CN1096499C

CN1096499C - 一种培养葛仙米的方法

Info

Publication number: CN1096499C
Application number: CN99120005A
Authority: CN
Inventors: 刘永定; 李敦海; 宋立荣; 黄泽波; 胡春香; 吴天福; 沈银武
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 1999-10-22
Filing date: 1999-10-22
Publication date: 2002-12-18
Anticipated expiration: 2019-10-22
Also published as: CN1294190A

Abstract

本发明公开了一种培养葛仙米的方法，1、培养液配制将配制好的贮藏液加入水中的顺序是，硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬铁铵、乙二酸四乙酸二钠盐、碳酸钠、土壤浸出液、微量元素A5、磷酸氢二钾按比例配制。2、藻种制备，首先将葛仙米球形体用乙醇溶液洗涤；其次是藻种无菌纯化；第三是藻殖段制种；第四是扩大制种。3、制备接种物。4、培养。5、实时监控。6筛选收获。7、提高筛上球形体的机械强度。8、干燥。本发明方法易行，操作方便，无污染，安全性高，生长过程短，效率高，营养好，广泛适用于城乡规模化培养。

Description

一种培养葛仙米的方法

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种培养葛仙米的方法。

念珠藻是蓝藻门孢子植物，是一个丝状藻类“属”，其原植体由许多直径数微米的纤细藻丝集结成群体，群体形状因“种”而异，如发状念珠藻(Nostoc flageliforme kutz.)、地木耳(Nostoc commune Vauvh.)、球状念珠藻(Nostoc sphaeroides kutz.)在新鲜状态下分别呈头发状、木耳状或小球(珠)状，干燥后程度不等地有所缩变。由于蓝藻是原核生物，也被归类为细菌。中国科学院典型培养物保藏中心水生生物研究所淡水藻种库(FACHB-cocollection，CAS)、法国、美国、日本、德国等地方都收藏有不少念珠藻藻种。念珠藻不仅在自然界里普遍发生，而且自古以来也是许多民族的天然食品。葛仙米和发菜等念珠藻都是我国一些地区人民的传统食物，其中，葛仙米因其丰富的营养价值，在《本草纲目》、《本草纲目补遗》、《野菜博录》、《陕西中草药》及《梧州府志》等古籍中都已有详细记载。葛仙米具有食疗、保健、滋补等功效，天然采集品目前市售价高达每公斤人民币1600元。发菜远销海内外，资源开发与草场保护已发生尖锐矛盾。葛仙米的学名为球形念珠藻。“葛仙米”是其在中国按传统称谓的名称。相传晋朝的炼丹家、药学家葛洪，在任官期间遭贬谪途经鄂西北某镇时一病不起。因为其时民不聊生，几无充饥之食，幸亏当地的稻田、山地中产一种类似木耳的食物，人们以此充饥。葛洪因此度过难关，并医好了自己的病。葛洪发现，这种食物对恢复体力、调气、养颜、治疗一些病症十分有益。他将这种食物作为药物对他人治病，而且，当他后来被朝廷如回得到重新启用时，将这种食物馈赠给娘娘治好了夜盲症，人们因此把这种原称为田木耳的东西改称作葛仙米。葛仙米的天然生产状况已经衰落，需求和采集式生产的矛盾不可回避。随着人类活动中剧，近年来，葛仙米的生长地逐渐缩小，产量也不断减少。其天然年产量不足五吨，而且日趋减少，远远满足不了市场的需求，随着近年来的旅游资源开发，过度的采集又带来了生态、环境的破坏和自然资源的萎缩。过去许多葛仙米的高产田如今也已难觅葛仙米的“仙踪”。这与现代农业大量使用的人工合成的化学物质有关，与全球气候变化、环境状况改变也不无关系。葛仙米产区有很大的局限性，在全球范围虽然不少地方可能发现其分布，但实际上也只在有限的地区能形成群落，甚至在一个区域内，其分布也呈现出特异的选择性，或一水之隔，或隔山相望，或处山之阳阴，都有可能构成葛仙米能或不能生长的差别。这种特异性说明在天然条件下，葛仙米的生长对自然条件的选择极为严格。葛仙米要求的生长条件是多种多样的，如矿质营养，温度，光照，水的酸碱度，以及有无有害气体、农药、自然天敌等。全球气候变暖，环境变化和污染已不是短期内凭一部分人的意志可以改变的，欲求粮食的丰收，农药与化肥的使用也不可避免。于是矛盾就出来了，一方面是葛仙米产量下降，而人们的需求上升；另一方面是产地减少。但至今见到葛仙米人工培养的报道。

