CN104830715B

CN104830715B - 一种海洋光合细菌规模化生产方法

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Publication number: CN104830715B
Application number: CN201510177332.1A
Authority: CN
Inventors: 陈刚; 苏晨阳; 张建业; 李振兴; 王旭祥
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2015-04-15
Publication date: 2018-06-12
Anticipated expiration: 2035-04-15
Also published as: CN104830715A

Abstract

本发明公开了一种海洋光合细菌规模化生产方法，包括需氧不需光发酵过程和光厌氧发酵过程两个阶段；首先是在需氧不需光的发酵过程中，海洋光合细菌菌种与需氧不需光发酵阶段培养基按1∶（5‑20）的体积比混合后置于发酵容器中发酵，发酵液的溶氧分压为50%‑100%饱和溶氧分压，细胞密度OD₆₆₀达0.8以上后停止发酵；第二阶段的光厌氧发酵过程中，将第一阶段发酵液按照1：（3–15）的体积比通入到透明无菌的管道中，采用光厌氧培养基，发酵过程光强要求1200‑8000Lux之间，每天光照时间在8‑24小时；当菌体的浓度OD₆₆₀大于1.2，且OD₆₆₀每天的增长量小于0.1时，终止发酵。本发明具有发酵时间短，设备简单，投资少，发酵光合细菌菌液浓度高，质量好，过程可控的易于大规模生产的特点。

Description

一种海洋光合细菌规模化生产方法

技术领域

本发明涉及一种细菌的培养方法，特别涉及一种海洋光合细菌的高效大规模生产方法，属于生物技术领域。

背景技术

光合细菌（photosynthetic bacteria，简称PSB）通常是指一大类能够在有光照缺氧的环境中能进行不放氧的光合作用的一群微生物，光合细菌细胞内只有一个光***即PSI，区别于绿色植物的是，它们的光合作用是不产氧的。光合细菌光合作用的原始供氢体不是水，而是一些有机物，其光合作用的结果是可以分解有机物，光合细菌独特的生理特性使它们在生态***中的地位显得极为重要。尤其在水环境污水处理和水产养殖中由于其具有较强净化污水功能而广泛被使用水质净化以及水环境生态改良剂。

另外光合细菌还具有非常重要营养及保健功能，光合细菌是营养成份很丰富的菌类之一，其蛋白质含量高达65％，氨基酸组成丰富；光合细菌还含有丰富的维生素，特别是人和动物幼体发育所必需的B族维生素类，如B12、叶酸等，光合细菌菌体生物素的含量很高，是啤酒酵母和小球藻的20至60多倍。此外还含有多种微量元素、促生长因子、促免疫因子和辅酶Q、5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）、卟啉、核糖核酸（RNA）和类胡萝卜素等重要生理活性物质。国外的一些保健品的品种中都有加不同比重的光合细菌菌液。

由于这些特点，近年来在有机污水处理，水产养殖，生物菌肥，农业种植，食品，医疗和保健等领域掀起了使用光合细菌的热潮。

相对于光合细菌的巨大需求，我国在光合细菌的生产技术上、规模化生产等方面目前还非常不成熟。尤其在海洋光合细菌的规模化生产方面技术不成熟，其中主要表现在以下几个方面：

1、光合细菌的常规培养方法依赖于光照，而大规模生产受限于昂贵的光反应器的投资成本，国内多目前多采用粗放光静止培养方法，利用透明玻璃瓶、塑料瓶、玻璃缸、塑料袋或塑料桶等容器进行光照静置小体积培养，在大体积培养方面偶尔用槽式，池子等半开放或开放式培养，但这些培养方式进行光合细菌生产的存在规模小，或者培养效率低，菌体浓度和纯度低，易遭杂菌污染。

2、由于目前海洋光合细菌生产多采用光照静置培养，光合细菌是进行光自养或光异养生长，细菌的倍增时间长，造成生产周期长，通常需要7-20天。尤其是在规模化生产中，当从少量的菌种扩大生产到几十立方的规模，常规的光静置培养需要很长的时间，生产周期长，降低了设备利用率，增加了生产成本。

3、目前海洋光合细菌的规模化生产通常使用半开放和开放式的生产方式，培养基易染菌，光合细菌的得率低，菌体浓度通常低于10⁷cfu/ml，并且开放生产中杂菌率非常高，影响产品品质。

