CN104862233B - 一株产黄青霉及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物领域，具体而言涉及一株产黄青霉及其应用。本发明提供一株新的产黄青霉，其分类命名为产黄青霉(Penicillium Chrysogenum)SIPI‑2013406，由中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M 2013685，保藏日期为2013年12月23日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。本发明还提供了产黄青霉(Penicillium Chrysogenum)SIPI‑2013406在制备N‑(L‑异丙酸基)‑马来酰胺酸中的应用。

Description

一株产黄青霉及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种新的微生物及其应用，尤其涉及一株产黄青霉及其在制备N-(L-异丙酸基)-马来酰胺酸(AMA)中的应用。
背景技术
N-(L-异丙酸基)-马来酰胺酸(AMA，式1)的典型合成方法：溶解在乙酸溶液中的马来酸酐和L-丙氨酸混合后室温搅拌3h出现白色沉淀，该沉淀物经过水洗后重结晶得到分析纯的AMA。
在催化剂三乙胺(Et3N)的作用下，AMA发生闭环脱水反应生成N-马来酰基-L-丙氨酸 (AMI)。AMI不仅可以作为合成有机锡类抗肿瘤化合物的重要配基，也可用于合成多种耐热功能性材料。另外，AMA可进行聚合反应，其均聚物和共聚物具有良好的热稳定性，因此可以用于合成耐热性高分子树脂，而且通过聚合的比例和条件，可以合成具有光学活性的树脂，开发手性功能材料(Polymer Vol.39No.17,pp.4135-4146,1998)。
已有文献的报道AMA均是通过化学方法合成，本发明提供一种发酵方法制备AMA的技术。
发明内容
本发明第一方面提供一株产黄青霉菌，其分类命名为产黄青霉(PenicilliumChrysogenum) SIPI-2013406，保藏编号为：CCTCC NO：M 2013685，所述菌株由中国典型培养物保藏中心 (简称CCTCC)保藏，保藏日期为2013年12月23日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
所述菌株是从中国山东蓬莱阁景区草丛土壤中分离获得的。
所述菌株的28S rDNA序列长度为555bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。ITS序列长度为531bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明另一方面提供产黄青霉（Penicillium Chrysogenum）SIPI-2013406在制备N-(L-异 丙酸基)-马来酰胺酸（AMA）中的应用。
本发明再一方面提供N-(L-异丙酸基)-马来酰胺酸（AMA）的制备方法，其包括以下步骤：
(a)将产黄青霉（Penicillium Chrysogenum）SIPI-2013406进行种子培养，
(b)将步骤(a)获得的种子培养液进行发酵培养，
(c)离心步骤(b)获得的发酵液，固液分离后取菌体进行纯化以获得AMA。
关于步骤(a)和(b)的培养基，可使用合成培养基、半合成培养基或天然培养基。培养基优 选含有碳源、氮源以及其它营养源。其中碳源可为***糖、木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、 肌醇、鼠李糖、棉籽糖、甘露糖醇、甘露糖、蜜二糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、水 杨苷、黄嘌呤、甲壳质、淀粉、糊精、甘油、植物油等；氮源可为肉提取物、蛋白胨、蛋白 粉、棉籽粉、大豆粉、花生粉、鱼粉、玉米浆、酵母抽提物、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、尿 酸等；至于其它营养源可适当添加一些无机盐类，例如磷酸盐类(例如磷酸氢二钾)、钾(例如 溴化钾)、钙(例如碳酸钙)、锌、锰、铁之类的金属盐、以及硫酸镁、氯化钠等，必要时可添 加例如醇类和硅化合物等作为消泡剂。这些成分可预先一次性地加入培养基中，或者间歇或 连续地加入培养基中。在本发明的一个具体实施方案中，步骤(a)的培养基的组成为葡萄糖、 蛋白胨、花生粉、酵母抽提物、CaCO3；步骤(b)的培养基的组成为可溶性淀粉、葡萄糖、酵 母抽提物、NaCl、大豆分离蛋白、K2HPO4、CaCO3。
