CN104865210A - 一种α-岩藻糖苷酶测定液体单一试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种α-岩藻糖苷酶测定液体单一试剂，该试剂中的各组分及组分浓度为：pH4.5～5.5的缓冲液50-200mmol/L，抗干扰剂20-80g/L，2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷0.1-1g/L。本发明可有效节省全自动生化分析仪试剂盘空间，提高全自动生化分析仪的利用率，更有利于该试剂在临床上的推广应用。而且，本发明特定的缓冲液可以有效的实现对底物的稳定；此外，本发明抗干扰剂的加入可瞬间将样本中的肝素干扰效应去除，实现降解或屏蔽肝素的作用，从而使本发明液体单一试剂同时具有良好的抗肝素干扰性能，且因加入的抗干扰剂市场价格较为便宜，使得本发明试剂的成本较为低廉。

Description

一种α-岩藻糖苷酶测定液体单一试剂

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种α-岩藻糖苷酶测定液体单一试剂。

背景技术

α-岩藻糖苷酶(α-fucosidase，AFU)是一种溶酶体酸性水解酶，广泛分布于人体内的各种组织、细胞及体液中，尤其以肝、肾等组织活性较高。近年来，随着对AFU检测方法及其他肿瘤或非肿瘤性疾病的血AFU水平变化的深入研究，AFU活力测定已经成为一个基本诊断指标，并与其他实验室指标相结合，成为肝癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、口腔癌、白血病、卵巢肿瘤等疾病诊断的重要指标。

目前，测定AFU活力的方法主要有荧光法、终点比色法、速率法。荧光法是利用岩藻糖苷化合物在AFU水解后释放出可发射荧光的4-甲基伞型酮，通过检查荧光强度来分析酶活力，该法的灵敏度高，既能用于血清，也适用于活检组织、细胞、脑脊液等量小的样本，但该法对仪器要求高，不仅需要凝胶过滤除去干扰物质，而且需要荧光分光光度计，因而不能实现自动化分析，难以进行普及推广；终点比色法是以PNP-AFU为底物，底物被酶分解后产生的色团在碱性条件下呈黄色，利用分光光度法进行定量分析，本法简便、设备要求不高，但是酶底物本身的抗干扰性差，不能解决血清黄疸和溶血、脂血等因素对测定结果的影响，且操作繁琐，所需反应时间长，而且AFU需在酸性环境下进行酶促反应，而色团需在碱性条件下呈色，所以也不适合自动化检测，推广难度大。速率法以AFU在适宜反应条件下催化含呈色基团的特定底物水解，在一定波长下可使吸光度增加，连续监测吸光度值的变化，可计算出样本中AFU的活性，该法操作简单，测定时间短，灵敏度及抗干扰性都较好，并且适用于各种半/全自动分析仪器，由于速率法具有便于临床推广应用的特点，近年来，速率法AFU活力测定逐步在临床医学方面得到普遍应用。

在日常检验工作中，由于肝癌、肝硬化患者分离血清需要时间长，为了能快速回报结果，缩短样本周转时间和防止仪器样品针被堵，不少医院使用肝素锂或肝素钠抗凝管采集血样进行测定，由于肝素为阴离子黏多糖，带有大量负电荷，呈强酸性，易与速率法检测AFU所用试剂反应形成沉浊使吸光度升高，从而影响检测准确度，因此，AFU测定试剂开发时需充分考虑样品中肝素干扰的问题，同时，若能制备成单一试剂则可有效节省全自动生化分析仪试剂盘空间，提高全自动生化分析仪的利用率，更有利于该试剂在临床上的推广应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有良好的抗肝素干扰性能，良好的稳定性，且成本较低的AFU测定液体单一试剂。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为：一种AFU测定液体单一试剂，试剂中的各组分及组分浓度范围为：

缓冲液(pH 4.5～5.5)                  50-200mmol/L，

抗干扰剂                             20-80g/L，

2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷(CNP-Afu) 0.1-1g/L。

本发明上述所述的抗干扰剂为可溶性钙盐或镁盐中的一种，进一步优选为氯化钙或氯化镁或硫酸钙或硫酸镁。

其中所述缓冲液可以是磷酸缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、硼酸缓冲液、咪唑缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液，2-吗啉乙磺酸缓冲液中的一种。

本发明试剂的配制方法为常规方法，即试剂所述组分配方用量加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。

