动物主要的能量来源，淀粉的消化率很高，但是纤维素和非淀粉多糖是影响玉米消化率的主要因素。

豆粕是饲料生产中应用最多的植物蛋白质原料。由于大豆品种和加工条件的不同，其养分和抗营养因子含量有较大差异。豆粕中抗营养因子主要有蛋白酶抑制剂、植物凝集素、单宁、大豆抗原蛋白和不良寡糖等因素，其中大豆抗原蛋白和寡糖有良好的热稳定性，它们会引起腹泻、胀气等不良症状，是豆粕在饲料应用中的主要影响因素。

鱼粉具有必需氨基酸和脂肪酸高，碳水化合物含量低，适口性好，抗营养因子少以及能够被畜禽动物有很好的吸收等特点。但是现在水体的富营养化和集约化水产养殖业的发展，鱼用人工配合饲料的应用也日渐广泛，鱼粉的需求量巨大；另外海洋环境的不断恶化和人类的无序捕捞，致使鱼粉的产量急剧下降。鱼溶浆蛋白是有新鲜鱼类在制作鱼粉的过程中压榨出的鱼溶浆的液体，经浓缩、酶解后干燥而成。

发明内容

本发明提供了一种在玉米-豆粕型日粮中添加鱼溶浆的发酵物及其发酵方法，在现今主要的畜禽日粮玉米—豆粕型日粮中加入鱼溶浆后进行发酵，利用该方法发酵玉米—豆粕型日粮，具有鱼腥气味，能调高饲料的适口性，富含大量益生菌及其代谢产物，抑制有害菌生长，增加动物的免疫力，高小肽含量，能有效提高饲料的利用率。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了在玉米-豆粕型基础日粮中添加鱼溶浆的发酵方法，它包括以下步骤：

(1)在玉米-豆粕型基础日粮中添加以下组分：布拉酵母含量不低于2×10⁹个/g；解淀粉芽孢杆菌HFJ-7含量不低于4×10⁹个/g；植物乳杆菌含量不低于5×10⁹个/g；α-淀粉酶不低于20U/g；纤维素酶酶不低于10U/g；NSP复合酶不低于10U/g；蛋白酶添加量不低于100U/g；按照占所述基础日粮总质量的质量比为20%-50%添加鱼溶浆；

(2)加水调节料水质量比为1:0.7-1:1，控制温度在30℃-50℃密封发酵；

(3)发酵完成采用低温60℃烘干。

所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，其保藏编号为CGMCC No. 10011。

含有所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉的制备过程如下：

（1）将解淀粉芽孢杆菌HFJ-7接种到装有种子培养基的灭菌种子罐中，37℃培养10h，形成种子培养液，所述种子培养基组分包括：糖蜜，24.5~25.0 g/L；蛋白胨，13.5~13.7g/L；磷酸二氢钾，1.7~1.8 g/L；柠檬酸钠，1.5~1.6 g/L；硝酸铵，1.5~1.6 g/L；硫酸镁，0.5~0.52 g/L；调节起始pH 至7.2；

（2）将所述种子培养液转接至装有发酵培养基的生产罐进行发酵培养，37℃培养24h，当孢子率超过95%时，停罐，获得发酵液，所述发酵培养基组成包括：豆粕粉，25.0~25.5g/L；玉米浆干粉，18.5~19.4 g/L；氯化钠，4.0~4.2 g/L；磷酸二氢钠，2.8~2.9 g/L；磷酸氢二钾，1.2~1.3 g/L；氯化镁，0.55~0.58 g/L；硫酸锰，0.15~0.16 g/L；中性蛋白酶，2.0~2.1g/L；糖化酶，1.5~1.6 g/L；消泡剂，1.3~1.4 g/L；调节起始pH 至 7.4，所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7发酵液的菌量达到450×10⁸CFU/g~500×10⁸CFU/g；

（3）将所述发酵液添加载体后进行喷雾干燥，获得含菌量2000×10⁸ ~2200×10⁸CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉，所述载体为轻质碳酸钙，添加载体的量占发酵液的质量比例为：10%-15%。

