CN104830753B - 一种诱导多能干细胞培养基、应用及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于生物技术领域的诱导多能干细胞培养基，其应用及培养方法。以IMDM/F12为基础培养基，每500mL IMDM/F12基础培养基中包括以下浓度的组分：重组人胰岛素，重组转铁蛋白，维生素C，人白蛋白，bFGF，PDGF‑bb，EGF，IGF‑1，TGF‑β，纤维连接蛋白，Fetuin，Betacellulin，β‑mercaptoethanol，Thiazovivin。本发明的诱导多能干细胞培养基中完全不采用动物血清，从而有效避免了带有动物源性病院体的风险，提高了诱导多能干细胞在临床上应用的安全性。本发明的培养基可以使诱导多能干细胞增殖速度快，在临床上具有很大的应用价值。

Description

一种诱导多能干细胞培养基、应用及培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种诱导多能干细胞培养基、应用及培养方法。

背景技术

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)最初是日本人山中申弥(Shinya Yamanaka)于2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。诱导多能干细胞能够通过向体细胞中导入诱导基因，使体细胞重编程获得具有胚胎干细胞样特性的多能干细胞，也称为去分化。

随后世界各地不同科学家陆续发现其他方法同样也可以制造这种细胞。成功建立iPS细胞后，应用iPS细胞来治疗疾病是人们的最终目标。iPS细胞不仅可用于分化和移植，还可以提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开发新的治疗方法。人类iPS细胞的建立被公认为2007年最重要的科技进展之一,这项技术不仅可以从体细胞建立个体特异的多能干细胞系,解决了细胞移植治疗中的免疫排斥问题,而且为研究人类细胞的重编程的机理以及研究个体特异的疾病发生机理提供了有力的方法。在干细胞研究领域,iPS细胞技术的出现无疑是具有里程碑意义的突破,多种体细胞经过体外培养和诱导均可转变成为具有多向分化潜能的干细胞,并且证明了几种已知的转录因子可以使已分化的体细胞逆转为未分化的状态,表明细胞的巨大可塑性。

在体外,iPS细胞可定向诱导分化出多种细胞，比如神经干细胞、肝脏干细胞、心肌干细胞等，因此,iPS细胞在理论研究和临床应用等方面都极具应用价值。

目前IPS细胞的培养多采用含有胎牛血清(FBS)的培养基，比如DMEM/F12+20％FBS，但是FBS源于动物，可能含有动物源性病原体，这降低了IPS细胞在临床上的应用价值和安全性。虽然有少数厂家开发了无血清的IPS细胞培养基，但这种培养基培养的IPS细胞增殖速度较慢。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种诱导多能干细胞培养基、应用及培养方法，本发明的培养基中不含有动物源性病原体，诱导多能干细胞在该培养基中增殖速度快，提高了安全性及应用价值。

本发明公开了一种诱导多能干细胞培养基，以IMDM为基础培养基，每500mL IMDM基础培养基由以下浓度的组分组成：

本发明的诱导多能干细胞培养基中完全不采用动物血清，从而有效避免了带有动物源性病院体的风险，提高了诱导多能干细胞在临床上应用的安全性。而且本发明的培养基，配合的重组人胰岛素、重组转铁蛋白、人白蛋白、胎球蛋白等蛋白类物质，各类生长因子以及Thiazovivin，达到了很好的复合增效作用，从而使诱导多能干细胞在本发明的培养基中增殖速度快，在临床上具有很大的应用价值。

在本发明中，bFGF为纤维细胞生长因子，PDGF-bb为充足人血小板源性生长因子，EGF为表皮细胞生长因子，IGF-1为促生长因子，TGF-β为转化生长因子-β，Fetuin为胎球蛋白，Betacellulin为β-细胞素，β-mercaptoethanol为β-巯基乙醇，Thiazovivin为一种ROCK抑制剂。

在本发明的一些具体实施方案中，每500mL IMDM基础培养基由以下浓度的组分组成：

作为优选方案，包括Thiazovivin 10～50ng/mL。

作为优选方案，包括重组转铁蛋白2～15ug/mL。

作为优选方案，包括bFGF10～50ng/mL。

作为优选方案，包括IGF-1 10～50ng/mL。

在本发明的另外一些具体实施方案中，每500mL IMDM基础培养基由以下浓度的组分组成：

本发明还提供了所述的诱导多能干细胞的培养基在培养诱导多能干细胞中的应用。

本发明另外提供了一种诱导多能干细胞的培养方法，包括以下步骤：

(A)重悬诱导多能干细胞，获得诱导多能干细胞悬液；

(B)将诱导多能干细胞悬液加入权利要求所述的诱导多能干细胞培养基中进行培养。

按照本发明，首先重悬诱导多能干细胞，获得诱导多能干细胞悬液。具体步骤为：

用Accutase或IV胶原酶消化诱导多能干细胞；

用上述技术方案所述的培养基重悬诱导多能干细胞，得到诱导多能干细胞悬液。

用上述技术方案所述的培养基重悬诱导多能干细胞的方法优选为：

用上述技术方案所述的培养基将诱导多能干细胞刮成小块聚集物，将所述聚集物在室温下，200g离心5min，去上清后，再加入上述技术方案所述的培养基，再次200g离心5min，去上清；最后加入上述技术方案所述的培养基轻轻重悬细胞团，得到诱导多能干细胞悬液。

