CN104822698B - 细胞穿透肽以及包含该肽的缀合物和组合物 - Google Patents

细胞穿透肽以及包含该肽的缀合物和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN104822698B
CN104822698B CN201380044357.3A CN201380044357A CN104822698B CN 104822698 B CN104822698 B CN 104822698B CN 201380044357 A CN201380044357 A CN 201380044357A CN 104822698 B CN104822698 B CN 104822698B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
peptide
pep1
application
cargo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201380044357.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104822698A (zh
Inventor
金商在
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jane White Kell Co Ltd
Original Assignee
Jane White Kell Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jane White Kell Co Ltd filed Critical Jane White Kell Co Ltd
Publication of CN104822698A publication Critical patent/CN104822698A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104822698B publication Critical patent/CN104822698B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/13—Nucleic acids or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/18—Iodine; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0045—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent agent being a peptide or protein used for imaging or diagnosis in vivo
    • A61K49/0047—Green fluorescent protein [GFP]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/04—X-ray contrast preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
    • A61K8/606—Nucleosides; Nucleotides; Nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Abstract

本发明涉及细胞穿透肽与活性成分的缀合物及该缀合物的用途。具体而言，揭示包括细胞穿透肽的缀合物和包含该缀合物的组合物，该细胞穿透肽为包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、SEQ ID NO:1的任一序列的片段或具有与上述序列超过80％同源性的肽。

Description

细胞穿透肽以及包含该肽的缀合物和组合物
技术领域
本发明涉及源自人端粒酶逆转录酶(human telomerase reversetranscriptase；hTERT)的细胞穿透肽、细胞穿透肽和活性成分的缀合物和包含该缀合物的组合物。
背景技术
尽管低分子量物质、核酸、蛋白质、纳米颗粒等在分子水平上具有作为治疗物质的极大可能性，但低分子量物质、核酸、蛋白质、纳米颗粒等的使用由于无能力穿透组织和细胞膜而受限。递送此类物质至细胞内的***的发展已成为过去二十年来活跃的研究领域。在细胞内部运送物质已成为分子处理方法中的话题。将低分子量物质、核酸或纳米颗粒利用若干试剂、电穿孔或热休克运送至细胞内部。然而，难以找到一种适当方法在不破坏蛋白质的活性和完整性的情况下在细胞内部递送蛋白质。在20世纪80年代，在对人类免疫缺陷性病毒(human immunodeficiency virus；HIV)的细胞穿透能力进行的研究中，已发现，由特定的11种氨基酸组成的HIV-TAT蛋白质在于细胞内部的运送过程中起重要作用。因此，在20世纪90年代，探索在细胞内部运送蛋白质的恰当方法的研究成为重点研究领域。
已知端粒是染色体末端发现的遗传物质重复序列，端粒防止染色体损伤或合并至其它染色体上。端粒的长度在每次细胞***时缩短，且在一定次数的细胞***之后，端粒长度极端缩短至细胞停止***且死亡的程度。在另一方面，已知端粒延伸延长细胞的寿命。作为实例，癌细胞分泌被称为端粒酶的酶，该酶防止端粒缩短，因此导致癌细胞增殖。。
发明内容
本发明的目标在于提供一种细胞穿透肽。
本发明的另一目标在于提供作为细胞内的活性成分的载体的有用肽。
本发明的另一目标在于提供作为细胞内的活性成分的载体的有用肽，尤其是将活性成分局部地递送至线粒体的有用肽。
本发明的另一目标在于提供用于递送活性成分至线粒体以改善、预防或治疗线粒体相关的疾病或病症的有用肽。
本发明的另一目标在于提供活性成分和细胞穿透肽缀合成的缀合物。
本发明的另一目标在于提供包含活性成分和细胞穿透肽的缀合物的组合物。
本发明的另一目标在于提供包含活性成分和细胞穿透肽的缀合物的药物组合物。
本发明的另一目标在于提供包含活性成分和细胞穿透肽的缀合物的功能性化妆组合物。
本发明的另一目标在于提供包含活性成分和细胞穿透肽的缀合物的健康食品组合物。
本发明的另一目标在于提供包含活性成分和细胞穿透肽的缀合物的对比造影剂。
根据本发明的一个实施例的缀合物可为细胞穿透运载肽和活性成分的缀合物，其中运载肽为包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、具有与上述序列超过80％同源性的氨基酸序列的肽或上述肽的片段，且其中具有与上述序列超过80％同源性的氨基酸序列的肽和上述肽的片段为保持SEQ ID NO:1的细胞穿透能力的肽。
根据本发明中的缀合物的另一个实施方式，片段可由三个或更多氨基酸组成。
根据本发明中的缀合物的另一个实施方式，运载肽可由三十个或更少氨基酸组成。
根据本发明中的缀合物的另一个实施方式，上述运载肽可为具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽或具有与上述序列超过80％同源性的氨基酸序列的肽。
根据本发明的一个实施方式的对比造影剂可包含上述的任一种缀合物。
根据本发明的一个实施方式的对比造影剂可用于进行细胞对比造影。
根据本发明的对比造影剂的另一个实施方式，细胞可为干细胞。
根据本发明的一个实施方式的组合物可包含上述的任一种缀合物。
根据本发明中的组合物的另一个实施方式，活性成分可用于治疗或预防疾病，且组合物可为药物组合物。
根据本发明的组合物的另一个实施方式，活性成分可为用于功能性化妆品的活性成分，且组合物可为化妆品组合物。
根据本发明的组合物的另一个实施方式，活性成分可为用于功能健康食品的活性成分，且组合物可为健康食品组合物。
根据本发明的一个实施方式的活性成分的细胞质靶向递送***(targetingdelivery system)可包含上述的任一种缀合物，其中运载肽局部地移动至细胞质内且起到局部地递送所述活性成分至细胞质内的作用，其中具有与上述序列超过80％同源性的氨基酸序列的肽和该肽的片段为保持SEQ ID NO:1的细胞穿透能力的肽。
根据本发明的一个实施方式的活性成分的线粒体靶向递送***可包含上述的任一种缀合物，其中运载肽局部地移动至线粒体内且起到局部地递送所述活性成分至线粒体内的作用，其中具有与上述序列超过80％同源性的氨基酸序列的肽和该肽的片段为保持SEQ ID NO:1的细胞穿透能力的肽。
根据本发明的一个实施方式用于调节线粒体活性的组合物可包含上述的任一种缀合物，其中运载肽局部地移动至线粒体内且起到局部地递送所述活性成分至线粒体内的作用，其中具有与上述序列超过80％同源性的氨基酸序列的肽和该肽的片段为保持SEQ IDNO:1的细胞穿透能力的肽。
根据本发明的用于调节线粒体活性的组合物的另一个实施方式，组合物可为用于与线粒体有关的疾病或病症的治疗、预防、进展抑制或症状缓和的药物组合物，且活性成分为用于与线粒体有关的疾病或病症的治疗、预防、进展抑制或症状缓和的成分。
根据本发明的一个实施例的方法可为一种递送活性成分至细胞内的方法，其中该方法包含对需要的受试对象施用任一种上述缀合物的步骤，且其中运载肽为执行将活性成分递送至细胞内的细胞穿透肽，且其中具有与序列超过80％同源性的氨基酸序列的肽和序列的片段可为保持SEQ ID NO:1的肽的细胞穿透能力的肽。
根据本发明的方法的另一个实施方式，该方法可用于在细胞内部局部地递送活性成分至线粒体内。
根据本发明的肽可包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或上述肽的片段。SEQ ID NO:1的片段可由3至7个氨基酸组成。
根据本发明的肽可为具有包含SEQ ID NO:1的超过17个氨基酸的细胞穿透肽。
根据本发明的多核苷酸可编码上述细胞穿透肽。
根据本发明的载体可包含上述多核苷酸。