对上述技术方案的进一步改进：所述玉米-豆粕型基础日粮中玉米和豆粕的质量比为4:1-3:2。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（1）中添加的蛋白酶是按酶添加量碱性蛋白酶：中性蛋白酶：酸性蛋白酶=2:5:3的三种组分的混合物。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（2）中密封发酵48h，密封发酵中好氧发酵12h，厌氧发酵36h。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（3）中喷雾干燥的进风温度为145℃-150℃，出风温度为65℃-70℃。

本发明还提供了所述的发酵方法制得的发酵物。所述发酵物的pH3-5，乳酸含量10-20%，小肽含量20-30%，活菌数高达9×10¹⁰cfu/g~3.8×10¹²cfu/g。

本发明与现有技术相比，具有以下创新和有效功效；

1、本发明中的发酵方法于60℃下低温烘干，可以保留大量有益活菌，同时抑制有害菌生长，增加动物肠道的健康，提高动物免疫力；

2、发酵过程中难消化的蛋白可被降解为易吸收的小肽，含量高达20%，易于动物吸收，可以显著提高饲料利用率。

3、本发明制得的发酵物中乳酸含量丰富，含量高达10%-15%，提高了动物对饲料的采食量。

4、本发明添加低成本的鱼溶浆进行发酵，能有效改善饲料的气味，提高动物的采食量，同时还能减少饲料中鱼粉的用量。

附图说明

图1是解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉的生产工艺流程图；

图2是发酵和未发酵玉米—豆粕型日粮的大分子蛋白实验结果；

图3是发酵和未发酵玉米—豆粕型日粮的不良寡糖实验结果；

图4是发酵和未发酵玉米—豆粕型日粮的大肠杆菌抑菌实验结果。

具体实施方式

本发明结合以下具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

一、HFJ-7的分离筛选

2012年1月至2012年3月，从山东省潍坊市寿光市上口镇10家辣椒蔬菜大棚取30个辣椒根际土样本。土样分别充分研磨，于75℃水浴内加热处理20min，然后用无菌生理盐水中1000倍稀释，于营养琼脂NA平板上稀释涂布，挑取单菌落划线纯化，共筛选出68株纯菌，经镜检均为芽孢杆菌，其中包括菌株HFJ-7。

采用平板对峙的方法，以立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉等土传病害病原真菌为靶标病原真菌，考察68株芽孢杆菌之间病原真菌拮抗特性的差异。先用打孔器获得6mm直径的病原菌菌块，接于PDA平板中央，在平皿四周，垂直据中心约3cm出，接种靶标菌菌线，长度约为1cm。考虑到不同病原真菌生长速度不同，立枯丝核菌预培养8h、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌预培养24h，然后每平皿接种4株待试菌株，28℃培养4d后，考察解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他芽孢杆菌相比，对多种土传病害病原真菌的拮抗特性。记录抑菌带宽度，即两种菌平行生长之间的无菌区域宽度。根据拮抗带的宽窄，选取对病原真菌有较强拮抗能力的菌株。

筛选结果显示，15株菌对立枯丝核菌有较强拮抗作用，13株菌对尖孢镰刀菌有较强拮抗作用，10株菌对根腐菌有较强拮抗作用，9株菌对黄瓜枯萎病病原菌有较强拮抗作用，7株菌对辣椒疫霉病原菌有较强拮抗作用。仅有4株菌同时对5种病原真菌靶标菌均具有拮抗作用，分别为：解淀粉芽孢杆菌HFJ-7、枯草芽孢杆菌G4和G11、地衣芽孢杆菌D2。其中，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与枯草、地衣、侧孢等芽孢杆菌相比，可对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌等多种土传病害病原真菌，产生明显的抑菌带，均大于等于5mm，其中对黄瓜枯萎病病原菌的抗性最强，抑菌带宽度高达8mm。

经细菌生理生化方法初步鉴定，菌株HFJ-7为芽孢杆菌属，其生物学特性：革兰氏染色阳性，在营养琼脂平板上形成的菌落直径约3-3.5mm，边缘不整齐，中间褶皱，淡黄色。菌体形态呈杆状，芽孢椭圆形，端生，0.84×0.52μm。