4、目前海水光合细菌的培养基中沿袭淡水光合细菌培养方式，过度使用磷酸盐，容易与海水中的钙镁离子形成沉淀，一方面造成试剂浪费，并且会影响培养基的透明度，干扰生长过程对菌体生长密度的检测，同时浑浊的培养基还会减少有效光照强度。

由于上述这些问题的存在，极大限制了我国海洋光合细菌的规模化生产及其应用。

发明内容

针对海洋光合细菌规模化生产中存在的问题，本发明的目的是提供一种生产效率高，生产成本低的海洋光合细菌规模化生产方法，以促进海洋光合细菌产品在水产、食品、医药和环境保护等领域的应用。

本发明根据光合细菌自身的代谢特点：即能够在需氧不需光的条件下快速异养生长来增加细胞数量，又能够在光厌氧的条件下高效率利用低分子的有机物进行生长，以及合成一些生物活性物质的特点，通过设计需氧不需光的暗反应与光厌氧发酵两阶段相耦合的生产工艺，并根据光合细菌在需氧异养条件下可快速生长的特点，设计了适合该阶段的营养丰富的培养基，促进光合细菌迅速生长，快速增加细胞的数量，此阶段生产装置只需要一般好氧发酵的发酵罐，不需要昂贵的光反应发酵罐；而第二阶段通过在厌氧光合管道中利用不会产生沉淀的，低营养发酵培养基进行光厌氧发酵，这个阶段的生产规模可灵活的通过增减光合管道来设置，并且还可以通过在光厌氧发酵中应用不同补料方式实现分批发酵，间歇补料，和连续补料等方式生产，具有投资少，高度灵活性，可根据具体的情况采用不同生产方式和不同生产规模的特点。

本发明的具体技术方案如下：一种海洋光合细菌规模化生产方法，包括需氧不需光发酵过程和光厌氧发酵过程两个阶段；首先在需氧不需光的发酵过程中，海洋光合细菌菌种与需氧不需光发酵阶段培养基按1∶（5-20）的体积比混合后置于需氧不需光的普通微生物发酵罐中发酵，需氧不需光发酵阶段培养基的营养成分及质量百分比为：乙酸钠：0.15-0.5%、酵母粉：0.0001-0.5%、蛋白胨：0.001-0.5%、氯化铵：0.01-0.2%、糖（葡萄糖或蔗糖、麦芽糖等其他常用碳源）：0.0001-2%、H₂PO₄ ^-：0.001-1%、Fe³⁺：0.00001-0.01%；培养基其余成分为无污染的海水或者人工海水，培养基通过1-5 M的乙酸和1-5 M氢氧化钠调节酸碱度，最终的培养基的pH介于6.0-7.5之间，培养基经115-121℃高温灭菌后使用。此阶段发酵容器可以是试管、三角烧瓶或发酵罐，并且对光照没有要求，有光无光都可发酵，发酵容器或设备要求要求能够高压115-121℃灭菌，抗海水腐蚀，发酵过程中要求温度可控和无菌通气供氧。在此阶段光合细菌发酵过程中光合细菌种子液按照比例加入培养基后好氧发酵，发酵期间温度控制在20-40℃，发酵时，发酵液的溶氧分压为50%-100%饱和溶氧分压。发酵罐发酵过程pH控制在6.3-8.0之间；需氧不需光的发酵阶段的发酵时间为24-48小时，当发酵罐中的光合细菌浓度达到波长660nm下光密度值（即OD₆₆₀）大于0.8时可以停止发酵，并将发酵罐中的发酵液按照1：（3-15）的体积比用灭菌的管道输送到第二阶段进行光厌氧发酵：此过程的培养基营养成分低于需氧不需光的过程的培养基，并且不含葡萄糖，蔗糖或麦芽糖等碳源成分，光厌氧发酵培养基成分及质量百分比为：乙酸钠：0.15-0.5%、酵母粉：0.0001-0.1%、蛋白胨：0.0001-0.1%、氯化铵：0.0001-0.1%、H₂PO₄ ^-：0.0001-0.01%、Fe³⁺：0.00001-0.001%，培养基其余成分为无污染的海水或人工海水，培养基酸碱度通过1-5M的乙酸或1-5M氢氧化钠调节，最终pH 应介于与6.0-7.5之间。培养基要除菌消毒，除菌消毒的方法可以通过在密闭不锈钢容器中煮沸30-60分钟，或者经高压灭菌设备110-121℃灭菌20-30分钟，也可利用高氯酸或二氧化氯等含氯的消毒剂除菌，保证除菌后的培养基中的杂菌应低于3 cfu/ml，并且残留的游离氯应低于0.06 mg/L。光厌氧发酵过程中发酵温度为15-40 ℃，可通过日光温室，或者水浴进行温度调节，光源可利用自然光照或者人工辅助光源，但应避免太阳光暴晒，每天保证8-24小时光照时间，光强度应介于1200 Lux-8000 Lux之间；通常使用日光灯等人工辅助光源能增加光照时间，进而加快光厌氧阶段光合细菌的生长速率，缩短发酵周期。海洋光合细菌光厌氧发酵阶段在透明的管道内发酵，2-15天后当菌体的浓度OD₆₆₀大于1.2时，并且继续延长发酵时间菌体的浓度增加缓慢，即OD₆₆₀每天的增长量小于0.1时，终止发酵。