根据本发明的转化细胞可包含上述载体。
产业利用性
难以在细胞内部运送的活性成分可通过使用本发明所公开的肽或肽和活性成分的缀合物而易于在细胞内部运送。此意味着可增加活性成分的功效且因此可减少活性成分的剂量。因此，可最小化由于投药造成的副作用且可增加治疗的有效性。特别地，当将药物局部地递送至线粒体内时，可改善线粒体相关的疾病或病症，且可增加预防和治疗疾病的有效性。在化妆品的情况中，利用少量活性成分可产生显著效应。通过使肽与对比造影物质缀合，可将该肽用作对比造影物质以监测细胞移植的过程或在细胞处理中的移植细胞。特别地，该肽可实际上用作用于注入体内的干细胞的对比造影物质。
附图说明
图1表示在具有限制性酶切位点(EcoRI和HindIII)的pET28a载体中产生的绿色荧光蛋白(green fluorescence protein；GFP)融合构建体的图解。16-mer表示SEQ ID NO:1(pep1)。
图2表示用来产生具有SEQ ID NO:1(pep1)和绿色荧光蛋白的融合构建体的pET-28a(+)载体的图解。
图3表示FITC(CHO-F，对照组，蓝线)、CHO-TAT-F(标记有FITC的TAT肽，绿线)、CHO-F-pep-1(在N端标记有FITC的pep1，蓝线)和CHO-pep1-F(在C端标记有FITC的pep1，粉红线)在CHO细胞中的细胞摄入的结果。将CHO细胞以如上所述肽处理达1小时、收集且通过FACS进行分析。红线表示未以任何肽处理的CHO细胞的背景值。
图4表示以FITC处理过的HepG2细胞系(HepG2-F，对照组，蓝线)、HepG2-TAT-F(标记有FITC的TAT肽，绿线)、HepG2-F-pep1(在N端标记有FITC的pep1，橙线)和HepG2-pep1-F(在C端标记有FITC的pep1，蓝线)在HepG2细胞中的细胞摄入的结果。将细胞以如上所述肽处理达1小时、收集且通过FACS进行分析。红线表示未以任何肽处理的HepG细胞的背景值。
图5表示TAT-F(标记有FITC的TAT)、F-pep1(在N端标记有FITC的pep1)和pep1-F(在C端标记有FITC的pep1)在CHO细胞中通过FACS分析的细胞摄入。在FACS分析之前，细胞以肽处理达1小时(对照组对应于CHO细胞系背景值)。
图6表示TAT-F(标记有FITC的TAT),F-pep1(在N端标记有FITC的pep1)和pep1-F(在C端标记有FITC的pep1)在HepG2细胞中通过FACS分析的细胞摄入。在FACS分析之前，细胞以肽处理达1小时(对照组对应于HepG2细胞系背景值)。
图7表示标记有FITC的具有SEQ ID NO:1的肽在HeLa细胞中的细胞摄入。将细胞以肽处理达1小时且通过FACS进行分析(对照组为仅以FITC处理过的组)。
图8表示与FITC结合的具有SEQ ID NO:1的肽的毒性和细胞活性检测的结果且其中每一种用来处理HeLa细胞。
图9和图10表示对于pep1在Huh7细胞系中的细胞穿透性质的流式细胞仪分析(flow cytometry)结果。
图11和图12表示对于pep1在人类T淋巴细胞系中的细胞穿透性质的流式细胞仪分析结果。
图13和图14表示基于FITC缀合的位置对于pep1的细胞穿透性质的流式细胞仪分析和共聚焦显微镜分析的结果。
图15和图16表示TAT肽和PEP 1在MCF7、Huh7和HepG2细胞系中的共聚焦显微镜分析的结果，以显示TAT肽与pep1之间的细胞内荧光信号水平差异。
图17为表示TAT肽和PEP1在MCF7、Huh7和HepG2细胞系中的细胞内荧光信号的皮尔森系数(Pearson’s coefficient)的平均色散的图解。
图18至图23表示以在Huh7、bmDC(小鼠骨髓来源树突状细胞)、CHO、COS7细胞系中的PEP1浓度为基础的分析结果，图24至图26表示pep1取决于时间的结果。
图27至图31表示通过流式细胞仪分析和共聚焦显微镜分析的PEP 1的细胞穿透性质的结果；其中使用不同的pep1浓度、温度和培养时间来处理Jurkat(人类T细胞系)、THP1(人类单核细胞系)、Rail(B细胞系)、K562(人类白血病细胞系)。
图32至图34表示在人类PBMC中具有不同浓度、温度和处理时间的pep1的流式细胞仪分析的结果。
图35至图36表示在人类PBMC和Jurkat中使用化学处理对pep1进行流式细胞仪分析的结果。
图37表示通过添加各种抗体执行比较pep1的细胞穿透性质的流式细胞仪分析的结果；其中pep1系以HSP70、烯醇酶、GAPDH(santacruz)和HSP90的抗体来处理。
图38为表示二茂铁羧基(Ferrocenecarboxylic)-pep1在大鼠神经干细胞(neuralstem cell；NSC)中的细胞摄入随着时间推移的图解。
图39为表示通过共聚焦激光扫描***测量的二茂铁羧基-pep1在大鼠NSC中的细胞摄入的图解，DAPI用来给细胞核着色。二茂铁羧基-pep1和以DAPI染色的细胞核。
图40表示通过细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8；CCK-8)检测和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase；LDH)活化检测分析的二茂铁羧基-pep1对细胞活性和细胞毒性的效应。
图41为具有以二茂铁羧基-pep1处理过的二茂铁羧基-pep1的脑部干细胞组的脑部磁共振图像(magnetic resonance image；MRI)图解，图42为具有未以二茂铁羧基-pep1处理过的二茂铁羧基-pep1的脑部干细胞组的MRI图解，图43为二茂铁羧基-pep1组的脑部MRI图解，且图44为盐水组的脑部的MRI图解。
图45表示产生具有SEQ ID NO:1的肽与绿色荧光蛋白(GFP)的缀合物的pET28a(+)载体(Promega)。
图46表示pET-28a载体且图47为克隆的图解。
图48图示用来在pET载体中产生GFP表达质粒的克隆策略。
图49图示细菌转化中的IPTG诱导的原理。
图50表示通过荧光显微镜分析的在各种细胞系中与pep-1结合的GFP的细胞穿透性质的结果。
图51表示图示GFP、TAT和pep1在各种细胞系中的细胞摄入的流式细胞仪分析的结果。
图52表示用来产生DNA(聚赖氨酸)-cpp缀合物的肽的主要结构，图53为图52中的聚赖氨酸缀合物的示意图。
图54表示与肽结合的DNA的电泳迁移率。
图55表示通过缀合至聚赖氨酸的pep1递送的DNA的细胞穿透性质的结果，如在各种细胞系中通过hTERT相关的荧光素酶检测所测量。
图56表示siRNA通过聚赖氨酸-pep1-FITC的细胞摄入的程度的结果，siRNA与聚赖氨酸-pep1-FITC结合以递送至细胞内。
图57表示图示通过缀合至pep1的荧光素酶siRNA适当进入Huh7细胞系内减少荧光素酶活性的荧光素酶检测的结果。
图58表示图示通过缀合至pep1的荧光素酶siRNA适当进入CHO细胞系内减少荧光素酶活性的荧光素酶检测的结果。
图59为表示具有线粒体定位标记物(，具有深红FM 644/665nm(Invitrogen公司))的pep1-FITC缀合物的细胞定位的结果的图解，(A)在MCF-7细胞中仅处理pep1-GFP缀合物，(B)仅处理线粒体定位标记物(深红FM644/665nm(Invitrogen公司))，(C)细胞的相位对比造影，(D)A和B的结合图解。
图60表示具有线粒体hsp70抗体的pep1-GFP缀合物的蛋白质印迹分析的结果；其中缀合物以MCF7(人类乳腺癌)细胞系处理。
图61为表示pep1-GFP在HepG2细胞系中的细胞摄入的图解。
具体实施方式
本发明的优选实例如下。
1.一种细胞穿透运载肽(carrier peptide)和活性成分的缀合物，其中该运载肽为包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、具有与上述肽序列超过80％同源性的肽，或上述肽的片段，
其中具有与序列超过80％同源性的肽和片段为保持SEQ ID NO:1的细胞穿透能力的肽。
2.如权利要求1所述的缀合物，其中该片段由至少3个氨基酸组成。
3.如权利要求1所述的缀合物，其中该运载肽由30个或更少氨基酸组成。
4.如权利要求1所述的缀合物，其中该运载肽为具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽或具有与上述序列超过80％同源性的氨基酸序列的肽。
5.如权利要求1所述的缀合物，其中该活性成分为选自以下物质中的至少一种：蛋白质、核酸、肽、脂质、乙二醇脂质(glycol-lipid)、矿物质、糖、纳米颗粒、生物产品、对比造影剂、药物和化合物。
6.如权利要求5所述的缀合物，其中该活性成分为DNA或RNA，和
其中在该活性成分为DNA时，该运载肽通过聚赖氨酸与DNA缀合。
7.如权利要求1所述的缀合物，其中该运载肽和该活性成分通过共价键选择性地通过连接子介导来结合。
8.如权利要求1所述的缀合物，其中该运载肽和该活性成分通过非共价键结合。
9.如权利要求5所述的缀合物，其中该活性成分为蛋白质或肽。
10.如权利要求9所述的缀合物，其中该活性成分为细胞因子、抗体、抗体的片段、治疗性酶、可溶性受体或配体。
11.如权利要求1所述的缀合物，其中该运载肽与异硫氰酸荧光素结合。
12.如权利要求1所述的缀合物，其中该运载肽与绿色荧光蛋白(GFP)结合。
13.如权利要求1所述的缀合物，其中该活性成分与上述运载肽的C端结合。
14.如权利要求1所述的缀合物，其中该活性成分的功效标靶为癌细胞、免疫细胞或成纤维细胞。
15.如权利要求14所述的缀合物，
其中该癌细胞为选自由以下细胞组成的组中的至少一种癌细胞：肝癌细胞、乳癌细胞和白血病细胞，
其中该免疫细胞为选自由以下细胞组成的组中的至少一种免疫细胞：T淋巴细胞、B细胞和单核细胞。
16.如权利要求1所述的缀合物，
其中该活性成分为对于定位至细胞质内所必需的物质，且该运载肽执行该活性成分至细胞质内的局部递送。