本发明试剂盒测定样本中的AFU的测试条件如下：温度：30-37℃；比色杯光径为1.0cm。检测主波长405nm。

应用本发明AFU测定试剂盒测定样本中AFU的方法如下：样品(校准管以校准品做样品)加试剂R混匀后，30-37℃孵育2min，连续检测2min吸光度变化，计算ΔA/min。其中样本用量25μl，试剂用量225μl。

本发明试剂盒测定样本中AFU含量按以下公式进行计算：

本发明的突出实质性特点及显著进步主要表现在：

本发明的试剂为液体单一试剂，可有效节省全自动生化分析仪试剂盘空间，提高全自动生化分析仪的利用率；对生化仪试剂位比较紧张的的用户而言，本发明的单试剂是一种非常理想的选择，更有利于该试剂在临床上的推广应用。而且，本发明特定的缓冲液(缓冲液种类、浓度及pH)可以有效的实现对底物的稳定；此外，本发明抗干扰剂的加入可瞬间将样本中的肝素干扰效应去除，实现降解或屏蔽肝素的作用，从而使本发明液体单一试剂同时具有良好的抗肝素干扰性能，且因加入的抗干扰剂市场价格较为便宜，使得本发明试剂的成本较为低廉。

本发明的试剂可使用肝素抗凝血浆，且能满足本领域规定的常规浓度的抗干扰要求。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明作出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述试剂的配置方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1：

醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.5)        50mmol/L，

氯化钙                           20g/L，

2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷      0.3g/L。

试剂的配制方法为常规方法，即试剂所述组分加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。

实施例2：

柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液(pH 5.5)             100mmol/L

氯化镁                                      50g/L

2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷                 0.1g/L

试剂的配制方法为常规方法，即试剂所述组分加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。

本发明试剂盒测定样本中的AFU的测试条件如下：温度：30-37℃；比色杯光径为1.0cm。检测主波长405nm。

应用本发明AFU测定试剂盒测定样本中AFU的方法如下：样品(校准管以校准品做样品)加试剂R混匀后，30-37℃孵育2min，连续检测2min吸光度变化，计算ΔA/min。其中样本用量25μl，试剂用量225μl。

本发明试剂盒测定样本中AFU含量按以下公式进行计算：

下面结合表格对本发明实施例1所得试剂的性能进行说明。

1、试剂稳定性实验：

如表1所示：

表1 本发明实施例1的试剂在4-8℃保存1年的实验结果

月份	低值样本(56.3U/L)	高值样本(72.9U/L)
			1	56.1	73.6
3	53.7	72.2
			6	54.6	69.6
9	53.9	70.5
			12	52.8	68.1

2、试剂盒的抗干扰实验：

(1)胆红素、血红蛋白、抗坏血酸的干扰

分别按照本领域的常规技术配制含有胆红素、血红蛋白、抗坏血酸不同浓度的待测样品，测定实施例1的试剂盒对各种干扰物的抗干扰能力(每个样品一式三份，取其平均值)。检测结果(平均值)如表2所示：

表2

(2)肝素的干扰

分别按照本领域的常规技术配制含有不同浓度的肝素待测样品，测定实施例1的试剂盒对肝素的抗干扰能力(每个样品一式三份，取其平均值)。检测结果(平均值)如表3所示：

表3：

从上述检测结果可知，本发明试剂具有良好的抗肝素干扰性能，且试剂具有良好的稳定性，试剂盒2-8℃保存至少稳定12个月，能完全满足临床检验要求。

Claims (3)

1.一种α-岩藻糖苷酶测定液体单一试剂，其特征在于：该试剂中的各组分及组分浓度为：

缓冲液(pH 4.5～5.5)           50-200mmol/L，

抗干扰剂                      20-80g/L，

2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷   0.1-1g/L。

其中，所述的抗干扰剂为可溶性钙盐或镁盐中的一种。

2.根据权利要求1所述的α-岩藻糖苷酶测定液体单一试剂，其特征在于：所述的钙盐为氯化钙或硫酸钙，所述的镁盐为氯化镁或硫酸镁。

3.根据权利要求1所述的α-岩藻糖苷酶测定液体单一试剂，其特征在于：所述缓冲液为磷酸缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、硼酸缓冲液、咪唑缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液，2-吗啉乙磺酸缓冲液中的一种。