二、HFJ-7的分子遗传学分类鉴定

首先提取菌株HFJ-7的DNA，以该DNA为模板，16S rRNA通用引物为引物，对16SrRNA片段进行扩增，扩增片段进行序列测定。测序结果用Blast软件与GenBank中相关属种的16S rRNA序列进行比对，结果显示该菌株16S rRNA序列与GenBank基因库中芽孢杆菌属中的Bacillus pumilus的16s rRNA序列同源度最高，同源率达到99%。通过DNAMAN6.0对Genbank中已有的芽孢杆菌属的16S rRNA序列进行遗传进化分析，结果显示，菌株S3 16SrRNA与Bacillus amyloliquefaciens同源性最高，判定该菌株为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌。

将筛选到的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2014年11月19日；解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens的保藏编号为CGMCC No. 10011。

三、解淀粉芽孢杆菌菌粉的制备

本发明所述解淀粉芽孢杆菌菌粉是由自主分离筛选的菌株，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7发酵后喷雾而成，其制备过程如图1所示，具体步骤如下：

（1）种子罐培养

所述的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌株，以NA培养基进行划线培养，37℃培养24h，保证孢子率>99%的，作为一级种子。将一级种子，接种到装有种子培养基的灭菌种子罐中，37℃培养10h，形成大量营养体，作为二级种子培养液；活化为100%孢子率的种子后，接种到装有种子培养基的灭菌种子罐中，37℃培养10h，形成大量营养体，作为种子培养液。种子培养基组成（g/L）：糖蜜，24.5；蛋白胨，13.5；磷酸二氢钾，1.7；柠檬酸钠，1.5；硝酸铵，1.5；硫酸镁，0.5；用50%氢氧化钠流加，调节起始pH 至7.2；种子罐体积为500L，培养基定容至300L，实消条件：恒温121℃保持30min；培养条件：恒温37℃+1℃，罐压0.05Mpa，转速0-6h130rpm、6-10h 160rpm；通风量0-6h 5.1 m³/h、6-10h 8.8 m³/h。

（2）发酵罐培养

将种子罐中种子培养液转接至装有发酵培养基的30吨生产罐进行发酵培养，37℃培养24h，当孢子率超过95%时，停罐，获得发酵液。发酵培养基组成（g/L）：豆粕粉，25.0；玉米浆干粉，18.5；氯化钠，4.0；磷酸二氢钠，2.8；磷酸氢二钾，1.2；氯化镁，0.55；硫酸锰，0.15；中性蛋白酶，2.0；糖化酶，1.5；消泡剂，1.3；用50%氢氧化钠流加，调节起始pH 至7.4；种子罐体积为30000L，培养基定容至21000L，实消条件：恒温116℃保持30min；培养条件：恒温37℃+1℃，罐压0.05Mpa，转速0-10h 140rpm、10-18h 180rpm、18-24h 160rpm；通风量0-10h 165m³/h、10-18h 215m³/h、18-24h 180m³/h。所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7发酵液在放罐时的菌量一般达到450×10⁸CFU/g~500×10⁸CFU/g。

（3）将发酵液与载体混合进行后处理，获得解淀粉芽孢杆菌菌菌粉。所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7后处理过程：喷雾干燥塔，LPG-6000型，进风145℃-150℃，出风65℃-70℃，载体为轻质碳酸钙，添加载体占发酵液的质量比例为：10%-15%。所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7筛分与质检过程：超过90%菌粉均过80目筛，并参考国标GBT 26428-2010饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测，测定解淀粉芽孢杆菌菌量，质检合格，制备为解淀粉芽孢杆菌菌粉。所述解淀粉芽孢杆菌HJF-7菌粉中含菌量范围2000×10⁸~2200×10⁸CFU/g。

实施例2

取玉米40kg和豆粕10kg，两者粉碎后混合均匀。按照原料质量添加布拉酵母不低于2×10⁹ 个/g，解淀粉芽杆菌HFJ-7不低于4×10⁹个/g，植物乳杆菌不低于5×10⁹个/g，α-淀粉酶不低于20U/g，纤维素酶不低于10U/g，NSP复合酶不低于10U/g，蛋白酶不低于100U/g，将10kg鱼溶浆添加到35kg水中得到混合液，将混合液直接加入到混合好的所述饲料中搅拌均匀，40℃密封发酵2天。