17.如权利要求16所述的缀合物，其中该活性成分为对于定位至线粒体内所必需的物质，且该运载肽执行该活性成分至线粒体内的局部递送。
18.如权利要求5所述的缀合物，其中该对比造影剂选自由以下物质组成的组：不透射线对比造影剂、顺磁对比造影剂、超顺磁对比造影剂和计算机断层摄影(computedtomography；CT)对比造影剂。
19.如权利要求5所述的缀合物，其中该对比造影剂基于铁。
20.如权利要求19所述的缀合物，其中该对比造影剂为二茂铁羧酸盐。
21.一种对比造影剂，该对比造影剂包含如权利要求1至20中任一项所述的缀合物。
22.如权利要求21所述的对比造影剂，其中该对比造影剂用于对比造影细胞。
23.如权利要求22所述的对比造影剂，其中该细胞为干细胞。
24.一种组合物，该组合物包含如权利要求1至20中任一项所述的缀合物作为活性成分。
25.如权利要求24所述的组合物，其中该活性成分用于治疗或预防疾病，且该组合物为药物组合物。
26.如权利要求24所述的组合物，其中该活性成分为功能性化妆品的活性成分，且该组合物为化妆品组合物。
27.如权利要求24所述的组合物，其中该活性成分为健康功能性食品的活性成分，且该组合物为健康食品组合物。
28.一种活性成分的细胞质靶向递送***，其中该活性成分的递送***包含如权利要求1至20所述的任一种缀合物，其中该运载肽为局部地移动至细胞质内且执行局部地递送活性成分至细胞质的作用的肽，其中具有与序列超过80％同源性的氨基酸序列的肽和片段为保持SEQ ID NO:1的肽的细胞穿透能力的肽。
29.一种活性成分的线粒体靶向递送***，其中该活性成分的递送***包含如权利要求1至20所述的任一种缀合物，
其中该运载肽为局部地移动至线粒体内且执行局部地递送活性成分至线粒体内的作用的肽，其中具有与序列超过80％同源性的氨基酸序列的肽和片段为保持SEQ ID NO:1的肽的细胞穿透能力的肽。
30.一种用于调节线粒体活性的组合物，其中该组合物包含如权利要求1至20所述的任一种缀合物，其中该运载肽为局部地移动至线粒体内且执行局部地递送活性成分至线粒体内的作用的肽，其中具有与序列超过80％同源性的氨基酸序列的肽和片段为保持SEQID NO:1的肽的细胞穿透能力的肽。
31.如权利要求30所述的组合物，其中该组合物为用于与线粒体有关的疾病或病症的治疗、预防、进展抑制或症状缓和的药物组合物，且其中该活性成分为用于与线粒体有关的疾病或病症的治疗、预防、进展抑制或症状缓和的成分。
32.一种递送活性成分至细胞内的方法，其中该方法包含对需要的受试对象施用任一种上述缀合物的步骤，其中该运载肽为执行活性成分至细胞内的递送的细胞穿透肽，且其中具有与序列超过80％同源性的氨基酸序列的肽和序列的片段为保持SEQ ID NO:1的肽的细胞穿透能力的肽。
33.如权利要求32所述的方法，其中该方法用于在细胞内部局部地递送活性成分至线粒体内。
34.一种细胞穿透肽，其中该肽由包含SEQ ID NO:1的至少17个氨基酸组成。
35.一种细胞穿透肽，其中该肽为SEQ ID的片段且由3至7个氨基酸组成。
36.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求34或权利要求35所述的肽。
37.一种载体，该载体包含如权利要求36所述的多核苷酸。
38.一种转化细胞，该转化细胞包含如权利要求37所述的载体。
蛋白质、核酸、肽或病毒等具有用作治疗物质的重大可能性。然而，蛋白质、核酸、肽或病毒等的使用是受限的，因为蛋白质、核酸、肽或病毒等由于分子水平大小的原因而无法穿透组织和细胞膜。尽管分子水平尺寸很小，但该分子由于分子的结构或特性的原因而无法穿透脂质双层。因此，试图通过使用电穿孔、热休克等在细胞内部运送蛋白质、核酸、肽或病毒；难以在既不破坏细胞膜又保持上述分子的活性状态的情况下转移那些蛋白质、核酸、肽或病毒。已进行的许多研究显示源自人类免疫缺乏病毒(Human Immuno-deficiencyVirus；HIV)的反式转录活化因子(Trans-Activating Transcriptional activator；TATactivator)蛋白质可用作细胞穿透肽，该细胞穿透肽可在细胞内部运送极大的活性物质。具体地，已进行了关于下列物质的研究，与在细胞内部产生毒性的TAT蛋白质不同，该物质可在不产生任何毒性的情况下在细胞内部运送诸如蛋白质、核酸、肽或病毒的极大分子。因此，本发明是因应本发明人发现源自端粒酶的肽具有作为细胞穿透肽的显著功效而无显著毒性而完成的。
以SEQ ID NO:1描述的肽与下表1相同。SEQ ID NO:2列举人类端粒酶蛋白质的全长的顺序。SEQ ID NO:1列举由16个氨基酸组成、源自端粒酶的肽。下文表1中的「名称」用于区别肽。在本发明的不同特定实施例中，SEQ ID NO:1中所述肽中的一个以上肽包括「合成肽」，端粒酶的选定区域的合成肽。在本说明书中，术语「pep」在本文指具有SEQ ID NO:1的肽或包含与上述序列具有超过80％同源性的氨基酸序列的肽或上述肽的片段。
[表1]
肽的生物学性质的实质转化通过选择下列功效方面的显著不同的置换而执行：(a)保持置换区域中的多肽主链结构的功效，诸如片状或三维螺旋结构，(b)保持靶区域中分子的电荷或疏水性的功效，或(c)保持侧链的整体的功效。自然残基根据一般侧链性质划分成如下组：
(1)疏水性：正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；
(2)中性亲水性：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；
(3)酸性：天冬氨酸、谷氨酸；
(4)碱性：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；
(5)影响链取向(chain orientation)的残基：甘氨酸、脯氨酸；和
(6)芳香性：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
非保守置换可通过将上述种类的成员更换为不同种类的成员而进行。与保持肽的适当三维结构无关的任何半胱氨酸残基可通常经置换为丝氨酸，因此增加分子的氧化稳定性且防止不适当交联。反之，稳定性的改善可通过给肽添加一个或更多个半胱氨酸键而实现。
肽的氨基酸变体的经改变类型为已改变抗体糖基化方式的那些氨基酸。术语「改变」在本文是指删除在肽中发现的至少一个糖残基和/或添加在肽内不存在的至少一个糖基化残基。
肽中的糖基化作用通常经N连接或O连接。术语「N-连接」在本文是指将糖残基附着至天冬酰胺残基的侧链。作为三肽序列，天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸的外的任何氨基酸)为用于将糖残基酶法附着至天冬酰胺的侧链的识别序列。因此，在多肽中存在该三肽序列中的一种的情况下，创建可能的糖基化作用位点。α「O-连接糖基化作用」意味着将糖N-乙酰半乳胺糖、半乳糖或木糖中的一种附着至羟基氨基酸。羟基氨基酸大部分通常为丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
对肽添加糖基化作用位点通过改变氨基酸序列为含有上述三肽序列(用于N连结的糖基化作用位点)而便利地执行。该改变可通过给第一抗体序列添加至少一个丝氨酸或苏氨酸残基或通过以那些残基(用于O连结的糖基化作用位点)置换而进行。
在本发明的一个实施方式中，提供包含肽的细胞穿透肽，其中该肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，该肽具有与上述序列超过80％同源性的氨基酸序列，或肽为上述肽的片段。在本发明的一个实施方式中，提供药物组合物，该药物组合物包含肽作为运送一个以上活性成分的药物递送***，其中该肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该肽具有与上述序列超过80％的同源性，或该肽为上述肽的片段。包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、上述肽的片段或与上述序列具有超过80％同源性的肽是安全的且具有作为细胞穿透肽的显著功效。因此，肽可与药物缀合以在细胞内部运送药物。
在本发明的一个实施方式中，提供肽与待运送的活性成分的缀合物，其中该肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该肽为上述肽的片段或该肽与上述肽具有超过80％的同源性。在本发明的一个实施方式中，活性成分可为选自以下物质中的至少一种：蛋白质、核酸、肽、脂质、醣脂质、矿物质、糖、对比造影物质、药物和化合物。在本发明的一个实施方式中，活性成分可为肽。在本发明的一个实施方式中，活性成分可为细胞因子、抗体、抗体片段、治疗性酶、可溶性受体或配体。
本文揭示的细胞穿透肽意指可自体外和/或体内运送货物(cargo)至细胞内部的肽。本文揭示的「货物」包含可通过与细胞穿透肽的缀合作用在细胞内部运送的所有物质，例如，想要增加细胞穿透功效的所有物质，具体而言，药物、化妆品或健康食品的活性成分，更具体而言，无法通过一般途径在细胞内部运送的物质，更具体而言，糖、纳米颗粒、生物制剂、病毒、对比造影物质或其它化合物，该其它化合物可例如具有蛋白质、核酸、肽、矿物质、葡萄糖，但不限于那些物质。本文揭示的「药物」为宽泛概念，包括待运送用于缓和、预防、治疗或诊断疾病、创伤或特定症状的物质。
本文揭示的「运载肽」为可通过与活性成分的缀合作用运送活性成分至靶位点的肽。
