CN114231435B - 一种放线菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种放线菌菌株，属于农作物病害防治技术领域。所述的生防放线菌菌株为氢化链霉菌W1（Streptomyces hydrogenans W1），已保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CICC M20211123。本发明的放线菌具有广谱抑菌活性，对烟草黑胫病、烟草根腐病、辣椒疫病、辣椒炭疽病、辣椒褐斑病、番茄根腐病、红梗木枝枯病及木瓜茎基腐病等病原菌具有抑制作用，抑菌率在50‑90%之间。该菌株通过产生活性物质抑制病原菌的生长，应用于烟草盆栽与大田试验时，该菌株对烟草黑胫病的相对防效均为为100%，可显著降低发病率和病情指数。该菌株通过产生活性物质抑制本发明的放线菌菌株从海洋中分离获得，具有广谱抑菌特性，无毒、无致病性，安全性高，因此在农作物病害的生物防治中具有良好的应用前景。

Description

一种放线菌及其应用
技术领域
本发明属域农业病害生物防治技术领域，具体涉及一株氢化链霉菌在防治多种经济作物真菌病害中的应用。
背景技术
近些年，随着人们生活质量的提升，对天然无农药食品的追求愈发增强，目前在各种农农作物病害防治方法包括轮作、嫁接、改良土壤理化性质、选育抗病品种、化学防治与生物防治。其中化学防治为主要方式，然而，化学药剂不仅使得病害病原菌容易产生抗药性，而且容易导致农药残留，进而污染环境，严重威胁人类健康及其他生命体健康。生物防治由于其高效、安全、环保等优点，受到越来越多研究工作者的青睐，被广泛用于植物病害的防治中。
生物防治中，放线菌是一类具有重要经济价值和实用价值的微生物，是抗生素的重要来源，由于其对生态环境影响小、污染少等特点，在植物病害防控中，应用较普遍，尤其是链霉菌属。放线菌种类多样，分布于土壤、污水、海洋等生态环境中，不同生境来源的放线菌代谢功能各异，目前应用较多的是陆生来源的放线菌。海洋环境由于其压强高、含盐量高、营养成分少、温度低等特点，使得生活在其中的放线菌生理生化特征与代谢途径与陆生放线菌有所差异，是新型化合物的重要资源库，因此是发现新型农用抗生素的重要来源，在农业生产中开发前景极其广阔。
发明内容
1.本发明的目的在于：针对目前农作物普遍发生的真菌病害，提供一种放线菌，其为一种氢化链霉菌，从深海海绵中分离获得，具有广谱抑菌活性，对多种病原菌具有良好的拮抗作用，具有广阔的发展空间和应用前景。
2.本发明的第一个方面是提供一种放线菌，其为氢化链霉菌(Streptomyceshydrogenans W1)，已于2021年9月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M20211123。
3.本发明的第二个方面是提供如本发明第一个方面所述的放线菌在拮抗烟草黑胫病病菌、烟草根腐病病菌、辣椒疫病病菌、辣椒炭疽病病菌、辣椒褐斑病病菌、番茄根腐病病菌、红梗木枝枯病病菌、木瓜茎基腐病等病原菌方面的应用。
4.本发明的第三个方面是提供如本发明第一个方面所述的放线菌在防治烟草黑胫病病菌、烟草根腐病病菌、辣椒疫病病菌、辣椒炭疽病病菌、辣椒褐斑病病菌、番茄根腐病病菌、红梗木枝枯病病菌、木瓜茎基腐病等病原菌方面的应用。
5.本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面在烟草盆栽与大田中防治烟草黑胫病中的应用。
附图表说明
图1菌株W1的菌落形态。
图2菌株W1显微镜观察图。
图3菌株W1扫描电镜观察图。
图4菌株W1对不同病原菌的平板拮抗效果。
图5菌株W1对烟草黑胫病与根腐病的盆栽防治效果。
图6菌株W1对烟草黑胫病与根腐病的大田防治效果。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明，但不限于这些实施例。
实施例1：氢化链霉菌W1的分离与筛选
从大连海域20～30m深处潜水采集新鲜的海绵样品，用保鲜袋带回。
称取海绵5g，无菌水洗3遍后，在研钵中研磨至匀浆状，加入两倍量的无菌水，振荡获得悬液。分别将悬液稀释10倍、100倍、1000倍后，取100μL进行涂布于Emerson's培养基(蛋白胨4g，葡萄糖10g，酵母浸出粉1g，牛肉浸出粉4g，NaCl 2.5g，琼脂粉20g，蒸馏水1L，pH7.0)，28℃培养48h，挑取颜色、形态不同的细菌单菌落进行纯化保存。
采用平板对峙法测定分离到的细菌对烟草黑胫病的抑菌活性。将烟草根腐病菌在胡萝卜培养基平板上(胡萝卜200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1L，自然pH)活化，用打孔器在菌落边缘打取菌块(半径5mm)，接种到胡萝卜培养基平板中央，在菌块4周离中心25mm处对称接种3μL拮抗菌液(约1.0×108cfu/mL)，倒置，每个处理重复3次，5天后观察抑菌结果，并测量其抑菌半径，计算抑菌率。
抑菌率(％)＝(对照组菌落半径-处理组菌落半径)×100/(处理组菌落半径-5)
抑菌半径＝对照组菌落半径-处理组菌落半径
试验结果表明，W1菌株对烟草黑胫病病原菌病原菌的拮抗作用较强。