发酵后的海洋光合细菌可直接灌装或离心浓缩液体或通过其他载体吸附、干燥等工艺包装制成可用于食品、医药、水产、种植、养殖、环保等领域的光合细菌制剂。

光厌氧发酵阶段使用的透明管道可采用透明玻璃，透明有机玻璃，或其他透明塑料如聚乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯，聚氨酯（Polyurethane， PU），热塑性聚氨酯（Thermoplastic Urethane，TPU）等材料，可以是透明的硬质管道或软管道，管道要求能够耐受大于0.15兆帕的静水压，管道的直径介于90mm-600mm之间，并且能够耐受3M的盐酸或5M的烧碱处理100小时以上。管道与管道直接可以通过不锈钢法兰或卡箍进行连接。管道的长度可以根据生产需要和生产场地具体而定，一般单条管道长几米到上千米。该阶段可同时进行多条管道的并联发酵，扩大发酵规模。管道之间可设置相应口径的不锈钢的阀门控制管道液体的流向和流量。还可以通过三通或阀门连接耐酸碱腐蚀的泵，用于管道消毒或者管道清洗，培养基发酵液混合等。

本发明具有以下优点：

1、设备投资少，不需要昂贵的光合反应发酵罐，便于放大进行规模化生产；

2、根据光合细菌生长代谢特点设计了能够满足光合细菌快速增殖的需氧不需光-光厌氧耦合发酵工艺；

3、在需氧不需光的发酵阶段的培养基中添加了葡萄糖等可发酵碳源，并且在光厌氧培养基中提高的有机氮源如蛋白胨、酵母粉和无机氮源如氯化铵或硫酸铵的浓度，提高了光合细菌好氧异养生长繁殖速率高，可快速增加菌体的生物量，相对于常规的光照静止培养能大大缩短发酵时间2-8倍，并且活菌数提高2-10倍；

4、本发明的光厌氧发酵阶段使用透明管道，可通过调整管道的长短控制生产规模，并且光厌氧发酵阶段也可单独使用，并根据补充培养基的方式进行分批发酵、连续发酵或流加发酵，具有非常高的灵活性和可控程度；透明管道光厌氧发酵可利用自然光源或人工光源提高了光合细菌的生长率。

具体实施方式

下面通过具体实施例来进一步详细说明本发明。

实施例1：

材料与方法

1.1菌株

从海泥中富集光合细菌并分离纯化出的光合细菌菌株GH1、GH2用于实验，经形态鉴定、生理生化特点结合16S rDNA序列分析确定为沼泽红假单胞菌和小红卵菌属嗜硫小红卵菌。

1.2培养基

光合细菌富集培养基成分（质量百分比）含有：0.2%乙酸钠、0.001%磷酸二氢钾0.03%氯化铵，0.005% 三氯化铁，其余成分为过滤的陈海水配制，用5%的乙酸调节pH为7.0。培养基装入透明的三角烧瓶或透明玻璃瓶中经115℃，高压灭菌30min。

光合细菌需氧不需光的暗发酵培养基成分（质量百分比）含有：0.3% 乙酸钠、0.005%磷酸二氢钾、0.1%氯化铵，0.1% 酵母浸粉，0.3%葡萄糖，0.005%三氯化铁，其余成分为陈海水，用滤纸过滤除去杂质陈海水配制，5%的乙酸条件pH为6.8，培养基装入三角烧瓶中经115℃，高压灭菌30 min。