在本发明的一个实施方式中，作为货物的蛋白质或肽包含以下的一或更多者：激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号转移蛋白质(或肽)、抗体和疫苗，但不限于那些物质。在本发明的一个实施方式中，核酸为以下分子：可为自发或人工的、单链或双链的DNA分子或RNA分子。核酸分子可为相同类型(例如，具有相同的核苷酸序列)的一或更多个核酸或不同类型的核酸。核酸分子包含以下的一或更多者：DNA、互补DNA(cDNA)、诱饵DNA(decoy DNA)、RNA、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小发夹式RNA(shRNA)、小时序RNA(stRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小胞核RNA(snRNA)、戊糖核酸(pentose nucleic acid；PNA)、反义寡聚物、质粒和其它修饰核酸，但不限于那些物质。在本发明的一个实施方式中，病毒包含全病毒或包括病毒的核酸的病毒核心。在本发明的一个实施方式中，化学物质为包含天然或合成物质的宽泛指示，该天然或合成物质可充当药物。
其中特定DNA表达在DNA表达的过程中通过双链RNA(double stranded RNA；dsRNA)控制的现象被称为RNA干扰；RNAi。因为该现象于1998年在C线虫中首先发现，据发现，该现象在植物、果蝇和哺乳动物中是常见的(Fire等人，《自然》，391:806-811，1998年；Novina&Sharp，《自然》，430:161-164，2004年)。
RNA干扰通过具有19-25bps的dsRNA调控，该dsRNA进入细胞、接着与RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex；RISC)结合。dsRNA至互补信使RNA(messengerRNA；mRNA)序列的反义链的结合通过在RISC复合体内发现的核酸内切酶触发目标信使RNA的降解(Rana,T.M.，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，8:23-36，2007年；Tomari,Y.和Zamore,P.D.，Genes Dev.，19:517-529，2005年)。换言之，小干扰RNA通过抑制特定蛋白质的产生且因此干扰DNA表达而包括在RNA干扰中。由19至23个核苷酸组成的小干扰RNA根据信使RNA对于形成双链RNA的特定mRNA的互补顺序形成碱基对。随后，在信使RNA自细胞移除的同时特别分解双链RNA。小干扰RNA已作为用于基因治疗的物质而受到关注，因为小干扰RNA在近代动物研究中显示了对抑制特定DNA的表达的显著的效应。在过去20年里已研究了具有DNA的较高活化和精确选择的小干扰RNA，且期望替换目前正用作治疗物的反义寡核苷酸。因此，许多药物公司现在正开发基于小干扰RNA的治疗物。与现有反义寡核苷酸相比，小干扰RNA系熟知为以少10倍的数量抑制基因表达且仅以基因的显著选择性抑制目标基因。小干扰RNA技术，特别对于治疗目的，具有显著益处，因为小干扰RNA技术与其它药物相比可容易设计且具有诸如高目标选择性和抑制特定基因表达的特性。同样，因为通过RNA干扰抑制基因表达利用体内天然存在的机制，故毒性很低。然而，小干扰RNA具有无法将该小干扰RNA轻易运送至细胞内的缺点，因为小干扰RNA由于小干扰RNA是阴离子而无法穿透细胞膜且由于体内低稳定性的原因容易在短时间周期内被分解。小干扰RNA的此缺点可通过与本文揭示的运载肽缀合来解决。
在本发明的一个实施方式中，活性成分(货物)的功效为癌细胞、免疫细胞或成纤维细胞。具体而言，上述癌细胞包含选自由以下细胞组成的组的任一种癌细胞：肝癌细胞、乳癌细胞和白血病细胞；上述免疫细胞包含选自由以下细胞组成的组的任一种免疫细胞：T淋巴细胞、B细胞和单核细胞。
在本发明的一个实施方式中，上述活性成分将在细胞质中定位，且运载肽将上述活性成分局部地运送至细胞质。
在本发明的一个实施方式中，上述活性成分将在线粒体中定位，且运载肽将上述活性成分局部地运送至线粒体。
在本发明的一个实施方式中，通过细胞穿透肽在细胞内部运送的药物可包含一个或更多个药物运送载体，诸如脂质粒、胶束、纳米颗粒、磁性颗粒或量子点。
本文揭示的术语「对比造影物质」为宽泛指示，该宽泛指示包含用来在医学影像中对比躯体内的结构或流体的所有物质。适当对比造影物质包含不透射线对比造影剂、顺磁对比造影剂、超顺磁对比造影剂、计算机断层扫描(computed tomography；CT)和其它对比造影物质，但不限于那些物质。举例而言，不透射线对比造影剂(用于X射线影像)将包含无机碘化合物和有机碘化合物(例如，泛影酸盐(diatrizoate))、不透射线金属和该不透射线金属的盐(例如，银、金、铂等)和其它不透射线化合物(例如，钙盐、诸如硫酸钡的钡盐、钽和氧化钽)。适当的顺磁对比造影物质(用于MR影像)包含钆二乙三胺五乙酸(gadoliniumdiethylene triaminepentaacetic acid；Gd-DTPA)和Gd-DTPA的衍生物、其它钆、锰、铁、镝、铜、铕、铒、铬、镍和钴复合体，例如，1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecan-N,N’,N”,N”’-tetraacetic acid；DOTA)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,-N’,N”-三乙酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecan-N,-N’,N”-triacetic acid；DO3A)、1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N’,N”-三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-N,N’,N”-TRIACETIC ACID；NOTA)、1,4,8,10-四氮杂环十四烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(1,4,8,10-tetraazacyclotetradecane-N,N’,N”,N”’-tetraacetic acid；TETA)、羟基苄基乙二胺二乙酸(hydroxybenzylethylene-diamine diacetic acid；HBED)。适当的超顺磁对比造影物质(用于MR影像)包含磁铁矿、超顺磁氧化铁(super-paramagnetic iron oxide；SPIO)、超小超顺磁氧化铁(ultrasmallsuperparamagnetic iron oxide；USPIO)和单晶氧化铁。其它适当的对比造影物质为碘化、非碘化、离子和非离子的CT对比造影剂、类似旋转标记或诊断上有效制剂的对比造影物质。
对比造影物质的其它实例包含β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白、荧光素酶(但不限于那些物质)和编码在表示于细胞内时可容易检测到的蛋白质的标识基因。可使用各种标记，诸如放射性同位素、flour、酶、酶基质、酶辅因子、酶抑制剂、配体(尤其是半抗原(heptan))。
在本发明的一实例中，对比造影物质为下文化学式2的二茂铁羧酸。二茂铁的结构系表示在化学式1中。
[化学式1]
[化学式2]
在本发明的一实例中，细胞穿透肽与对比造影物质的缀合物为下文化学式3中表示的二茂铁羧基-pep1。
[化学式3]
在本发明的一个实施方式中，肽或组合物可与一个或更多个可检测标记融合。标记可为可在化学反应、物理反应或酶反应中检测到的化合物或在反应中直接或间接地产生信号的化合物。标记和检测随后可根据此技术领域所熟知的方法来执行(例如，Sambrook,J.和Russel,D.W.(2001)；和Lottspeich,F.和Zorbas H.(1998)Bioanalytik，SpektrumAkademischer Verlag，海德堡/柏林，德国)。标记包含荧光标记、酶标记、显色标记、发光标记、辐射标记、半抗原、生物素、金属复合体、金属和胶体金，但不限于那些标记。该标记的所有形式在此工作领域是众所周知的，该标记的所有形式可自各供货商购得。
在本发明的一个实施方式中，货物可与肽直接结合。在本发明的另一个实施方式中，货物可通过诸如共价键或非共价键的各种类型的键与肽结合。例如，在本发明的一个实施方式中，货物可与肽的N端或C端结合。举例而言，货物可通过二硫键或共价键键结至肽。共价键为可将货物键结至N端谷氨酸的α-胺或C端赖氨酸残基的胺的键。同样，肽和货物可通过非共价键结合，此可使肽或货物可将彼此封装为胶囊形式。
在本发明的另一个实施方式中，肽可通过连接子与货物结合。举例而言，肽可通过在将诸如联肼尼克酰胺(6-肼基吡啶-3-羧酸)连接子(Hynic(6-hydrazinopyridine-3-carboxylic acid)linker)的连接子引入N端谷氨酸的α-胺或C端赖氨酸残基的胺之后将货物结合至连接子而与货物结合。
在本发明的另一个实施方式中，当货物为DNA或RNA时，将SH基团(硫醇基)引入肽，且将马来酰亚胺基引入DNA或RNA，随后，肽的SH基团和DNA或RNA的马来酰亚胺基结合，因此产生在货物与肽之间的结合。
在本发明的另一个实施方式中，当货物为肽或蛋白质时，表达货物的DNA与表达运载肽的DNA结合，且通过表达该DNA结合，可将货物与肽结合为融合蛋白质的形式。通过融合蛋白质结合的特定实例如下：当制造引物用于产生融合蛋白质时，编码运载肽的核苷酸经附着在表达货物的核苷酸前面，且使用限制酶将所获得核苷酸嵌入诸如聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene Terephthalate；pET)载体的载体，且核苷酸系以转化到诸如BL-21(DE3)的细胞中来表达。此时，融合蛋白质将通过以类似异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside；IPTG)的表达诱导制剂处理该融合蛋白质而有效表达。随后，所表达的融合蛋白质系通过His标签净化来净化，且以PBS透析，且经添加至试剂盒以在2000rpm至4000rpm、5至20分钟的此类条件下通过离心分离作用而浓缩。