其中步骤(a)的种子培养方式优选采用振荡培养，培养温度为25-30℃，优选为28℃；转 速为180-250r/min，优选为220r/min；培养时间为35-45小时，优选为40小时；培养期间的 pH值为6.0-7.0，优选为6.5。
其中步骤(b)的发酵培养方式优选采用振荡培养，培养温度为25-30℃，优选为28℃；转 速为180-250 r/min，优选为220 r/min；培养时间为140-160小时，优选为150小时；培养期 间的pH值为6.5-7.5，优选为7.0。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明AMA的制备方法包括以下步骤：
(a) 将产黄青霉（Penicillium Chrysogenum）SIPI-2013406进行种子培养，培养方式为振 荡培养，培养温度为28℃；转速为220 r/min；培养时间为40小时，培养期间的pH值为6.5，
(b) 将步骤(a)获得的种子培养液进行发酵培养，培养方式为振荡培养，培养温度为28℃； 转速为220 r/min；培养时间为150小时；培养期间的pH值为7.0，
(c) 离心步骤(b)获得的发酵液，固液分离后取菌体进行纯化以获得AMA。
本发明AMA的制备方法工艺优良，产率较高，适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，然而，本发明中实施例仅用于阐明，不 限制本发明的范围。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。 此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
名词术语：
AMA N-(L-异丙酸基)-马来酰胺酸
PDA培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基
F引物 Forward引物
R引物 Reverse引物
TFA 三氟乙酸
实施例1：产黄青霉（Penicillium Chrysogenum）SIPI-2013406的生物学特性
1）形态学特性
菌落形态：观察在PDA培养基和察式培养基上的形态，从而来判断形态特征。在PDA培养基上生长旺盛，菌落连接成片，培养2天时菌落中心呈深绿色，边缘白色菌丝，培养至 5天，边缘的白色菌丝逐渐转为浅绿色，菌落生长致密，不透明。正反颜色不同，菌落背面 边缘为浅绿色，中心呈黄绿色；在察式培养基上，菌落刚长出是白色，随着培养时间延长， 中心变为黄色，背面也呈浅黄色。
微观形态：通过扦片法观察产黄青霉（Penicillium Chrysogenum）SIPI-2013406的显微形 态。菌丝有隔膜；分生孢子梗单枝，较长，孢子梗顶端膨大，成帚状，对称，是青霉属的典 型特征，生分生孢子串；单个分生孢子为球形或椭圆形。
2）28S rDNA和ITS序列测定及***进化分析
用F和R引物扩增得到28S rDNA序列并测序。
F(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)；
R(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。
用ITS1和ITS2引物扩增得到ITS序列并测序。
ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)；
ITS2(TCCTCCGCTTATTGATATGC)。
经测定，该菌株28S rDNA大小为555bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。ITS序列长度531bp,核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。将该序列在GenBank数据库作blast比较，然后将相关序列从GenBank数据库调入MEGA进行比对，构建Neighbor-Joining（N-J）树，并 进行Bootstrap分析，证明该菌株与产黄青霉（Penicillium Chrysogenum）同源性最高，综合其他生物学特征鉴定该菌株为产黄青霉种，命名为产黄青霉（Penicillium Chrysogenum）SIPI-2013406，并于2013年12月23日在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）进行保藏，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M2013685。
实施例2：AMA的制备及纯化
1）AMA的制备