实施例1：氢化链霉菌W1鉴定
形态学观察：将W1菌株在ISP2培养基平板(酵母粉4g，麦芽浸出粉10g，葡萄糖4g，蒸馏水1L，pH 7.2)划线接种，28℃培养3-5天，观察菌落特征。菌落初为圆形，边缘不整齐，表面干燥有褶皱，白色粗糙不透明，菌落中央凹状突起，气生菌丝发达(图1)。如图2菌落显微镜下观察，孢子丝短直，孢子卵圆至椭圆形。扫描电镜观察其菌体呈短杆状，孢子表面粗糙(图3)。
如表1，观察W1菌株在不同培养基中，气生菌丝与基内菌丝生长状态不同，产生的可溶性色素亦不同。
表1菌株W1在不同培养基上的培养特征
Figure BDA0003303718080000031
生理生化特征
表2菌株W1在不同培养基上的培养特征
Figure BDA0003303718080000032
/>
Figure BDA0003303718080000041
16S rDNA序列分析
提取菌株W1基因组后，采用引物27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'与1492r：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'，进行16S rDNA的PCR扩增。PCR反应体系50μL：PremixTap酶25μL、模板1μL、引物27f 1μL、引物1492r 1μL、无菌水22μL。PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定后送金唯智公司测序。将所得序列提交GenBank数据库进行BLAST分析比对，发现菌株W1与Streptomyces hydrogenans strain CA04同源性为100％，结合形态特与生理生化特征和16S rDNA序列分析结果，初步鉴定菌株进一步确定W1菌株为氢化链霉菌(Streptomyceshydrogenans)。
实施例2：氢化链霉菌W1菌株的抑菌谱测定
采用平板对峙法对菌株进行广谱性测定：将供试病原菌烟草黑胫病、辣椒疫病、辣椒炭疽病、辣椒褐斑病、番茄根腐病、红梗木枝枯病及木瓜茎基腐病等病原菌分别接种于胡萝卜平板中央，待测细菌点接于距病原菌左右25mm处，每处理3个重复，28℃恒温倒置培养5天后，测定其抑菌率(结果见图4与表3)
表3菌株W1对不同病原菌的抑菌率
Figure BDA0003303718080000042
/>
Figure BDA0003303718080000051
实施例3：菌株W1对烟草黑胫病与根腐病的防治效果
盆栽防治效果
从W1菌株接种于ISP2液体培养基中，于28℃、140r/min振荡培养6d，稀释、制成拮抗菌液(孢子浓度约1.0×108cfu/mL)，采用灌根法每盆接种200mL拮抗菌液，7d后接种烟草黑胫病病原菌200mL，此后每7d接种拮抗菌液1次，共接种3次；空白对照组CK0为不作任何处理，对照组CK只接种病原菌处理，对照组CK1使用58％甲霜·代锰锌可湿性粉剂600倍每株200mL处理；对照组CK2以旺泰宝微生物菌剂可湿性粉剂600倍每株200mL处理；对照组CK3以碧苗复合为生物菌肥进行处理。每处理8株，各处理重复3次，接种14d后开始调查发病情况(结果见图5与表4)。烟草黑胫病分级标准分别参照中华人民共和国烟草行业标准(GB/T23222—2008)进行。
发病率＝(染病株数/调查总株数)×100％
病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100
相对防效＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％
表4菌株W1对不烟草黑胫病的盆栽防治效果
处理 发病率(％) 病情指数 相对防效(％)
对照组CK 86.3±1.0a 57.1±0.5a
甲霜锰锌 58.1±1.6b 33.1±1.6b 42.1±2.9b
碧苗 58.9±3.1b 54.6±2.2a 4.4±0.6c
旺泰宝 75.9±1.6a 53.0±0.2a 7.2±0.4c
生防菌W1 0.0±0.0c 0.0±0.0d 100.0±0.0a
同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
大田防治效果
大田防效试验在平顶山市白龙庙村进行，于2021年5月1日移栽，20d后接种拮抗菌液孢子浓度约1.0×108cfu/mL)，每株灌根200mL，如盆栽实验设置对照组CK0、CK、CK1与CK2。由于大田烟株生育期比盆栽烟株长，故将大田接种时间间隔定为15d，共灌根3次。每处理50株，共重复3次。接种14d后开始调查发病情况(结果见图6与表5)。
表5菌株W1对不烟草黑胫病的大田防治效果
处理 发病率(％) 病情指数 相对防效(％)
对照组CK 11.1±0.3a 6.7±0.6a
甲霜锰锌 6.4±0.3b 4.5±0.2b 32.8±3.6c
碧苗 6.3±0.2b 3.5±0.1c 47.6±1.6b
旺泰宝 5.7±0.4b 3.4±0.1c 49.2±1.2b
生防菌W1 0.0±0.0c 0.0±0.0d 100.0±0.0a