在本发明的一个实施方式中，运载肽与染色物质、荧光物质、特别是异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate；FITC)或绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein；GFP)结合。在本发明的一个实施方式中，FITC系与在运载肽的N端或C端的赖氨酸的胺基(NH3+)结合。在其中赖氨酸不存在于肽的端的肽情况中，肽可通过包括赖氨酸的连接子与FITC结合。
本文揭示的运载肽可以1:1的摩尔分数与货物结合，但该运载肽也可以不同于1:1的摩尔分数与货物结合，该运载肽为包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽，或具有与上述肽超过80％同源性的氨基酸序列的肽，或上述肽的片段。举例而言，CPP与货物的摩尔分数可大于2:1，具体而言，大于2:1、大于3:1、大于4:1、大于5:1、大于6:1、大于7:1、大于8:1、大于9:1或大于10:1。此意味着大量运载肽分子可与货物分子结合。大量运载肽分子可经串行或并行结合。「串行结合」意味着运载肽与货物分子将在端氨基酸处结合。「并行结合」意味着运载肽与货物分子将在不同于端氨基酸的位点结合。在另一方面，运载肽与货物的摩尔分数可大于1:2。此意味着运载肽分子可与大量货物分子结合。举例而言，运载肽与货物的摩尔分数可为1:2，具体而言，大于1:2、大于1:3、大于1:4、大于1:5、大于1:6、大于1:7、大于1:8、大于1:9或大于1:10。
可轻易发现与异硫氰酸荧光素结合的肽的移动途径。因此，在本发明的一个实施方式中的运载肽将用于细胞成像或检测在细胞内部的药物递送途径。
在本发明的一个实施方式中，提供肽作为运送一个以上活性成分的药物递送载体的用途，其中该肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或该肽为上述肽的片段，或该肽具有与上述肽超过80％同源性的氨基酸序列。用途可指治疗用途或非治疗用途。
在本发明的一个实施方式中，提供在将药物递送到受试对象的细胞内部的方法，该方法包含施用包含药物和肽的组合物的步骤；其中该肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或该肽为上述肽的片段，或该肽具有与上述肽超过80％同源性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，提供检测药物递送途径的方法，该方法包含对受试对象应用肽和对比造影物质的步骤；其中该肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或该肽为上述肽的片段，或该肽具有与上述肽超过80％同源性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，提供检测药物递送途径的方法，该方法包含对受试对象应用肽与对比造影物质的缀合物的步骤；其中该肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或该肽为上述肽的片段，或该肽具有与上述肽超过80％同源性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，提供用于将药物递送至受试对象的细胞内的试剂盒，该试剂盒含有组合物和说明书，其中该组合物包含本发明的肽与用于递送的药物的缀合物，其中该肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或该肽为上述肽的片段，或该肽具有与上述肽超过80％同源性的氨基酸序列，其中该说明书包括以下的至少一种：给药剂量、给药途径、给药频率和组合物的指示。
在本发明的一个实施方式中，提供包含活性成分和肽的化妆品或食品组合物；其中该肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该肽具有与上述序列超过80％同源性的氨基酸序列，或该肽为上述肽的片段。在本发明的另一个实施方式中，提供包含肽与活性成分的缀合物的化妆品或食品组合物；其中该肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该肽具有与上述序列超过80％同源性的氨基酸序列，或该肽为上述肽的片段。
在本发明的一个实施方式中，提供具有将活性成分运送到细胞内部的显著能力的药物、化妆品或食品组合物，该药物、化妆品或食品组合物包含肽与活性成分的缀合物；其中该肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该肽具有与上述序列超过80％同源性的氨基酸序列，或该肽为上述肽的片段。
线粒体，作为真核细胞的能量代谢中的中心胞器，为与人类疾病有关的首先熟知的细胞内胞器(Luft R、Ikkos D、Palmieri G、Ernster L、Afzelius B：A case of severehypermetabolism of non thyroid origin with a defect in the maintenance ofmitochondrial respiratory control:a correlated clinical,biochemical,andmorphological study(在保持线粒体呼吸控制中具有缺陷的非甲状腺成因的严重代谢亢进的情况：相关的临床研究、生物化学研究和形态学研究)，J Clin Invest 41：1776-804，1962年)。
因为线粒体在控制细胞的能量代谢和细胞凋亡中起重要作用，故该线粒体充当各种治疗药物的主要靶。同样，此胞器涉和控制细胞内部的钙浓度，线粒体呼吸链充当在能量产生中重要的电子运送***，且该线粒体呼吸链导致产生活性氧物种。因此，异常线粒体作用与成人疾病具有密切关系，该成人疾病诸如尿崩症、心肌症、***症、失明、肾/肝疾病和中风(Modica-Napolitano KS，Singh KK：四月mitochondri as targets for detectionand treatment of cancer.(作为检测和治疗癌症的靶的线粒体。)Expert Rev Mol Med11:1-19，2002年)。同样，正建议将线粒体遗传突变包括在老化、变性神经元疾病和癌症等的爆发中。
本文揭示的「线粒体相关疾病」包含亨汀顿氏疾病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、线粒体脑肌肉病变合并乳酸血症和类中风症候群(Mitochondrial Encephalomyopathy withLactic Acidemia and Stroke-like episodes；MELAS)；肌阵挛癫痫合并红色褴褛肌纤维症(Myoclonus,epilepsy,and myopathy with ragged red fibers；MERRF)；神经性肌肉松弛、失调症、色素性视网膜炎/母体遗传莱氏症状(Neurogenic muscular weakness,ataxia,retinitis pigmentosa/Maternally inherited leigh syndrome；NARP/MILS)；Leber氏视神经病变(Lebers hereditary optic neuropathy；LHON)；Kearns-Sayre症候群(Kearns-Sayre Syndrome；KSS)；皮尔森骨髓胰腺症(Pearson Marrow-PancreasSyndrome；PMPS)；慢性渐进性眼外肌麻痹(Chronic progressive externalopthalnoplegia；CPEO)；瑞氏症候群；阿尔珀斯氏症候群；多个线粒体DNA缺失症候群；线粒体DNA耗乏症候群；复合体Ⅰ缺陷；复合体Ⅱ(琥珀酸脱氢酶(succinatedehydrogenase；SDH))缺陷；复合体Ⅲ缺陷；细胞色素c氧化酶(COX，复合体Ⅳ)缺陷；复合体Ⅴ缺陷；腺嘌呤核苷酸转运体(Adenine nucleotide translocator；ANT)缺陷；丙酮酸脱氢酶(Pyruvatedehydrogenase；PDH)缺陷；具有乳酸血症的乙基丙二酸酸性尿；具有乳酸血症的3-甲基戊烯二酸酸性尿；体现为在传染期间的衰减的不应性癫痫；体现为在传染期间的衰减的阿斯伯格症候群；体现为在传染期间的衰减的自闭症；注意力不足过动症(Attention deficithyperactivity disorder；ADHD)；体现为在传染期间的衰减的脑性麻痹；体现为在传染期间的衰减的失读症；母系遗传血小板减少症；白血病；MNGIE(线粒体肌病变、周围和自主神经病变、胃肠功能异常和癫痫)；MARIAHS症候群(线粒体失调症、复发传染、失语症、低尿酸血症/髓磷脂减少症(hypomyelination)、癫痫发作和二羧酸酸性尿)；ND6肌张力不全症；体现为在传染期间的衰减的周期性呕吐症状；具有乳酸血症的3-羟基异丁酸酸性尿；具有乳酸血症的尿崩症；尿苷反应性神经症状(Uridine reactive neural syndrome；URNS)；家族双侧纹状体坏死(Familial bilateral striatum necrosis；FBSN)；与胺基糖苷有关的听力损失；松驰心肌病；脾淋巴瘤；钨症状；多个线粒体DNA缺失症状；和肾小管酸血症/尿崩症/失调症症状，但不限于那些疾病。