本发明的目的是提供了一种培养葛仙米的方法，方法易行，操作方便，解决了葛仙米生长快，产量高、营养好的问题。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术措施：进行葛仙米的养殖，首先是培养液的制配，培养液营养盐利用市售粗盐，溶于自来水即可，营养液采用BG110培养基配方，利于葛仙米生长，配制时营养盐按顺序加入，减少沉淀的产生，然后将配制好的培养液进行灭菌。其次是藻种制备：A、原种，野外采集藻种，实验室分离纯化，得到不同品系的无杂藻、无菌、易培养、产量高、成色好的藻株；B、段殖体(藻殖段)培养，利用培养得来的球形体，在实验室进行藻殖段大量诱导，然后以藻殖段为种子，进行大量培养；C、扩大制种，将原种的球形体破碎或诱导的藻殖段扩大培养，获得的微型群体作为规模培养的接种物。3、培养，在进行静置规模化培养葛仙米时，可采取逐级培养，因为一次培养的周期为9-11天，由微小群体培养在10天内很难达到理想的大小(直径约0.5cm)。这就要求不断地转移培养物至另一培养器或更换培养液，逐级增大球形群体的体积。4、培养实时监控，建立监控条件和标准。需要的设备仪器：温度计，光度计，酸碱指示计，显微镜(带荧光)，微机等，以及常规的实验室设备和技术支持。将所有资料建立数据库，微机管理。5、球形体筛选收获，比起其它的微藻米，葛仙米的收获要容易的多。它得大群体肉眼可见，不具漂浮性，这就容易通过过滤的方法来收集。6、提高筛上球形体的机械强度，生长快的球形体往往机械强度低，在干燥后不能很好的保持较美观的形状，在食用前重吸水后也不能恢复原形。所以在收获前提高球形体的机械强芳就显得尤为重要。7、收获与干燥，将提高了机械强度的藻体晒干、风干或烘干均可。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：设备简单，操作方便，无污染，营养好，安全性高，葛仙米培养的过程中吸收二氧化碳，并向大气中排放出氧气，可起到净化空气的作用，不产生有害或有毒物质，培养液盐度低，酸碱度接近于自然水体，可循环利用。生长过程短，葛仙米生长快，10天就可完成对数生长，效率高，适量接种的培养物，10天后干物质量可达1g/L每立方米培养液可收获1kg干藻，可用于球状体所有水生念珠藻的培养，广泛适用于城乡规模化培养。

实施例：

培养葛仙米的方法其步骤如下：

1、培养液配制(1000ml)：将称好或配制好的贮藏液加入水的顺序是：硫酸镁0.07-0.08g、氯化钙0.03-0.042g、柠檬酸0.005-0.007g、柠檬铁铵0.005-0.007g、乙二酸四乙酸二钠盐0.001-0.002g、碳酸钠0.03-0.05g、土壤浸出液2.5-3.5ml、微量元素A51ml、磷酸氢二钾0.07-0.09g，配制好的培养液用118-122℃高温条件下灭菌20分钟，冷却后使用。

2、藻种制备：(1)原种：将野外采集的葛仙米球形体用70％的乙醇溶液快速洗涤20秒钟，然后在灭过菌的培养液中洗涤3遍。将此球形体放在玻璃浆器中，加入少量无菌培养液，稍许匀浆。制备无菌培养液的1.2％的琼脂平板，将上述球形体的匀浆液涂布在琼脂平板上，用封口膜将培养皿封好，置于26-36℃光照培养箱培养，约1个月后，就可看到有小的球形体生长在琼脂平面上，这就是葛仙米藻种。