光合细菌光厌氧发酵培养基成分（质量百分比）含有：0.3%乙酸钠、0.03%氯化铵，0.01%酵母浸粉，0.005%三氯化铁，其余成分为陈海水，用300目过滤袋过滤陈海水配制，用2M的乙酸调节培养基的pH于6.5，培养基经115℃，高压灭菌30 min。

1.3海洋光合细菌发酵

海洋光合细菌的发酵分为需氧不需光的暗发酵和光厌氧发酵两个阶段。

1.3.1需氧不需光的暗发酵阶段

此阶段使用的培养基为需氧不需光的暗发酵培养基，在无菌条件下将光合细菌的单菌落接种到装有5 ml液体培养基的试管中，30 ℃震荡培养30小时，继续将试管中的光合细菌按照10%的接种种量接种到50 ml培养基的250 ml三角烧瓶中，30 ℃发酵，150转震荡培养24小时后，继续接种到装有450 ml的2 L发酵液中，30℃发酵，150转震荡培养30小时；继续将光合细菌菌液接种到大容量的三角烧瓶中，30℃发酵，150转震荡培养24小时后，此时光合细菌发酵液体积达到5 L，细菌的OD₆₆₀为1.6-2.8之间；将发酵液接种到50 L光合细菌培养种子罐发酵，发酵时通入无菌空气，通气量为0.1立方米/分钟，搅拌转速为150转，30℃发酵30小时，继续按照10 %的接种量接入更大的种子罐或者生产罐中进行30℃发酵24-48小时，此时发酵液的OD₆₆₀值介于1.6-3.0之间。

1.3.2 光厌氧发酵阶段

此阶段的培养基为光厌氧发酵培养基。将需氧不需光发酵的菌液通过无菌的管道按照1：5的比例接种于含有培养基的经过无菌处理的透明管道中。本实验中的透明管道为聚氨酯PU透明软管，软管壁厚0.3 μm，管道直径为25 cm，管道和管道直接通过同样口径的不锈钢法兰卡箍等连接。管道连接后在使用前先经自来水清洗干净，控干水分，再用总量为管道总体体积1/20（体积比）的3M的烧碱，通过外接耐腐蚀水泵强迫循环循环清洗30分钟后排干碱液，继续加入总量为管道总体体积1/20（体积比）3M的乙酸进行循环消毒30分钟后，排干乙酸，用总量为管道总体体积1/10的在密度容器中煮沸30分钟后冷却到50±5℃的自来水，通过泵清洗后30分钟。

透明管道内培养基的灭菌是在发酵罐中通过110℃ 30分钟高温灭菌后加入，或可用其他化学化学方法灭菌，如加入次氯酸或二氧化氯灭菌，灭菌后应加入无菌的硫代硫酸钠溶液进行中和防止残余游离氯>0.05 mg/L。

光厌氧阶段的发酵温度为25-30 ℃，照强度为1500 Lux-5000 Lux，每日最低光照时间8小时，发酵时间为3-4天，当OD₆₆₀>1.5 完成发酵。

1.4光合细菌发酵的质量控制：光合细菌发酵液的纯度和生长浓度测定

光合细菌发酵液的纯度检测，采用添加2%的琼脂光合细菌富集固体培养检测，将在无菌生理盐水稀释了10⁴ 、10⁵ 、10⁶倍的光合细菌发酵液100 μl涂布在光合细菌富集固体培养基上，经30℃，3-5天的培养，检测光合细菌和杂菌的数量计算杂菌污染率，杂菌污染率=杂菌数/（杂菌数+光合细菌菌数）%，整个光合细菌的发酵过程中杂菌污染率不超过2%。

光合细菌的生长浓度测定，利用分光光度计检测光合细菌发酵液在OD₆₆₀的光密度值，以为发酵的灭菌的培养基为对照。发酵结束后的光合细菌培养液的OD₆₆₀应大于1.2。

实验结果：

实验在6月末到9月末期间进行，前后共发酵了7个批次，同时以传统的培养方式作为对照。

表1 海洋光合细菌发酵的条件和菌液的浓度杂菌率

注：室内的温度通过加热器和通风扇调节。

表1为不同批次光合细菌培养的测定结果。海洋光合细菌经过需氧不需光-光厌氧耦合发酵工艺，在3-6天都能达到较高的菌液浓度。另外发现发酵温度30℃比25℃的生长的快些，所以适当控制发酵温度有助于光合细菌的发酵，缩短发酵时间。实验中需氧不需光-光厌氧耦合发酵工艺的发酵时间最短可以缩短到3天，而传统的光照静止培养方法光合细菌的浓度OD₆₆₀在10天后才能达到1.2。