在本发明的另一个实施方式中，提供编码上述多肽的核酸分子。例如，核酸分子具有碱基序列GAA GCG CGC CCG GCG CTG CTG ACC AGC CGC CTG CGC TTT ATT CCG AAA。核酸可根据熟习此项技术者所熟知的方法引入寄主细胞内。举例而言，熟知方法可为通过以下方法的转化方法：磷酸钙方法、脂质粒、电穿孔、接触病毒和细胞，或直接微注射至细胞内等。寄主细胞为较高等的真核细胞(例如，哺乳动物细胞)，或较低等的真核细胞(诸如酵母细胞)，或原核细胞(诸如细菌细胞)。适于转化的原核寄主细胞可为属于以下的物种：例如，大肠杆菌、枯草杆菌、沙门氏菌、假单胞菌、链霉菌和微细菌物种。
包括上述核酸分子的载体通常为重组表达载体，且该载体包含赋能寄主细胞转化的复制起点和可选择标记物(例如，用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶，或新霉素的容许度、四环素或氨苄西林在大肠杆菌中的容许度，酵母菌TRP1基因)，和用于控制蛋白质涂布序列的转录的启动子。例如，可用表达载体为：熟知细菌质粒，诸如SV40、pcDNA的衍生物；和熟知细菌质粒，诸如colE1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(Smith等人，Gene 67:31-40(1988))；质粒，诸如pMB9和pMB9的衍生物RP4；与噬菌体I的大量衍生物相同的噬菌体DNA，诸如NM989；诸如M13和丝状单股噬菌体DNA的噬菌体DNA；酵母质粒，例如，噬菌体DNA或自使用表达抑制序列的修饰质粒与噬菌体DNA的组合诱导的载体。哺乳动物表达载体包含复制起点、适当启动子和增强子。同样，该载体可包含强制核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体部分、转录终止序列和5’侧接(planking)非转录序列。哺乳动物表达载体可包含可诱导启动子，例如，含有二氢叶酸还原酶启动子的载体，含有DHFR表达盒或DHFR/甲氨喋呤共扩增载体的任何表达载体，诸如pED(Randal J，kaufman，1991，RandalJ.Kaufman，Current Protocols in Molycular Biology，16，12(1991))。或者，可使用以下载体：谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺酰亚胺共扩增载体，例如，pEE14(Celltech公司)、人类疱疹病毒第四型(Epstein-Barr-Virus；EBV)；或受核抗原(EBNA)控制引导附加型表达的载体，例如，pREP4(Invitrogen公司)、pCEP4(Invitrogen公司)、pMEP4(Invitrogen公司)、pREP8(Invitrogen公司)、pREP9(Invitrogen公司)和pEBVHis(Invitrogen公司)。可选择哺乳动物表达载体为Rc/CMV(Invitrogen公司)和pRc/RSV(Invitrogen公司)等。可用于本发明的牛痘病毒哺乳动物表达载体为pSC11、pMJ601、pTKgptF1S等。
将用于本发明的酵母表达载体***为非融合pYES2载体(Invitrogen公司)、融合pYESHisA、B、C(Invitrogen公司)、pRS载体等。
上述载体可经引入各种细胞，诸如哺乳动物细胞(特别是源自人类的细胞)或细菌、酵母、真菌、昆虫、线虫和植物细胞。适当细胞的实例为：VERO细胞；HELA细胞，例如ATCCNo.CCL2；CHO细胞系，例如ATCC No.CCL61；COS细胞，例如COS-7细胞和ATCC No.CRL 1650细胞；W138、BHK、HepG2、3T3，例如，ATCC No.CRL6361；A549、PC12、K562细胞；293细胞；Sf9细胞，例如ATCC No.CRL1711；和Cv1细胞，诸如ATCC No.CCL70等。
将用于本发明的其它适当细胞为原核寄主细胞菌株，例如，属于大肠杆菌(例如，DH5-α菌株)、枯草杆菌、沙门氏菌、假单胞菌、链霉菌和葡萄球菌的菌株。
在本发明的一个实施方式中，组合物可含有0.1μg/mg至1mg/mg、具体而言1μg/mg至0.5mg/mg、更具体而言10μg/mg至0.1mg/mg的以下肽：包含至少一个SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、包含与上述序列超过80％同源性的氨基酸序列的肽或上述肽的片段。当所包含的肽在上述范围内时，组合物的所有安全性和稳定性可经满足且在成本有效性方面为适当的。
在本发明的一个实施方式中，组合物可应用于所有动物，包括人类、狗、鸡、猪、母牛、羊、天竺鼠和猴。
在本发明的一个实施方式中，药物组合物可在骨髓、硬膜外或皮下手段中通过以下方式给药：口服、直肠给药、经皮给药、静脉给药、肌肉给药、腹膜内给药。
口服给药的形式可为但不限于片剂、药丸、软胶囊或硬胶囊、颗粒、粉末、溶液或乳液。非口服给药的形式可为但不限于注射剂、滴剂、洗剂、软膏、凝胶、乳霜、悬浮液、水乳液、栓剂、贴剂或喷剂。
在本发明的一个实施方式中，若有必要，药物组合物可含有添加剂，诸如稀释剂、赋形剂、润滑剂、黏合剂、崩解剂、缓冲剂、分散剂、表面活化剂、着色剂、芳香剂或甜味剂。在本发明的一个实施方式中，药物组合物可通过此技术领域中的习知工业方法制造。
在本发明的一个实施方式中，医学组合物的活性成分可根据以下方面变化：病人的年龄、性别、体重、病理和状态、给药途径或开药者的判断。基于该因子的剂量系在熟***内决定，且每日剂量例如可为但不限于，0.1μg/kg/天至1g/kg/天，具体而言1μg/kg/天至10mg/kg/天，更具体而言10μg/kg/天至1mg/kg/天，更具体而言50μg/kg/天至100μg/kg/天。在本发明的一个实施方式中，药物组合物可每天一至三次给药，但不限于此。
在本发明的一个实施方式中，化妆品组合物可以适于局部应用的所有形式来提供。举例而言，该形式可经提供为溶液、通过油相在水中的分散获得的水乳液、通过水在油相中的分散获得的水乳液、悬浮液、固体、凝胶、粉末、糊剂、泡沫、或气溶胶。该形式可通过此技术领域中的习知工业方法制造。
在本发明的一个实施方式中，化妆品组合物可在不会损害主效应的水平内包括可合意地增加主效应的其它成分。在本发明的一个实施方式中，化妆品组合物可另外包括润肤膏、软化剂、表面活化剂、UV吸收剂、防腐剂、杀真菌剂、抗氧化剂、pH值调节剂、有机颜料或无机颜料、芳香剂、冷却剂或止汗剂。上述成分的配方比可在不会损害本发明的目的和效应的水平内通过熟习此项技术者决定，且基于化妆品组合物的总重量的配方比可为以重量计0.01％至5％，具体而言以重量计0.01％至3％。
在本发明的一个实施方式中，食品组合物不局限于形式，但例如可为颗粒、粉末、液体和固体形式。每一形式可以由熟习此项技术者适当选取的常用于工业中的成分(除活性成分外)组成，且可增加具有其它成分的效应。
对于上述活性成分的剂量的判定系在熟***内，且每日剂量例如可为1μg/kg/天至10mg/kg/天，更具体而言10μg/kg/天至1mg/kg/天，更具体而言50μg/kg/天至100μg/kg/天，但不限于该数量且可根据年龄、健康状态、并发病和其它各种因子而变化。
本文使用的术语意欲用来描述实施例，而非用来限制本发明。前文数不胜数的术语不欲限制量而是表示可存在一个以上的所使用术语的事物。术语「包括」、「具有」、「组成」和「包含」应为开放解释(亦即，「包括但不限于」)。
使用数量的范围的提及代替说明范围内的分开数量，因此除非明确说明，否则每一数量可读作本文整合的分开数量。所有范围的端值系包括在范围内且可经独立组合。
除非另作说明或明显同上下文相矛盾，否则本文提及的所有方法可按适当顺序执行。除非包括在申请专利范围内，否则任一个实施方式和所有实施例或示例性语言(例如，使用「类似......」的语言)的使用系用来更清楚描述本发明，而不是限制本发明的范畴。在申请专利范围外的本文任何语言将不会解释为本发明的必需品。除非另外界定，否则本文使用的技术术语和科学术语具有本发明所归属的熟习此项技术者通常理解的意义。
本发明的优选实施例系为执行本发明的发明者所熟知的最佳模式。对熟习此项技术者而言，先于优选实施例中的变化而读取声明之后，可为清楚的。本发明者希望熟习此项技术者可充分使用该变化且以不同于本文所列举的其它方式进行本发明。因此，如由专利法所允许，本发明包括在随附申请专利范围中所说明的关键点的等效物和等效物的变化。另外，在上述组分的任何组合内的所有可能变化系包括在本发明中，除非另外明确说明或同上下文相矛盾。尽管本发明系通过示例性实施例描述和表示，但熟习此项技术者将很好理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可存在通过下文申请专利范围所界定的形式和细节上的各种变化。
实施例1：肽的合成
具有SEQ ID NO:1的肽系根据固相肽合成的现有方法来合成。详细地，肽通过使用ASP48S(Peptron公司，大田市，大韩民国)利用Fmoc固相肽合成(solid phase peptidesynthesis；SPPS)自C端偶联每一氨基酸而合成。那些肽经使用如下，那些肽在C端的第一氨基酸附着至树脂：
NH2-赖氨酸(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂
NH2-丙氨酸-2-氯-三苯甲基树脂
NH2-精氨酸(Pbf)-2-氯-三苯甲基树脂
合成肽的所有氨基酸材料在N端通过Fmoc保护，且氨基酸残基通过可溶于酸的Trt、Boc、t-Bu(t-丁酯)、Pbf(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)保护。诸如：Fmoc-丙氨酸-OH、Fmoc-精氨酸(Pbf)-OH、Fmoc-谷氨酸(OtBu)-OH、Fmoc-脯氨酸-OH、Fmoc-亮氨酸-OH、Fmoc-异亮氨酸-OH、Fmoc-苯丙氨酸-OH、Fmoc-丝氨酸(tBu)-OH、Fmoc-苏氨酸(tBu)-OH、Fmoc-赖氨酸(Boc)-OH、Fmoc-谷氨酰胺(Trt)-OH、Fmoc-色氨酸(Boc)-OH、Fmoc-蛋氨酸-OH、Fmoc-天冬酰胺(Trt)-OH、Fmoc-酪氨酸(tBu)-OH、Fmoc-氨基己酸-OH、Trt-巯乙酸。
