CN104844742B - 用于基因组测序核酸扩增的聚苯乙烯微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因组测序领域,具体涉及一种应用于基因组测序核酸扩增的聚苯乙烯微球的制备方法。所述微球粒径为25微米,具体步骤为:(1)将分散剂加入反应介质中,通入氮气;搅拌至均相体系;(2)将苯乙烯单体和引发剂加入反应体系中;将反应体系升温;然后在搅拌条件下进行恒温反应;冷却至室温、洗涤、干燥。本发明采用分散聚合法成功制备出单分散PS微球,粒径为25微米并且分散系数低。
Description
技术领域
本发明属于基因组测序领域,具体涉及一种应用于基因组测序核酸扩增的聚苯乙烯微球的制备方法。
背景技术
作为上世纪生命科学领域最重要的发明之一,DNA测序技术深刻地改变了人们对生命本质的理解和掌控能力,极大地推动了全球生命科学领域研究的发展。假如没有测序技术,基因序列就无法确定,酶切、克隆、反转录、cDNA、PCR、SNP、RNAi等研究技术也就根本无从谈起,生命科学领域不会有今日的蓬勃发展。生命科学领域无人不晓的GenBank,以及历时13年耗资3亿美元的全球合作完成的人类基因组计划,无不建立在测序的基础上。
自1977年Sanger发明了利用了DNA聚合酶的双脱氧终止原理测定核苷酸序列的技术以来,测序技术不断改进,新方法相继问世,测序规模也不断扩大。测序技术的操作简单化、成本低廉化、以及高通量化成为测序技术的发展方向。SOLiD,454以及Solexa等为代表的新一代高通量测序技术,以三国鼎立的姿态平分着序列测定的天下。三种技术各有千秋,发展更新的速度可谓日新月异。但目前而言,其测序文库制备的过程均仍较为复杂。
测序文库的制备作为整个测序过程中的第一个且及其重要的一个步骤,对测序结果的优劣有着决定性的作用。测序文库的制备大体来说包括以下几个步骤。第一步是如何将核酸从待检测的样本中高质量地提取出来。针对不同的样本,人们所选用的实验流程和方式将会有较大的差异;第二步是如何将长片段的核酸进行小片段花处理,主要针对基因组DNA及长片段的RNA等样本,因为目前测序仪对于读长的限制,只能对制备的随机小片段进行测序,再通过生物信息学方法进行拼接,得出全基因组的序列信息。目前核酸小片段化基本使用物理作用来进行,超声波由于其自身的各种优点而成为打碎DNA的普遍方式,可通过调节超声功率及超声时间来获得不同长度的小片段DNA。第三步便是如何将小片段核酸的两端连接上测序所需的通用接头序列;第四步是如何将连接有接头序列的核酸序列进行单分子多拷贝扩增,包括有乳液PCR、桥式PCR及滚环扩增等,在扩大测序信号强度的同时确保真实的反映样本的原始信息。而乳液PCR一般采用微球捕获一个模板DNA到一个小球,利用乳液PCR扩增单一模板,将同一模板在一个微球上扩增成上百万个模板克隆。
一般来讲,在乳液PCR中采用的微球为聚苯乙烯(PS)微球,并且在微球表面进行链霉亲和素修饰,从而使其可以捕获生物素标记的DNA分子。目前,合成单分散PS微球的方法有微乳液聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、悬浮聚合法和种子聚合法等。但现有的合成方法都是交联剂和单体混合后再进行聚合,这种办法合成的聚合物微球聚合物是整体交联的,往往球形度差,粒径可控性低,因而通常需要分选才能达到粒径分布偏差小于5%的要求。为了合成得到交联的微球,却又不影响到微球的球形度和单分散性,日本专利JP58-106554和JP63-191818虽然提出了种子聚合的方法,即先通过乳液聚合获得种子,然后进行增长,扩大粒子。本方法的缺点是微球在生长过程中,产生次级粒子,需要筛分除去,造成产品收率降低,操作复杂,经济性差。因此,要得到粒径均一的微米级单分散具有交联的聚合物微球粒子是非常困难的。
合成具有单分散性的聚合物微球难度很大,其反应条件苛刻,制备工艺复杂,反应控制要求异常严格。聚合物微球的传统合成方法有乳液聚合法和悬浮聚合法,乳液聚合法只能制备小于500nm的微球,悬浮聚合法制备的微球虽然粒径在100-1000μm,但却是多分散性的,即使经过多次筛分也难以获得单分散的微球,二十世纪七十年代发展起来的分散聚合和种子聚合可以制备粒径1-100μm,且具有单分散性的聚合物微球,是目前制备单分散性聚合物微球的较好方法,但分散聚合的反应介质需用有机溶剂如乙醇等,还需要加入稳定剂如聚乙烯吡咯烷酮等,所用试剂对聚合产物的纯度及后处理带来麻烦。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种聚苯乙烯微球的制备方法,其制备的微球可用于基因组测序文库制备中的核酸扩增,所述微球粒径为25微米,具体步骤如下:
(1)将分散剂加入反应介质中,通入氮气;搅拌至均相体系;
(2)将苯乙烯单体和引发剂加入反应体系中;将反应体系升温;然后在搅拌条件下进行恒温反应;冷却至室温、洗涤、干燥。
在本发明的一个实施方案中,所述反应介质选自水、乙醇、乙二醇单甲醚和甲醇的一种或者两种以上的任意组合。在优选的实施方案中,所述反应介质为水和乙二醇单甲醚,其中,水和乙二醇单甲醚的重量百分比为10~90%和10~90%;也可以为20~40%和60~80%,优选为23%和77%。
所述的分散剂为磷酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚乙烯醇和羟丙基纤维素中的一种或者两种以上的任意组合。在优选的实施方案中,所述分散剂由聚乙烯醇、羟丙基纤维素和聚乙二醇组成,聚乙烯醇、羟丙基纤维素和聚乙二醇的重量百分比为10~80%、10~80%和10~80%;也可以为20~40%、30~50%和20~50%,优选为25%、35%和40%。
引发剂选自偶氮二异丁腈(AIBN)或者过氧化苯甲酰(BPO)的一种或两种的任意比例组合。在优选的实施方案中,所述引发剂为偶氮二异丁腈。
在本发明另一个实施方案中,在最终的反应体系中,苯乙烯单体、分散剂、引发剂和反应介质的重量百分比依次为5~40%的苯乙烯单体,0.1~1%的分散剂,0.025~0.125%的引发剂,反应介质余量;优选为32%的苯乙烯单体,0.3%的分散剂,0.05%的引发剂,反应介质余量。
本发明进一步地实施方案中,所述步骤(2)的将反应体系升温至10-90℃,优选为75℃;搅拌速度控制在80~120转/分钟,优选为100转/分钟。
分散聚合法制备单分散聚苯乙烯微球受单体、引发剂、分散剂和反应介质等4个条件影响,而其中单体和分散剂是影响粒径分布的两个主要因素。在一定反应条件下,随着单体用量和浓度的增加,聚苯乙烯微球的粒径增大;随着稳定剂用量的增加,聚苯乙烯微球的粒径减小。
在基因组测序中,用于DNA文库中核酸扩增的PS微球的粒径一般为25微米,并且要求单分散性好。但在PS微球制备方法中,分散聚合法制备的PS微球单分散性好,但微球的粒径较小,种子聚合法和悬浮聚合法虽然制备的PS微球粒径较大,但微球的单分散性差,分散系数高。因此在本领域中,制备粒径为20至50微米的单分散PS微球一直存在着上述问题。本发明通过大量试验摸索并且意外发现,在一种特定的反应条件下,采用分散聚合法成功制备出单分散PS微球,粒径为25微米并且分散系数低。
具体实施方式
下面将进一步的举例说明本发明。需要指出的是,以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明,并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1聚苯乙烯微球的制备
向反应容器中加入230g的水、770g的乙二醇单甲醚、1.1g的聚乙烯醇、1.54g的羟丙基纤维素和1.76g的聚乙二醇,通入氮气保护,并在室温下搅拌20分钟至均相体系,然后加入苯乙烯单体473g和偶氮二异丁腈0.73g。升温至75℃,恒温反应8小时。反应结束,冷却至室温,产品离心,并用乙醇反复洗涤,干燥,即得单分散PS微球。
实施例2聚苯乙烯微球的制备
向反应容器中加入230g的水、770g的乙二醇单甲醚、1.0g的聚乙烯醇、1.59g的羟丙基纤维素和1.81g的聚乙二醇,通入氮气保护,并在室温下搅拌20分钟至均相体系,然后加入苯乙烯单体473g和偶氮二异丁腈0.81g。升温至75℃,恒温反应12小时。反应结束,冷却至室温,产品离心,并用乙醇反复洗涤,干燥,即得单分散PS微球。
实施例3聚苯乙烯微球的制备
向反应容器中加入230g的水、770g的乙二醇单甲醚、2.64g的羟丙基纤维素和1.76g的聚乙二醇,通入氮气保护,并在室温下搅拌20分钟至均相体系,然后加入苯乙烯单体473g和偶氮二异丁腈0.73g。升温至75℃,恒温反应8小时。反应结束,冷却至室温,产品离心,并用乙醇反复洗涤,干燥,即得单分散PS微球。
实施例4聚苯乙烯微球的制备