a）种子培养基的组成
葡萄糖30g，蛋白胨5g，花生粉30g，酵母抽提物5g，CaCO35g，蒸馏水1000ml，调 节pH6.5。
b）发酵培养基的组成
可溶性淀粉50g，葡萄糖30g，酵母抽提物10g，NaCl5g，大豆分离蛋白20g，K2HPO45g，CaCO31g，蒸馏水1000ml，调节pH7.0。
c）AMA的制备
将-20℃保存的产黄青霉（Penicillium Chrysogenum）SIPI-2013406在无菌条件下接种于5 个含有种子培养基100ml的750ml三角瓶中，在28℃以220r/min振荡培养40小时，得种子 培养液。
将250ml的种子培养液接种于25个发酵培养基100ml的750ml三角瓶中。在28℃以220r/min振荡培养150小时，可获得2.0L液体培养物。
2）AMA的纯化
a)发酵液固液分离并抽提
发酵液离心30min，转速：4000r/min，得到菌体600g，加入三倍体积甲醇，振荡抽提1h 后离心取上清抽提液。
b)浓缩
由于菌体抽提时仍含有一定水分，其中溶解的大量盐分将不利于后续的分离纯化，因此 将得到的抽提液1.8L置于旋转蒸发仪浓缩（40℃）蒸干，再用甲醇将抽提物溶出。
c)弱碱阴离子树脂纯化
将得到的甲醇浓缩液稀释后通过Amberlite FPA53弱碱阴离子柱（罗门哈斯公司），上样 完成后依次水洗、0.05mol/L NaCl洗、0.1mol/L NaCl洗脱。洗脱完成后依次得到母液（F1）、 水洗液（F2）、0.05mol/L NaCl洗脱液（F3）、0.1mol/L NaCl洗脱液（F4）四部分，经HPLC 检测，其中目标峰主要存在于0.1mol/L NaCl洗脱液中。
d)反相硅胶纯化
将F4组分旋蒸浓缩至2ml，调节pH至2.0。上样前先用0.05%TFA/水平衡。上样后用0.05%TFA/水、5%甲醇、10%甲醇各洗脱，经HPLC检测显示目标峰存在于10%甲醇洗脱液 中。
e)反相制备纯化
将反相10%甲醇洗脱液旋蒸浓缩至0.5ml，调节pH至2.0。制备柱用0.05%TFA/水平衡 后上样，依次进行0.05%TFA/水、5%甲醇、10%甲醇洗脱。得到三个组分，经HPLC检测， 合并纯度在98%以上的组分浓缩去甲醇后冻干，得到AMA的白色粉末(58.5mg)。
1H NMR(DMSO，400MHz)δppm:1.301-1.319(d，3H)，4.268-4.340(m，1H)，6.520-6.560 (dd，1H)，6.964-7.002(d，1H)，8.712-8.729(d，1H，-NH-)，12-14(2H，-COOH)；
LC-MS(ESI)m/z188(M+H)+；
上述步骤c、步骤d和步骤e中HPLC检测条件如下：
分析柱：反相C18（4.6×250mm）
检测波长：215nm
流动相：A)0.05TFA/水
B)0.05TFA/乙腈
梯度洗脱方法：

Claims (8)

1.一株产黄青霉，其分类命名为产黄青霉(Penicillium Chrysogenum)SIPI-2013406，保藏编号为：CCTCC NO：M 2013685。
2.如权利要求1所述的产黄青霉，其28S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，ITS的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求1所述的产黄青霉在制备N-(L-异丙酸基)-马来酰胺酸中的应用。
4.一种N-(L-异丙酸基)-马来酰胺酸的制备方法，其包括以下步骤：
(a)将产黄青霉(Penicillium Chrysogenum)SIPI-2013406进行种子培养，
(b)将步骤(a)获得的种子培养液进行发酵培养，
(c)离心步骤(b)获得的发酵液，固液分离后取菌体进行纯化以获得N-(L-异丙酸基)-马来酰胺酸。
5.如权利要求4所述的制备方法，步骤(a)的培养方式为振荡培养，培养温度为25-30℃；转速为180-250r/min；培养时间为35-45小时；培养期间的pH值为6.0-7.0。
6.如权利要求5所述的制备方法，培养温度为28℃；转速为220r/min；培养时间为40小时；培养期间的pH值为6.5。
7.如权利要求4所述的制备方法，步骤(b)的培养方式为振荡培养，培养温度为25-30℃；转速为180-250r/min；培养时间为140-160小时；培养期间的pH值为6.5-7.5。
8.如权利要求7所述的制备方法，培养温度为28℃；转速为220r/min；培养时间为150小时；培养期间的pH值为7.0。
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