HBTU[2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-六氟磷酸四甲铵]/HOBt[N-羟基苯并***]/NMM[4-甲基***啉]用作偶联试剂。使用含20％哌啶的二甲基甲酰胺(dimethylformamide；DMF)移除Fmoc。为自残基移除保护或使所合成肽与树脂分离，使用***混合物[三氟乙酸(trifluoroacetic acid；TFA)/三异丙基硅烷(triisopropylsilane；TIS)/乙二硫醇(ethanedithiol；EDT)/H2O＝92.5/2.5/2.5/2.5]。
肽通过使用固相分子框架通过以如下顺序过程添加每一氨基酸而合成：氨基酸保护、偶联反应、洗涤和去保护。在自树脂切断所合成肽之后，所合成肽通过高效液相层析法(High Performance Liquid Chromatography；HPLC)净化且通过质谱测定法(massspectrometry；MS)验证合成且随后冷冻干燥。
特定肽合成过程以SEQ ID NO:1的pep1的实施例描述如下。
1)偶联
将以NH2-赖氨酸(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂保护的氨基酸(8当量)熔融在偶联剂HBTU(8当量)/HOBt(8当量)/NMM(16当量)中，且在添加DMF之后，将反应混合物在室温下培育达2小时，随后以DMF、MeOH和DMF顺序洗涤。
2)Fmoc去保护
在DMF中添加20％哌啶之后，将反应混合物在室温下培育达5分钟2次，随后以DMF、MeOH和DMF顺序洗涤。
3)通过反复重复反应1和反应2构成肽的碱性框架。
4)***：添加***混合物至完全合成的肽且使肽与树脂分离。
5)将预冷却***添加至混合物内，且随后使反应混合物离心分离以沉淀出肽。
6)在通过Prep-HPLC净化之后，通过LC/MS检查分子重量且冷冻干燥以获得粉末形式的肽。
实施例2：CPP-FITC缀合物的细胞穿透性质
1.缀合物的合成
(1)FITC-CPP缀合物的合成
如下制造与FITC结合的具有SEQ ID NO:1的肽的缀合物，例如，具有SEQ ID NO:1的pep1与FITC的缀合物，换言之，FITC-连接子-pep1经制造如下。
根据实施例1中描述的制造方法获得的肽的碱性框架NH2-连接子-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂与FITC反应。具体而言，将荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)(8当量)与N,N-二异丙基乙胺(N,N-Diisopropylethylamine；DIPEA)(16当量)熔融在DMF中。添加DMF溶液且在室温下反应达2小时，随后以DMF、MeOH和DMF顺序洗涤。因此，获得FITC-连接子-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂。本文的连接子为6-胺基己酸(Ahx)。TFA/TIS/H2O＝95/2.5/2.5经添加至在树脂上组成的肽，且缀合物系与树脂分离。预冷却***经添加至所获得混合物，且使用离心分离作用来沉淀肽缀合物。在通过Prep-HPLC净化之后，纯度系以分析HPLC确定且分子重量系通过LC/MS决定。如上所述合成的肽系通过由LC/MS确定分子重量而验证为FITC-pep1。随后将缀合物冷冻干燥。
(2)CPP-FITC缀合物的合成
根据实施例21.(1)中描述的制造方法产生肽的碱性框架(NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Dde)-2-氯-三苯甲基树脂)。为选择性引入FITC至肽的C端，肽的N端经保护不受Boc影响。随后，将二碳酸二叔丁酯(30当量)与DIPEA(30当量)熔融在DMF中。添加DMF溶液至肽且在室温下培育达2小时，且肽以DMF、MeOH和DMF顺序洗涤。因此，获得Boc-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Dde)-2-氯-三苯甲基树脂。使用含2％肼的DMF来移除Dde以添加FITC至赖氨酸的C端，该Dde为C端残基赖氨酸的保护基。随后，将FITC(8当量)和DIPEA(16当量)熔融在DMF中，该DMF经添加至肽反应混合物，且混合物在室温下经培育达2小时，随后以DMF、MeOH、DMF顺序洗涤。因此，获得Boc-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(FITC)-2-氯-三苯甲基树脂。TFA/TIS/H2O＝95/2.5/2.5经添加以使肽与树脂分离。预冷却***经添加至混合物，且使用离心分离作用来沉淀肽。在通过Prep-HPLC净化之后，纯度是以分析HPLC确定且分子重量系以LC/MS确定。所获得物质通过LC/MS证实分子重量而验证为pep1-FITC。随后缀合物经冷冻干燥。
2.主要实验
(1)细胞培养
使用下列细胞和细胞系：CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、Huh7(人类肝细胞癌细胞系)、HepG2(人类肝细胞癌细胞系)、MCF7(人类乳腺癌细胞系)、COS7(猴肾成纤维细胞系)、Jurkat(人类T淋巴细胞系)、Raji(人类B细胞系)、THP1(人类单核细胞系)和K562(人类白血病细胞系)、bmDCs(源自骨髓的树突细胞)和源自人类滑液和滑液组织的初生细胞。
将Huh7、MCF7、Jukat、Raji、THP1、K562在RPMI 1640培养基中培养，CHO细胞在培养基中培养，且HepG2细胞在MEM培养基中培养。所有细胞的生长培养基以10％胎牛血清(Invitrogen公司，美国)、100ug/ml青霉素、100单元/ml链霉素增补，且细胞在37℃、5％CO2下培养。
bmDC在RPMI 1640培养基中经分化成为树突状细胞，该RPMI 1640培养基含有自小鼠骨髓获得的细胞、GM-CS(20ng/ml)和IL4(20ng/ml)。1×106个细胞经播种在24孔培养板上，培养基每2天替换一次，且在第7天获得的成熟树突状细胞用于实验。
周边血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cell；PBMC)和淋巴细胞使用Biocoll分离溶液(Biochrom AG，柏林，德国)由自健康受试对象收集的人类血液样本(50ml)制备。
HeLa细胞培养在最低必需培养基(Minimum Essential medium；MEM)中且在37℃下在5％CO2培育箱中培养，该MEM含有10％胎牛血清(Invitrogen公司，美国)、厄尔氏盐、非必需氨基酸、丙酮酸钠和100μg/ml青霉素和10单元/ml链霉素。
所有上述细胞系购自美国细胞培养收藏中心(American Type Cell Culture；ATCC)。
(2)pep1-FITC在体外的摄入分析
执行流式细胞仪分析和共聚焦显微镜分析以比较在以pep1(SEQ ID NO:1)处理与以HIV的先前已知的PTD、TAT(YGRKKRRQRRR)(SEQ ID NO:10)处理的不同细胞系中的细胞摄入程度。
流式细胞仪分析
将细胞在37℃下在5％CO2培育箱中培养且生长至90～100％融合。培养基经移除且以PBS洗涤，1mL OPTI-MEM经添加至每一孔且在37℃下在5％CO2培育箱中培养达一小时用于细胞饥饿。在以OPTI-MEM洗涤一次之后，细胞系在OPTI-MEM(100μl的浓度)和FITC(10μM的浓度)中以肽处理、在37℃下在5％CO2培育箱中培养。在移除培养基之后，细胞系以1倍PBS洗涤三次且使用胰蛋白/EDTA收集。比较FITC和FITC缀合的肽的剩余部分的细胞摄入且以未处理过的细胞系作为对照物来分析。
因此，经确定pep1具有比TAT更好的细胞穿透能力，该pep1被称为细胞穿透肽。特别地，当FITC系与C端的赖氨酸残基缀合时，细胞穿透能力最佳。
共聚焦显微镜分析
细胞经播种在2腔室孔式培养玻片(NUNC，Lab-Tek)上，在含有10％胎牛血清(Invitrogen公司，美国)、100ug/ml青霉素、100单元/ml链霉素的培养基中生长至达到50％融合，且在37℃下在5％CO2培育箱中培养达12小时。
在移除培养基之后，将细胞以PBS洗涤且在1ml OPTI-MEM中饥饿达一小时。与FITC(5μM)结合的50μl肽经添加在每一腔室内，且在37℃下在5％CO2培育箱中培养达2小时。在移除培养基之后，细胞以PBS洗涤三次且在室温下在0.5mL 4％多聚甲醛中经固定达20分钟。4％PFA以PBS快速洗涤两次。细胞的细胞核在室温(room temperature；RT)下以500nMTO--3碘化物642/661nm(Invitrogen公司)着色达10分钟。随后，细胞以1倍PBS洗涤三次，移除塑料腔室，在没有任何气泡的情况下将编号1.5厚度的盖玻片在滴入VECTASHIELDFX封固剂(载体实验室)之后置放在玻片上。样本通过涂覆透明指甲油至盖玻片的边缘而构成。样本在以荧光显微镜观察之前系在黑暗中在4℃下储存，且通过共聚焦激光扫描***分析样本。在分析中使用FV1000大型扫描共聚焦显微镜(Olympus)。
(i)酵素免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)
细胞以pep1处理、以1倍PBS洗涤两次且以裂解缓冲剂再悬浮，该裂解缓冲剂含有50mm Tris pH7.5、10mM EDTA pH8.0、1mM PMSF、2mM NaF、2mM Na3VO4、0.1％NP 40、100g/μl抑肽酶。悬浮细胞随后使用音波器(超音波处理器，Misonix，纽约，美国)进行声处理两次达15秒，且上清液(细胞溶解产物)通过在4℃下以13000rmp离心分离达10分钟而获得。蛋白质浓度使用Bradford蛋白质测定(Bio-Rad，美国)决定且执行荧光ELISA。