实施例2：

将100 ml海洋光合细菌种子液按照10%的接种率接种到含有1L培养基3L三角烧瓶中进行需氧不需光的暗发酵；培养基的具体成分为：0.3%的乙酸钠，0.005%磷酸二氢钾0.05%的氯化铵，0.05% 酵母浸粉，0.3%葡萄糖，0.005%三氯化铁，用培养基用海水配置，通过2M的乙酸调节pH=6.5；培养基经115℃，30 min高压灭菌。光合细菌发酵条件为：温度28℃，150转/分震荡培养24小时，菌液的浓度达到OD₆₆₀ =2.83。将该发酵液按照10%接种量接入到7升含有灭菌培养基小型种子罐中发酵继续发酵，发酵条件为：温度30℃，搅拌速率150转/分钟，调节通气量为10 L/min，发酵24小时后发酵液的OD₆₆₀为2.15。发酵液继续接种到含有70 L灭菌的培养基的100 L发酵罐，发酵温度为28℃，搅拌速率为150转/分钟，通入无菌空气的量为0.1m³/min；24小时后发酵液的浓度为OD₆₆₀=1.86。将发酵液通入到无菌的直径25厘米透明PU管道中进行光合厌氧培养，同时按照9：1的比例通入光合细菌光厌氧培养液，光厌氧发酵培养培养基具体的成分为：0.3%乙酸钠、0.02%氯化铵，0.01%酵母浸粉，0.0002%三氯化铁，用2 M的乙酸调节培养基的pH于6.5。培养基在发酵罐中115℃，高压灭菌30分钟。透明管道以此经5 M的氢氧化钠处理30分钟。光厌氧发酵中光合管道中，室温25±4℃培养，日光等光照强度控制在2000±150 Lux，发酵3天后管道中的菌浓度达到OD₆₆₀=1.54，第四天光合细菌菌液的浓度OD₆₆₀=1.65，颜色红到紫红，检测杂菌率低于0.1%。实验中从开始100 ml的海洋光合细菌种子液扩大到70 L的发酵规模，只经历了四天，大大缩短了发酵时间。而采用常规的光照静止培养方法需要经过半个月以上的时间。

实施例3：

将50升好氧不需光发酵得到的高浓度光合细菌（其菌体OD₆₆₀ =2.0），与光厌氧发酵培养基按照1：4、1：5，1：6的比例分别加入到光厌氧发酵的直径为30厘米的透明的聚氨酯（PU）管道中；管道事先经过5%的NaOH清洗，10%的乙酸灭菌后，经无菌的海水冲洗。

光合细菌在光合管道中在室温25±5℃条件下白天自然光照，夜间通过日光灯照射，发酵5天后，分光光度计660nm下检测菌体的浓度，以没有接种光合细菌的培养基为空白对照。结果如表2所示。

表2 不同接种稀释比例对海洋光合细菌光厌氧单独发酵的影响

从上述的结果可看出，不同比例的接种量对发酵还是有影响的，稀释的比例越小，经过5天后的发酵液浓度越高。

同时进行下列实验：将发酵5天后的光厌氧发酵的NO.2号管道继续进行半连续的批次补料的连续发酵，具体步骤为：1、每天加入30 L的经高压灭菌的光厌氧培养基于透明管道中。将新加入的培养液与临近5米管道的的光合细菌发酵液混合。培养基中含有0.3%乙酸钠、0.02% 氯化铵，0.01% 酵母浸粉，0.002% 三氯化铁，用2 M的乙酸调节培养基的pH=6.5。

2、同时从管道的末端每天放出30 L的发酵好的光合细菌发酵液。

3、每天检测发出的光合细菌发酵液的浓度。

4、操作过程要保证无菌，可通过75% 的酒精对管道和接种设备消毒。

连续发酵30天，每天的发酵液的菌液的浓度监测结果如表3所示。

表3 独立光厌氧发酵中NO.2号光合管道经过每天30 L补料的半连续发酵的光合细菌浓度

发酵天数	OD₆₆₀	发酵天数	OD₆₆₀	发酵天数	OD₆₆₀	发酵天数	OD₆₆₀	发酵天数	OD₆₆₀	发酵天数	OD₆₆₀
												1	2.30	6	2.05	11	1.96	16	1.77	21	1.86	26	1.76
2	2.33	7	2.06	12	1.87	17	1.77	22	1.82	27	1.73
												3	2.33	8	1.98	13	1.92	18	1.78	23	1.68	28	1.76
4	2.28	9	1.86	14	1.83	19	1.90	24	1.71	29	1.72
												5	2.20	10	1.92	15	1.75	20	1.75	25	1.73	30	1.72