(2)藻种的无菌纯化：将上述方法得到的球形体匀浆破碎，接入含有0.5％蔗糖，100ug/l氨苄青霉素，0.1％酵母提取物的培养液中，置黑暗条件下，30-35℃培养24小时。然后离心，无菌培养液洗涤3次，将藻体同(1)涂平板培养，获得球形体。即为无菌培养物(可显微检测是否有菌)。

(3)藻殖段制种：将上述分离的藻种接种于培养液，在玻璃培养器中通气培养。通气量为1-10L/分钟。约10天后，收集直径约3-10mm的球形体用无菌的蒸馏水洗涤一次，然后重新放到新鲜无菌培养液中，置于光照培养箱，在25-30℃，5-100μE.m^-2.s^-1光强下诱导2-3天。将悬浮在培养液中的藻殖段转入新鲜培养液中静止或通气培养，制备藻种。

(4)扩大制种：将球形体匀浆，接入培养液，按照(1)培养条件，通气培养，制备藻种。

3、制备藻种：得到较大的理想的球形体的关键(即逐级培养)是球形体的逐级培养。因此培养物制备可以分为4步：(1)原种制备(见1)；(2)将原种破碎物或藻殖段接入培养液，在玻璃培养器中以1-10L/分钟的速度通气培养，并施以光照，强度在10-800μE.m^-2.s^-1之间。10-30天后，收集小球形体，无菌培养液洗涤3次。此球形体称一级培养物。(3)将一级培养物按步骤(2)再培养一次，10-30天后，球形体长大到约直径1mm，称此球形体为二级培养物，洗涤后的二级培养物就可作为大量培养的接种物。

4、培养

(1)培养场地与培养器(光生物反应器，photobioreactor)：选择采光好、水源方便的地方作为培养场地。可在露天或塑料大棚中，或有条件的地方在玻璃温室安置光生物反应器。光强在10μE.m^-2.s^-1和全日照光强之间均可。光生物反应器有一个进样口(加培养液和接种，在反应器上部)一个排液口(排放培养液，在反应器底部)，一个通气口(在反应器底部)，并配备一个孔径约0.5cm的不锈钢筛，用来筛选合格的球形体。

(2)接种与培养：将二级培养物作为接种物，以每升培养液0.5-2g湿重的比例接种于光生物反应器。用空气充气泵通气(通气起到搅动和提供CO₂的作用)以1-10L/min的速度从通气口通气。为了见少气体对培养物的污染，地进入反应器之前，将气体以棉花和PH值为1-3的浓硫酸水溶液过滤。通气量由阀门控制。

5、实时监控

建立的监控条件和标准。温度：10-30℃；光强10-800μE.m^-2.s^-1：pH：8.0-8.9；其它微生物如细菌，真菌和杂藻检测：(1)涂平板法：将培养液涂布在细菌培养的基本培养基上，37℃温培24小时以上后，观察是否由菌落出现；(2)显微观察：取少量培养液，加入DAPI(一种荧光染料)至终浓度1μg/ml染色5分钟，在荧光显微镜下用紫外光激发观察。若发现有蓝绿运动亮点，即为污染微生物。(3)显微镜下直接观察是否有杂藻存在。营养盐浓度检测方法参看美国出版的Standard Methods for Water and Waste Water一书。

若检测的值不在上述范围内，则需通过相应的措施解决。如：温度可通过调节室内温度控制；避开严寒和酷暑季节；光强度：光强低的晚上或阴天可开动照明设备，光强过高时采取遮光方法。pH通过酸或碱调节。微生物污染严重时则需彻底更换培养液，并对反应器进行灭菌处理。营养不足时则注入新鲜培养液或添加营养盐等等。

6、筛选收获：首先制得孔略小于0.5cm的不锈钢筛子，将欲收获培养物过筛。直径0.5cm左右的球形体留在筛子上，这些就是我们所要获得的产品(称为筛上球形体)。筛下来的小群体和培养液在处理后继续培养。