产品发酵结束后60℃低温烘干，pH4.5，乳酸含量10.5%，小肽含量20.1%，活菌数高达9×10¹⁰cfu/g。

本发明所用的鱼溶浆主要指标（购买于山东荣成）：pH 5.71；水分 45.67％；粗蛋白 36.78％；酸溶蛋白 65.99％；灰分 12.58％；挥发性盐基氮（VBN） 332.64mg/100g；氨基酸总和：32.5%。

由以上指标可以看出鱼溶浆蛋白含量很高，并且大部分是小分子蛋白。由于鱼溶浆为鱼粉加工的副产物，因此具有强烈的鱼腥味，能提高畜禽的诱食性，因此开发鱼溶浆的回收和利用具有客观的经济效益和社会效益。

实施例3

取玉米30kg和豆粕20kg，两者粉碎后混合均匀。按照原料质量添加布拉酵母2×10⁹ 个/克，解淀粉芽杆菌(HFJ-7)4×10⁹个/克，植物乳杆菌5×10⁹个/克，α-淀粉酶20U/克，纤维素酶10U/克，NSP复合酶10U/g，蛋白酶100U/g，将25kg鱼溶浆添加到45kg水中得到混合液，将混合好的混合液直接加入到混合好的所述饲料中搅拌均匀，40℃密封发酵2天。

产品发酵结束后60℃低温烘干，pH3.8，乳酸含量18.5%，小肽含量25.3%，活菌数高达3.8×10¹²cfu/g。

实施例4、发酵和未发酵玉米—豆粕型日粮相关比较

1）大分子蛋白

①分别取经发酵和未发酵的饲料0.2g，加30ml 0.6%KOH，常温下磁力搅拌1h，4000rpm，离心10min，取上清；

②100ul上清+100ul loading buffer，混匀后煮沸8min；

③取10ul，在12% SDS-pAGE胶上点样，在5%浓缩胶内保持恒流15mA，约40-50min；进入分离胶，调节电流至20mA，直至前沿接近地面1cm处；

④剥胶后染色2h，脱色过夜；

实验结果见图2，从图2中可以看出：抗原蛋白是豆粕中引起仔猪腹泻的主要因素，发酵组抗原蛋白比未发酵组有明显降低。

2）不良寡糖

①分别取发酵组和为发酵组10g样品，加50ml 80%乙醇，70℃提取1h，过滤后收集清液；

②于90℃水浴内蒸发浓缩，用80%乙醇定容至150ml；

③10000rpm，离心10min，取上清，用于寡糖测定；

④TLC平板于105℃活化30min，冷却后取5ul点样，用展开剂（乙腈：冰乙酸：水=6:3:1）展开，待展开剂没顶后，取出TLC平板，用吹风机吹干表面展开剂；

⑤于105℃烘箱内烘干30min，以散尽有机溶剂，显色液（20%硫酸+0.5% 3,5—二羟基甲苯）中浸泡15s，吹风机冷风吹干表面，然后于105℃中显色3-5min，直至显出清晰糖点。

试验结果见图3所示，从图3中可以看出：不良寡糖是引起仔猪胀气的主要因素，发酵组棉籽糖和水苏糖明显减少。

3）大肠杆菌抑菌试验

①取100ul大肠杆菌菌液均匀的涂布在营养琼脂培养基上面；

②取发酵组和未发酵组样品20g，加入20ml无菌水搅拌均匀，静置15min；

③分别取静置好的上清液100ul，加到放置在大肠杆菌平板的牛津杯中；

④37℃培养24h。

试验结果见图4所示，从图4中可以看出：发酵组在经过布拉酵母、解淀粉芽孢杆菌和植物乳杆菌发酵后能产生大量有益产物，对大肠杆菌产生明显的抑菌圈，能有效抑制大肠杆菌的生长，对治疗仔猪腹泻有一定的疗效。