从实验结果可看出，在单独利用光合管道进行连续一个月的光厌氧半连续培养中，每天可收获30 L的光合细菌发酵液，在整个过程中光合细菌的光厌氧发酵都能保持一个良好的运行状态，最终光合的菌浓度都能达到OD₆₆₀大于1.5。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims

1.一种海洋光合细菌规模化生产方法，其特征在于包括需氧不需光发酵过程和光厌氧发酵过程两个阶段；首先是在需氧不需光的发酵过程中，海洋光合细菌菌种与需氧不需光发酵阶段培养基按1∶（5-20）的体积比混合后置于发酵容器中发酵，发酵温度为20-40℃，发酵时间为24-48小时，发酵液的溶氧分压为50%-100%饱和溶氧分压，发酵过程pH控制在6.3-8.0之间，细胞密度OD₆₆₀达0.8以上后停止发酵；第二阶段的光厌氧发酵过程中，将第一阶段发酵液按照1：（3–15）的体积比通入到透明无菌的管道中进行光厌氧发酵过程，发酵条件为：温度为15-40℃，发酵时间为2-15天，采用光厌氧培养基，发酵过程需要光照不需通气充氧，光强要求1200-8000lux之间，每天的光照时间在8-24小时；当菌体的浓度OD₆₆₀大于1.2，且OD₆₆₀每天的增长量小于0.1时，终止发酵；所述需氧不需光发酵阶段培养基的营养成分及质量百分比为：乙酸钠：0.15-0.5%、酵母粉：0.0001-0.5%、蛋白胨：0.001-0.5%、氯化铵：0.01-0.2%、糖：0.0001-2%、H₂PO₄ ^-：0.001-1%、Fe³⁺：0.00001-0.01%，培养基其余成分为无污染的海水或者人工海水，培养基的pH介于6.0-7.5之间，培养基接种发酵前需要经115-121℃高温灭菌20-30分钟；所述需氧不需光发酵过程在有光或无光条件下发酵；所述光厌氧培养基的成分及质量百分比为：乙酸钠：0.15-0.5%、酵母粉：0.0001-0.1%、蛋白胨：0.0001-0.1%、氯化铵：0.0001-0.1%、H₂PO₄ ^-：0.0001-0.01%、 Fe³⁺： 0.00001-0.001%，培养基其余成分为无污染的海水或人工海水，培养基pH 介于6.0-7.5之间。

2.根据权利要求1所述的海洋光合细菌规模化生产方法，其特征在于所述需氧不需光发酵过程的发酵容器为试管、三角烧瓶或发酵罐。

3.根据权利要求1所述的海洋光合细菌规模化生产方法，其特征在于所述光厌氧培养基需灭菌消毒，并保证灭菌后的培养基中的杂菌应低于3 cfu/ml，残留的游离氯应低于0.06 mg/L。

4.根据权利要求3所述所述的海洋光合细菌规模化生产方法，其特征在于所述灭菌消毒的方法为密闭不锈钢容器中煮沸30-60分钟，或者经高压灭菌设备110-121℃灭菌 20-30分钟，或利用含氯的消毒剂灭菌。

5.根据权利要求1所述所述的海洋光合细菌规模化生产方法，其特征在于所述透明管道为硬质或软质透明管道，耐压大于0.15兆帕。

6.根据权利要求1所述所述的海洋光合细菌规模化生产方法，其特征在于所述的透明管道需灭菌，其方法为使用管道体积1/5-1/20体积的3-5M的烧碱清洗管道30-60分钟，再经1/5-1/20体积的3-5M的乙酸清洗灭菌30-60分钟，最后用1/5-1/10体积的无菌水清洗30-60分钟；或者通过1/5-1/20体积的3-5M的烧碱清洗管道30-60分钟，再经1/5-1/20体积的3%-5%的过氧化氢清洗30-60分钟灭菌。