向反应容器中加入230g的水、770g的乙二醇单甲醚、1.2g的聚乙烯醇、1.74g的羟丙基纤维素和1.86g的聚乙二醇,通入氮气保护,并在室温下搅拌20分钟至均相体系,然后加入苯乙烯单体473g和偶氮二异丁腈0.73g。升温至75℃,恒温反应8小时。反应结束,冷却至室温,产品离心,并用乙醇反复洗涤,干燥,即得单分散PS微球。
实施例5聚苯乙烯微球的制备
向反应容器中加入230g的水、770g的乙二醇单甲醚、1.2g的聚乙烯醇、1.74g的羟丙基纤维素和1.86g的聚乙二醇,通入氮气保护,并在室温下搅拌20分钟至均相体系,然后加入苯乙烯单体473g和偶氮二异丁腈0.6g。升温至75℃,恒温反应8小时。反应结束,冷却至室温,产品离心,并用乙醇反复洗涤,干燥,即得单分散PS微球。
实施例6聚苯乙烯微球的制备
向反应容器中加入230g的水、770g的乙二醇单甲醚、1.2g的聚乙烯醇、1.74g的羟丙基纤维素和1.86g的聚乙二醇,通入氮气保护,并在室温下搅拌20分钟至均相体系,然后加入苯乙烯单体473g和偶氮二异丁腈0.85g。升温至75℃,恒温反应8小时。反应结束,冷却至室温,产品离心,并用乙醇反复洗涤,干燥,即得单分散PS微球。
实施例7聚苯乙烯微球的制备
向反应容器中加入200g的水、800g的乙二醇单甲醚、1.1g的聚乙烯醇、1.54g的羟丙基纤维素和1.76g的聚乙二醇,通入氮气保护,并在室温下搅拌20分钟至均相体系,然后加入苯乙烯单体473g和偶氮二异丁腈0.73g。升温至75℃,恒温反应8小时。反应结束,冷却至室温,产品离心,并用乙醇反复洗涤,干燥,即得单分散PS微球。
实施例8聚苯乙烯微球的制备
向反应容器中加入260g的水、740g的乙二醇单甲醚、1.1g的聚乙烯醇、1.54g的羟丙基纤维素和1.76g的聚乙二醇,通入氮气保护,并在室温下搅拌20分钟至均相体系,然后加入苯乙烯单体473g和偶氮二异丁腈0.73g。升温至75℃,恒温反应8小时。反应结束,冷却至室温,产品离心,并用乙醇反复洗涤,干燥,即得单分散PS微球。
实施例9聚苯乙烯微球的制备
向反应容器中加入230g的水、770g的乙二醇单甲醚、1.1g的聚乙烯醇、1.54g的羟丙基纤维素和1.76g的聚乙二醇,通入氮气保护,并在室温下搅拌20分钟至均相体系,然后加入苯乙烯单体450g和偶氮二异丁腈0.73g。升温至75℃,恒温反应8小时。反应结束,冷却至室温,产品离心,并用乙醇反复洗涤,干燥,即得单分散PS微球。
实施例10聚苯乙烯微球的制备
向反应容器中加入230g的水、770g的乙二醇单甲醚、1.1g的聚乙烯醇、1.54g的羟丙基纤维素和1.76g的聚乙二醇,通入氮气保护,并在室温下搅拌20分钟至均相体系,然后加入苯乙烯单体500g和偶氮二异丁腈0.73g。升温至75℃,恒温反应8小时。反应结束,冷却至室温,产品离心,并用乙醇反复洗涤,干燥,即得单分散PS微球,粒径为25.0μm,分散系数1.7%。
实施例1-10制备的聚苯乙烯微球的表征
采用JSM-6700F扫描电子显微镜对所制得的PS微球的粒径及粒径分布进行测定。以100个微球为基准,测算微球的平均粒径及粒径分布,公式如下:
式中:δ为标准方差;di为单个粒子的直径;d为粒子的平均直径;n为粒子数目,fs为分散系数,具体结果如下:
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案,其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合,这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内,就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
Claims (1)
1.一种聚苯乙烯微球的制备方法,其制备的微球可用于基因组测序文库制备中的核酸扩增,所述微球粒径为25微米,具体如下:
向反应容器中加入230g的水、770g的乙二醇单甲醚、1.1g的聚乙烯醇、1.54g的羟丙基纤维素和1.76g的聚乙二醇,通入氮气保护,并在室温下搅拌20分钟至均相体系,然后加入苯乙烯单体473g和偶氮二异丁腈0.73g,升温至75℃,恒温反应8小时,反应结束,冷却至室温,产品离心,并用乙醇反复洗涤,干燥,即得单分散PS微球。
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