得到所述诱导多能干细胞悬液后，即可将诱导多能干细胞悬液加入权利要求所述的诱导多能干细胞培养基中进行培养。本发明对于诱导多能干细胞的培养条件没有特殊限制，按照本领域技术人员熟知的条件进行选择培养即可。

与现有技术相比，本发明的诱导多能干细胞培养基中完全不采用动物血清，从而有效避免了带有动物源性病院体的风险，提高了诱导多能干细胞在临床上应用的安全性。而且本发明的培养基，配合的重组人胰岛素、重组转铁蛋白、人白蛋白、胎球蛋白等蛋白类物质，各类生长因子以及Thiazovivin，达到了很好的复合增效作用，从而使诱导多能干细胞在本发明的培养基中增殖速度快，在临床上具有很大的应用价值。

附图说明

图1为IPS细胞在实施例1及比较例1～2的培养基中的增殖曲线。

具体实施方式

本发明公开了一种诱导多能干细胞培养基、应用及培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的诱导多能干细胞培养基、应用及培养方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

本发明采用的诱导多能干细胞可由市场购得。本发明培养基中选用的组分也均为市售产品。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

所述干细胞无血清培养基由以下含量的成分组成：

实施例2

实施例3

成分名称	浓度范围
		IMDM基础培养基	500ml
重组人胰岛素	0.1mg/ml
		重组转铁蛋白	25ug/ml
维生素C	161ug/ml
		人白蛋白	10mg/ml
bFGF	100ng/ml
		PDGF-bb	100ng/ml
EGF	100ng/ml
		IGF-1	100ng/ml
TGF-β	10ng/ml
		纤维连接蛋白	100ng/ml
Fetuin	1mg/ml
		betacellulin	10ug/ml
β-mercaptoethanol	50uM
		Thiazovivin	10ng/ml

实施例4

实施例5

iPS细胞的培养

1.用Accutase或IV胶原酶消化iPS细胞；

2.加入实施例1所述的培养基，轻轻将细胞刮成小块儿聚集物；

3.将细胞聚集物混合液转移到15ml离心管中；

4.室温200g离心5min；

5.吸走Matrigel铺板上清，立即加入实施例1所述的培养基(如6孔板每孔2ml)；

6.离心之后，小心弃去上清液，用2ml实施例1所述的培养基轻轻重悬细胞团；

7.将重悬后的细胞接种到新的预先铺好Matrigel并含完全培养基的孔板中；

具体为：9×10⁶iPS细胞，分成3组，每组3孔，种植于六孔板中。

8.将细胞于5％CO2,95％湿度，37℃条件下培养；

9.第二天，换新鲜的实施例1所述的培养基(每孔总量4ml)。

每传代一次，计数细胞总量。

比较例1

以美国StemRD公司生产的PSGro iPS无血清培养基培养iPS细胞。

取9×10⁶iPS细胞，分成3组，每组3孔，种植于六孔板中，用上述培养基培养，培养方法同实施例5。每传代一次，计数细胞总量。

比较例2

以DMEM/F12+10％FBS为培养基培养iPS细胞。

取9×10⁶IPS细胞，分成3组，每组3孔，种植于六孔板中，用上述培养基培养，培养方法同实施例5。每传代一次，计数细胞总量。

比较3种培养基培养的细胞收获量。

表1不同培养基中iPS细胞的增殖速度比较

注：培养基1为实施例1所述的培养基；培养基2为比较例1所述的培养基；培养基3为比较例2所述的培养基

*指与其他两种培养基相比，P<0.05,具有显著性差异。

比较iPS细胞在实施例1及比较例1～2的培养基中的增殖曲线，如图1所示，本发明实施例1的培养基细胞收获量更大，显示细胞增殖更迅速。图1为iPS细胞在实施例1及比较例1～2的培养基中的增殖曲线。图1中，为iPS细胞在实施例所述培养基中的增殖曲线；为iPS细胞在比较例1作数培养基中的增殖曲线；为iPS细胞在比较例2作数培养基中的增殖曲线。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.一种诱导多能干细胞培养基，以IMDM为基础培养基，每500mL IMDM基础培养基由以下浓度的组分组成：

重组人胰岛素 1mg/mL；

重组转铁蛋白 2.5μg/mL；

维生素C 16.1μg/mL；

人白蛋白 1mg/mL；

bFGF 10ng/mL；

PDGF-bb 10ng/mL；

EGF 10ng/mL；

IGF-1 10ng/mL；

TGF-β 10ng/mL；

纤维连接蛋白 10ng/mL；

Fetuin 1mg/mL；

Betacellulin 10μg/mL；

ß-mercaptoethanol 50μM ;

Thiazovivin 10ng/mL。

2.权利要求1所述的诱导多能干细胞培养基在培养诱导多能干细胞中的应用。

3.一种诱导多能干细胞的培养方法，包括以下步骤：

（A）用权利要求1所述的培养基重悬诱导多能干细胞，获得诱导多能干细胞悬液；

（B）将诱导多能干细胞悬液加入权利要求1所述的诱导多能干细胞培养基中进行培养。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（A）具体为：

用Accutase或IV胶原酶消化诱导多能干细胞；

用权利要求1所述的培养基重悬诱导多能干细胞，得到诱导多能干细胞悬液。