同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 商丘师范学院
<120> 一种放线菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1337
<212> DNA
<213> 氢化链霉菌(Streptomyces hydrogenans)
<400> 2
tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggc aatctgccct gcactctggg acaagccctg 60
gaaacggggt ctaataccgg atatgactgt ccatcgcatg gtggatggtg taaagctccg 120
gcggtgcagg atgagcccgc ggcctatcag cttgttggtg aggtagtggc tcaccaaggc 180
gacgacgggt agccggcctg agagggcgac cggccacact gggactgaga cacggcccag 240
actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcga 300
cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcaggg aagaagcgaa 360
agtgacggta cctgcagaag aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 420
tagggcgcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gcttgtcacg 480
tcggttgtga aagcccgggg cttaaccccg ggtctgcagt cgatacgggc aggctagagt 540
tcggtagggg agatcggaat tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac 600
accggtggcg aaggcggatc tctgggccga tactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga 660
gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac ggtgggcact aggtgtgggc 720
aacattccac gttgtccgtg ccgcagctaa cgcattaagt gccccgcctg gggagtacgg 780
ccgcaaggct aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgtggc 840
ttaattcgac gcaacgcgaa gaaccttacc aaggcttgac atacaccgga aacgtctgga 900
gacaggcgcc cccttgtggt cggtgtacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg 960
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg tcccgtgttg ccagcaggcc 1020
cttgtggtgc tggggactca cgggagaccg ccggggtcaa ctcggaggaa ggtggggacg 1080
acgtcaagtc atcatgcccc ttatgtcttg ggctgcacac gtgctacaat ggccggtaca 1140
atgagctgcg ataccgcgag gtggagcgaa tctcaaaaag ccggtctcag ttcggattgg 1200
ggtctgcaac tcgaccccat gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca gcattgctgc 1260
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac gtcacgaaag tcggtaacac 1320
ccgaagccgg tggccca 1337

Claims (3)

1.一种放线菌，其特征在于，其为氢化链霉菌（Streptomyces hydrogenans），已于2021年9月1日保藏至中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M20211123。
2.如权利要求1所述的放线菌在防治烟草黑胫病病菌、烟草根腐病病菌、辣椒疫病病菌、辣椒炭疽病病菌、辣椒褐斑病病菌、番茄根腐病病菌、红梗木枝枯病病菌、木瓜茎基腐病病菌病原菌方面的应用。
3.如权利要求1所述的放线菌在烟草盆栽与大田中防治烟草黑胫病中的应用。
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