7、提高筛上球形体的机械强度：将过筛后直径大于0.5cm的球形体通过下面任一途径提高机械强度。

(1)在培养液中加入1.5g/L的Na₂CO₃，将球形体转移到这种含有新鲜培养液中，以培养时的同样条件通气培养3-5天，收获即可。

(2)将合格的球形体静置于原培养液中，于低温下(1-10℃)静置10-15。并注意，在静止时，要将反应器置于少于10μE.m^-2.s^-1的光强下以防止球形体的裂解。

8、干燥：收获的球形体若不及时干燥，就会腐烂变质。干燥时，由于球形体胞外具有的多糖有高粘性，因此极易与盛放器皿黏结在一起。因此在干燥时把藻体放在绢布或丝网上就可避免黏结。干燥的方法有：筛干，风干或烘干。

Claims

1、一种培养葛仙米的方法，其特征是：

A、培养液制配；将配制好的贮藏液加入水中的顺序是，硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬酸铁铵、乙二酸四乙酸二钠盐、碳酸钠、土壤浸出液、微量元素A5、磷酸氢二钾按比例配制；

B、藻种制备：首先将葛仙米球形体用乙醇溶液快速洗涤，其次是将藻种无菌纯化，第三是藻殖段制种，第四是扩大制种；

C、制备接种物；

D、培养；

E、实时监控；

F、筛选收获；

J、提高筛上球形体的机械强度；

H、干燥。

2、根据权利要求1所述的一种培养葛仙米的方法，其特征是培养液制配：

硫酸镁 0.07-0.08g；

氯化钙 0.03-0.042g；

柠檬酸 0.005-0.007g；

柠檬酸铁铵 0.005-0.007g；

乙二酸四乙醇二钠盐 0.001-0.002g；

碳酸钠 0.03-0.05g；

土壤浸出液 2.5-3.5ml；

微量元素A5 1ml；

磷酸氢二钾 0.07-0.09g。

3、根据权利要求1所述的一种培养葛仙米的方法，其特征是藻种制备：首先将葛仙米球形体用70％乙醇溶液洗涤，在灭过菌的培养液中洗涤，将球形体放在玻璃匀浆器中，加入无菌培养液，再将球形体的匀浆液涂布在琼脂平板上，用封口膜将培养皿封好，置于26℃光照培养箱培养；其次是藻种无菌纯化，将球形体匀浆破碎，按入含有0.5％蔗糖，100ug/L氨苄青霉素，0.1％酵母提取物的培养液中，置黑暗条件下，在30-35℃培养24小时，离心，无菌培养液洗涤，获得球形体；第三是藻殖段制种，将分离的藻种接种于培养液，在玻璃培养器中通气培养，收集球形体用无菌蒸馏水洗涤，置于光照培养箱，在25-30℃，5-10μE.m^-2.s^-1光强下诱导2-3天，将藻殖段转入培养液中静止或通气培养，制备藻种；第四是扩大制种，将球形体匀浆，接入培养液，通气培养，制备藻种。

4、根据权利要求1所述的一种培养葛仙米的方法，其特征是制备接种物，将球形体逐级培养，首先原种制备；其次是将原种破碎物或藻殖段接入培养液，在玻璃培养器中以1-10L/分钟通气培养，并施以光照，强度在10-800μE.m^-2.s^-1之间，10-30天后收集小球形体，无菌培养液洗涤，获得一级培养物；第三是将一级培养物按第二步再培养一次，10-30天后，球形体长大到直径1mm，为二级培养物，洗涤后的二级培养物作为培养的接种物。

5、根据权利要求1所述的一种培养葛仙米的方法，其特征是提高筛上球形体的机械强度，在培养液中加入1.5g/L的Na₂CO₃，将球形体转移到含有Na₂CO₃的培养液中，以培养时的同样条件通气培养3-5天收获或将球形体静置于原培养液中，于低温下1-10℃静置10-15天。