实施例5、养殖试验

1）腹泻率实验

将仔猪按照体重随即分成两组，每组30头。实验组为发酵玉米—豆粕型日粮，对照组为未发酵玉米—豆粕型日粮，将两组仔猪饲喂30天，记录相关数据

实验结果如表1和表2所示：

表1腹泻率实验结果

组别	实验组	对照组
			仔猪总数（头）	30	30
腹泻率	1.17%	3.17%
			死亡率	0	0

注：腹泻率=｛腹泻猪头日数/(猪头总数*饲喂天数）｝*100%

表2 喂养试验相关数据

组别	实验组	对照组
			仔猪总数（头）	30	30
平均日采食量（g/天/头）	821.1	779.2
			平均日增重（g/天/头）	456.17	397.55
料肉比	1.8	1.96

结果分析：如表1和表2所示，实验组和对照组均未发生仔猪死亡，但是实验组腹泻率明显低于对照组。在加入鱼溶浆发酵后，饲料诱食性较好，实验组平均日采食量高于对照组，实验组的料肉比也高于对照组，发酵后的玉米—豆粕型日粮有利于仔猪的消化吸收。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种在玉米-豆粕型日粮中添加鱼溶浆的发酵方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)在玉米-豆粕型基础日粮中添加以下组分：布拉酵母含量不低于2×10⁹个/g；解淀粉芽孢杆菌HFJ-7含量不低于4×10⁹个/g；植物乳杆菌含量不低于5×10⁹个/g；α-淀粉酶不低于20U/g；纤维素酶不低于10U/g；NSP复合酶不低于10U/g；蛋白酶添加量不低于100U/g；按照占所述基础日粮总质量的质量比为20%-50%添加鱼溶浆；

(3)发酵完成采用低温60℃烘干；

所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，其保藏编号为CGMCC No. 10011；

（1）将解淀粉芽孢杆菌HFJ-7接种到装有种子培养基的灭菌种子罐中，37℃培养10h，形成种子培养液，所述种子培养基组分包括：糖蜜，24.5~25.0 g/L；蛋白胨，13.5~13.7 g/L；磷酸二氢钾，1.7~1.8 g/L；柠檬酸钠，1.5~1.6 g/L；硝酸铵，1.5~1.6 g/L；硫酸镁，0.5~0.52 g/L；调节起始pH 至7.2；

（2）将所述种子培养液转接至装有发酵培养基的生产罐进行发酵培养，37℃培养24h，当孢子率超过95%时，停罐，获得发酵液，所述发酵培养基组成包括：豆粕粉，25.0~25.5 g/L；玉米浆干粉，18.5~19.4 g/L；氯化钠，4.0~4.2 g/L；磷酸二氢钠，2.8~2.9 g/L；磷酸氢二钾，1.2~1.3 g/L；氯化镁，0.55~0.58 g/L；硫酸锰，0.15~0.16 g/L；中性蛋白酶，2.0~2.1g/L；糖化酶，1.5~1.6 g/L；消泡剂，1.3~1.4 g/L；调节起始pH 至 7.4，所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7发酵液的菌量达到450×10⁸ CFU/g~500×10⁸ CFU/g；

（3）将所述发酵液添加载体后进行喷雾干燥，获得含菌量2000×10⁸ ~2200×10⁸ CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉，所述载体为轻质碳酸钙，添加载体的量占发酵液的质量比例为：10%-15%；

所述步骤（1）中添加的蛋白酶是按酶添加量碱性蛋白酶：中性蛋白酶：酸性蛋白酶=2:5:3的三种组分的混合物。

2.根据权利要求1所述的在玉米-豆粕型日粮中添加鱼溶浆的生物发酵方法，其特征在于：所述玉米-豆粕型基础日粮中玉米和豆粕的质量比为4:1-3:2。

3.根据权利要求1所述的在玉米-豆粕型日粮中添加鱼溶浆的生物发酵方法，其特征在于：所述步骤（2）中密封发酵48h，密封发酵中好氧发酵12h，厌氧发酵36h。

4.根据权利要求3所述的在玉米-豆粕型日粮中添加鱼溶浆的生物发酵方法，其特征在于：所述步骤（3）中喷雾干燥的进风温度为145℃-150℃，出风温度为65℃-70℃。

5.权利要求1-4任一项所述的发酵方法制得的发酵物。

6.根据权利要求5所述的发酵物，其特征在于：所述发酵物的pH3-5，乳酸含量10-20%，小肽含量20-30%，活菌数高达9×10¹⁰cfu/g~3.8×10¹²cfu/g。