CN111304157B - 一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法 - Google Patents

一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法，属于干细胞培养领域，将牛诱导多能干细胞在含有5％二氧化碳，温度37℃条件下培养3～4天，弃掉诱导培养基，用PBS缓冲液洗净，分散酶37℃下孵育，观察克隆边缘与饲养层细胞分离后，吸取消化液，加入诱导培养基，从饲养层细胞上刮取牛诱导多能干细胞；用0.05％的胰酶在37℃的条件下消化，加入1mL转化培养基重悬至1.5mL离心管中，1000rpm离心5min，接种至新鲜的饲养层上，并更换转化培养基进行培养，直至出现圆拱形，类似小鼠胚胎干细胞ESCs样的克隆即为牛初始态诱导多能干细胞。本发明解决了现有牛诱导多能干细胞的多能性不完全等问题。

Description

一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法
技术领域
本发明属于干细胞培养领域，具体地涉及一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法。
背景技术
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)是由内细胞团(Inner cell mass，ICM)分离而来的一种具有可分化为三胚层各种类型细胞的多能性干细胞。小鼠ESCs可直接从胚胎中获取，将获得后的ESCs重新打入胚胎并移植到母体内会产生嵌合子代。对于大家畜牛而言，利用相同的培养基只能获得形态类似于小鼠表皮干细胞(Epiblast stemcells,EpiSCs)的一类干细胞，而这类细胞并不能够形成嵌合胚胎。近年来，科研人员在人、猪和猴等动物中尝试利用不同的小分子抑制剂联合筛选，获得了形态和生物学特点类似小鼠ESCs的克隆。但都是从类似EpiSCs形态的转化而来，并未从胚胎中直接获取得到。可见不同物种间，对于小分子的依赖性是不同的，换句话说，不同物种间的通路调控大相径庭。目前为止，在大家畜特别是牛中，已有报道获得了体内外可分化发育为三个胚层组织和细胞的干细胞。这些干细胞与饲养层细胞有明显的边界并且表达多能性基因如Oct4、Nanog等，但其形态仍类似于EpiSCs且不能够承受单细胞传代。
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是将体细胞重编程为一种形态特点类似ESCs的一类细胞，不仅表达与ESCs相似水平的多能性基因而且具有多向分化发育的潜能。在牛上，iPSCs大多呈EpiSCs形态，具有多能性基因的表达，接受机械传代方式。这与真正的ESCs还相差很远，所以，为了获得生物学特性更接近早期胚胎的牛iPSCs，首先需要获得形态特点类似于小鼠iPSCs/ESCs的克隆。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法，解决了现有牛诱导多能干细胞的多能性不完全等问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、培养牛诱导多能干细胞：
将牛诱导多能干细胞置于二氧化碳培养箱中，在含有5％二氧化碳，温度37℃的条件下培养，每天定时更换诱导培养基，培养3～4天，将诱导培养基弃掉后，再用PBS缓冲液洗净，用1mg/mL的dispase分散酶37℃下孵育8min～10min，观察克隆边缘与饲养层细胞分离后，吸取消化液，加入诱导培养基，从饲养层细胞上刮取牛诱导多能干细胞，作为培养牛初始态诱导多能干细胞的牛始发态诱导多能干细胞；
步骤2、培养牛初始态诱导多能干细胞；
将所述步骤1中得到的牛诱导多能干细胞转化为牛初始态诱导多能干细胞过程如下：将牛诱导多能干细胞用0.05％的胰酶在37℃的条件下消化2min，加入1mL转化培养基重悬至1.5mL离心管中，在1000rpm转速条件下离心5min，离心后，接种至新鲜的饲养层上，并更换转化培养基进行培养，直至出现圆拱形，类似小鼠胚胎干细胞ESCs样的克隆，即为牛初始态诱导多能干细胞。
进一步，所述诱导培养基的成分及含量为：基础培养基87％Knockout DMEM，10％KSR，Lif(10000x)，1％链霉素盘尼西林，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，巯基乙醇(1000x)，3μM CHIR99021，1μM PD0325901，8ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。
进一步，步骤1中刮取牛诱导多能干细胞的方式为：采用枪头或细胞刮刀以Z型从左到右，从上到下将牛诱导多能干细胞从饲养层细胞上刮下。
所述步骤1还包括：将刮取得到的牛诱导多能干细胞接种到新鲜饲养层细胞上，且接种到新鲜饲养层细胞上的牛诱导多能干细胞占刮取得到的牛诱导多能干细胞总量的1/6。
进一步，步骤2中所述转化培养基是在诱导培养基基础上添加12.5mg/mL胰岛素，(10x)N2supplement，1ng/mL TGF-b1，5mM SB202190,10mM SP600125,10mM SB203580，50mg/mL Vitamin C。
通过上述设计方案，与现有技术相比本发明可以带来如下有益效果：
第一，本发明充分利用了始发态和初始态，这两种状态的特点来区别牛诱导多能干细胞iPSCs的不同的多能性阶段；
第二，本发明获得了更接近于早期胚胎的牛诱导多能干细胞。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明示意性实施例及其说明用于理解本发明，并不构成本发明的不当限定，在附图中：
图1为牛诱导多能干细胞，培养过程中诱导多能干细胞的形态图；
图2为牛初始态iPSCs，诱导后4天形成与周围饲养层细胞界限明显的圆拱形克隆形态图。
具体实施方式
以下结合优选实施例，进一步阐述本发明。本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的优选实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提出的一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法包括培养牛诱导多能干细胞和培养牛初始态诱导多能干细胞两个阶段：
一、培养牛诱导多能干细胞：
牛诱导多能干细胞的培养，具体操作如下：将牛诱导多能干细胞置于二氧化碳培养箱中，在含有5％二氧化碳，温度37℃的条件下培养，每天定时更换诱导培养基，所述诱导培养基的成分及含量为：基础培养基87％Knockout DMEM，10％KSR，Lif(10000x)，1％链霉素盘尼西林，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，巯基乙醇(1000x)，3μM CHIR99021，1μMPD0325901，8ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，培养3～4天，根据克隆长势及状态对其进行传代；将诱导培养基弃掉后，再用PBS缓冲液洗净以防培养基中成分影响消化的效果，用1mg/mL的dispase分散酶37℃下孵育9min，观察克隆边缘与饲养层细胞分离后，吸取消化液，加入诱导培养基，用枪头或细胞刮刀以“Z”型从左到右，从上到下将细胞刮下，从而保证细胞充分消化；将刮取得到的牛诱导多能干细胞接种到新鲜饲养层细胞上，且接种到新鲜饲养层细胞上的牛诱导多能干细胞占刮取得到的牛诱导多能干细胞总量的1/6，从而保证牛诱导多能干细胞稳定繁殖，详见图1，图1示出牛诱导多能干细胞，培养过程中诱导多能干细胞的形态图；
二、培养牛初始态诱导多能干细胞：
牛诱导多能干细胞转化为牛初始态诱导多能干细胞过程如下：将牛诱导多能性干细胞用0.05％的胰酶在37℃的条件下消化2min，加入1mL转化培养基重悬至1.5mL离心管中，转化培养基是在诱导培养基基础上添加12.5mg/mL胰岛素，(10x)N2supplement，1ng/mLTGF-b1，5mM SB202190,10mM SP600125,10mM SB203580，50mg/mL Vitamin C，在1000rpm转速条件下离心5min，离心后，接种至新鲜的饲养层上，并更换转化培养基进行培养，直至出现圆拱形，类似小鼠ESCs样的克隆，即为牛初始态诱导多能干细胞。详见图2，图2示出牛初始态iPSCs，诱导后4天形成与周围饲养层细胞界限明显的圆拱形克隆形态图。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (3)

1.一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、培养牛诱导多能干细胞：
将牛诱导多能干细胞置于二氧化碳培养箱中，在含有5％二氧化碳，温度37℃的条件下培养，每天定时更换诱导培养基，培养3～4天，将诱导培养基弃掉后，再用PBS缓冲液洗净，用1mg/mL的dispase分散酶37℃下孵育8min～10min，观察克隆边缘与饲养层细胞分离后，吸取消化液，加入诱导培养基，从饲养层细胞上刮取牛诱导多能干细胞，作为培养牛初始态诱导多能干细胞的牛始发态诱导多能干细胞；
步骤2、培养牛初始态诱导多能干细胞；
将所述步骤1中得到的牛诱导多能干细胞转化为牛初始态诱导多能干细胞过程如下：将牛诱导多能干细胞用0.05％的胰酶在37℃的条件下消化2min，加入1mL转化培养基重悬至1.5mL离心管中，在1000rpm转速条件下离心5min，离心后，接种至新鲜的饲养层上，并更换转化培养基进行培养，直至出现圆拱形，类似小鼠胚胎干细胞ESCs样的克隆，即为牛初始态诱导多能干细胞；
所述诱导培养基的成分及含量为：基础培养基87％KnockoutDMEM，10％KSR，Lif(10000x)，1％链霉素盘尼西林，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，巯基乙醇(1000x)，3μMCHIR99021，1μMPD0325901，8ng/mL碱性成纤维细胞生长因子；
其中，步骤2中所述转化培养基是在诱导培养基基础上添加12.5mg/mL胰岛素，(10x)N2supplement，1ng/mLTGF-b1，5mMSB202190,10mMSP600125,10mMSB203580，50mg/mLVitaminC。
2.根据权利要求1所述的一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法，其特征在于：步骤1中刮取牛诱导多能干细胞的方式为：采用枪头或细胞刮刀以Z型从左到右，从上到下将牛诱导多能干细胞从饲养层细胞上刮下。
3.根据权利要求1所述的一种获得牛初始态诱导多能干细胞的方法，其特征在于：步骤1还包括将刮取得到的牛诱导多能干细胞接种到新鲜饲养层细胞上，且接种到新鲜饲养层细胞上的牛诱导多能干细胞占刮取得到的牛诱导多能干细胞总量的1/6。
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