3.次要实验
(1)在HeLa细胞系中的细胞穿透性质
执行流式细胞仪分析和共聚焦显微镜分析以比较HIV的先前已知的蛋白质转导域、TAT(YGRKKRQRRR)的细胞摄入的程度；其中细胞以由实施例2.1制备的pep1与FITC的缀合物处理。
将细胞系在6孔培养板中***且在含有10％胎牛血清(Invitrogen公司，美国)、100μg/ml青霉素、100单元/ml链霉素的培养基中在37℃下在5％CO2培育箱中培养达12小时。在以PBS洗涤细胞系之后，在最低必需培养基中诱导饥饿达一小时。20uM的每一运载肽经处理且在37℃下培养达一小时。在重复三次以PBS洗涤细胞的步骤之后，将胰蛋白-EDTA在37℃下处理达10分钟以分离在细胞外部的运载肽。细胞以致冷的PBS收集且执行离心分离作用以重复洗涤细胞的步骤达三次。随后，细胞经悬浮在含有4％多聚甲醛的0.5ml PBS中且细胞的荧光使用FACS Calibur(美国BD公司)分析。比较对照物和与FITC结合的各种肽的细胞摄入态样且通过平均荧光强度(Mean Fluorescence Intensity；MFI)分析。
培养的细胞系在腔室孔中***且在含有10％胎牛血清(Invitrogen公司，美国)、100μg/ml青霉素和100单元/ml链霉素的培养基中在37℃下在5％CO2培育箱中培养达12小时。在以PBS洗涤细胞之后，在最低必需培养基中诱导饥饿达一小时。10μM的每一肽经处理且在37℃下培养达一小时。在重复三次以PBS洗涤细胞的步骤之后，细胞通过2％(v/v)多聚甲醛在室温下固定达15分钟。细胞核在室温下以DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)染色，且比较细胞且通过共聚焦显微镜分析来分析细胞。结果与图7所图示的一样。
在另一方面，为分析细胞活性和毒性，上述培养的细胞系是在96孔培养板中***且在含有10％胎牛血清(Invitrogen公司，美国)、100μg/ml青霉素和100单元/ml链霉素的培养基中在37℃下在5％CO2培育箱中培养达12小时。在以PBS洗涤细胞之后，在最低必需培养基中诱导饥饿达一小时。20μM的每一运载肽经处理且在37℃下培养达24小时。细胞活性和毒性通过MTT测定方法分析。结果与图8所图示的一样。
(2)在Huh7细胞系中的细胞穿透性质的流式细胞仪分析
为研究PEP1的细胞穿透性质，在以PEP1处理过的Huh7细胞系中执行流式细胞仪分析。所使用的分析方法与上述(1)HeLa细胞系分析中所描述的一样。结果显示，PEP 1的细胞穿透性质低于TAT的细胞穿透性质但高于对照物的细胞穿透性质。(图9和图10)
(3)pep1在人类T淋巴球中的细胞穿透性质
为研究PEP1的细胞穿透性质，将肽在人类T淋巴球中处理，且荧光活化细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting；FACS)经执行作为流式细胞仪分析。所使用的分析方法系与上述(1)HeLa细胞系分析中所描述的一样。结果显示，pep1具有高于对照FITC的细胞穿透性质25倍且高于源自HIV的TAT的细胞穿透性质6倍的细胞穿透性质。(图11和图12)
(4)PEP1的细胞穿透性质取决于FITC合成位置的流式细胞仪分析和共聚焦显微镜分析
为研究PEP1在各种细胞系中的细胞穿透性质，使用在肽的N端与C端与FITC结合的PEP1的缀合物执行流式细胞仪分析和共聚焦显微镜分析。所使用的分析方法系与上述(1)HeLa细胞系分析中所描述的一样。所使用的细胞系为Huh7、HepG2、CHO、bmDC。结果显示：在C端与FITC结合的PEP1具有高于另一种大约3至10倍的细胞穿透性质。同样，当以荧光显微镜观察时，在C端与FITC结合的PEP1具有比在N端与FITC结合的PEP1更高的穿透至细胞质内的细胞穿透性质。(图14)
(5)在各种细胞系中PEP1和TAT的细胞穿透性质的共聚焦显微镜分析
执行共聚焦显微镜分析以依据在每一细胞系(MCF7、Huh7、HepG2)中的细胞内部的吸收显示在TAT肽与PEP1之间的差异。图15和图16为表示分析结果的图解。绿色(488nm)表示FITC；以TOPRO-3染色的红色部分表示细胞的细胞核。细胞核经指定为红色以显示细胞核和肽的共定位。在图解中，当显示定位时，定位经表示为与绿色和红色组合的橙色。结果表示，以TAT处理且表示为橙色的细胞核的部分为其中发生肽与细胞的细胞核的共定位的位置。与此形成对比，在以PEP1处理的细胞核中不存在表示为橙色的细胞的任何部分。
该结果意味着PEP 1和TAT系在不同位置处被吸收至细胞内。图17为PEP1和TAT吸收的数字化图解。
所有的共聚焦显微镜分析图解系通过FV1000大型扫描共聚焦显微镜(Olympus)产生。图解中提供意指共定位的皮尔森系数。在每一细胞系MCF7、Huh7HepG2中，指定感兴趣区(region of interest；ROI)以表示皮尔森系数的平均分散。在所有的细胞系中，P值低于0.0001。通过此验证，TAT定位在细胞核中，而停留在细胞质中的PEP1未定位至细胞核内。类似这样，PEP1在细胞质内定位的特性是区分PEP 1与包括TAT的现有细胞穿透肽的最重要事物。
实施例3：PEP1取决于不同环境条件的细胞穿透性质
(1)PEP 1在各种细胞系中取决于浓度和时间的细胞穿透性质的流式细胞仪分析
PEP1的细胞穿透性质通过取决于浓度和时间以各种细胞系处理PEP1来研究。特定分析方法遵循实施例2中描述的方法。结果显示，PEP 1的细胞穿透性质取决于浓度在诸如Huh7、bmDC(小鼠高尔基氏体来源树突状细胞系)、CHO、COS7的所有细胞系中具有增强的倾向，类似TAT。在HepG2细胞系的情况下，在50μM的浓度下，TAT的细胞穿透性质增加，而PEP1的细胞穿透性质降低。与其它细胞系不同，在MCF细胞系中，PEP 1的细胞穿透性质相比TAT的细胞穿透性质增加了4倍且该细胞穿透性质亦取决于浓度而增加(图18至图23)。当取决于时间观察肽的细胞穿透性质时，细胞穿透性质在Huh7细胞系、MCF7细胞系和HeLa细胞系中增加。特别地，在MCH7细胞系中，当处理5μM的肽时，细胞穿透性质在所有时间内增加了10倍。(图24至图26)
(2)PEP1在富集细胞系中取决于浓度、温度和时间的细胞穿透性质的流式细胞仪分析和共聚焦显微镜分析
Jurkat(人类T细胞系)、THP1(人类单核细胞系)、Raji(人类B细胞系)、K562细胞系(人类白血病细胞系)用作富集细胞系以取决于浓度、温度和时间处理肽和分析肽的细胞穿透性质。结果显示，在Jurkat和THP 1细胞系中，PEP 1的细胞穿透性质比TAT高1.5至2倍，而在Raji细胞系和K562细胞系中，TAT显示比PEP1更高的细胞穿透性质。取决于肽的浓度，细胞穿透性质在所有细胞系内显示增加的倾向。取决于时间，细胞穿透性质不断增加超出3倍，但在THP1细胞系中，肽的细胞穿透性质随着时间推移而降低。取决于温度，PEP1的细胞穿透性质在所有细胞系内不存在差异。该结果验证，PEP1在Jurkat细胞系和THP1细胞系中具有较高的细胞穿透性质。
(3)PEP1在人类PBMC中取决于浓度、温度和时间的细胞穿透性质的流式细胞仪分析
与人类血液分离的PBMC系用来取决于浓度、温度和时间处理肽且分析肽的细胞穿透性质。结果显示，在整体PBMC中，PEP1显示比TAT高1.4倍的细胞穿透性质且TAT和PEP 1两者的细胞穿透性质系取决于浓度和时间而增加。在淋巴球中，PEP1的细胞穿透性质经显示增加了1.8倍，在单核球中，PEP1的细胞穿透性质类似于TAT。取决于浓度，PEP1的细胞穿透性质在淋巴球和单核球两者中皆增加。取决于时间，PEP 1的细胞穿透性质在淋巴球和单核球两者中皆显示增加的倾向，但单核球的细胞穿透性质尤其在3小时内增加到类似TAT，但到5小时的时候，该细胞穿透性质与TAT相比增加超过20％。(图32至图34)
(4)在人类PBMC和Jurkat中通过化学处理的肽的流式细胞仪分析
利用与人类血液分离的PBMC，执行化学处理利用率分析以验证细胞穿透机制。化学处理的浓度基于2013年JBC 278(36),34141-34149中报告的资料来决定。在处理PEP1肽且执行流式细胞仪分析之前，OPTI-MEM以化学处理处理且以PBS洗涤一小时。
结果显示，在整体PBMC中，当MatCD(浆膜胆固醇萃取)以PEP1处理时，细胞穿透性质倾向于被抑制且其它化学处理显示类似趋势。与此形成对比，TAT的细胞穿透性质系在所有细胞系内增加。在Jurkat细胞系中，MatCD显示抑制细胞穿透性质的倾向。所有的化学处理显示抑制PEP1的倾向，但对TAT没有影响。此验证，PEP 1在PBMC和Jurkat中系通过浆膜改变位置。(图35至图36)
(5)使用各种抗体的PEP1的细胞穿透性质的分析
使用HSP70/90抗体分析HSP70/90在Pep1的细胞穿透性质中起重要作用的事实。将GAPDH、HSP70、HSP90和烯醇酶的抗体在与人类血液分离的PBMC、淋巴球和Jurkat中处理以执行流式细胞仪分析。GAPDH和烯醇酶的抗体系用作对照物。当在pep1与HSP70/90的间的结合和相互作用系受抗体抑制时，pep1的细胞穿透性质显著减少且此支持HSP70/90在PEP1的细胞穿透性质中起重要作用的事实。
为使用各种抗体比较且分析肽的细胞穿透性质，使用HSP70抗体、烯醇酶抗体、GAPDH抗体(santacruz)、HSP90抗体。在细胞通过肽培养的前一小时，将细胞以肝素(10μg/ml)、甲基β环糊精(5mM)、诺考达唑(20μM)、布雷菲德菌素A(10μM)、细胞松弛素F(5μM)或氯奎宁(100μM)处理。随后，细胞系以PBS洗涤，肽处理系如在实施例2中描述的相同方法通过流式细胞仪分析执行。抗-HSP70抗体、抗烯醇酶抗体和抗-GAPDH抗体系购买自Santacruz公司且抗-HSP90抗体系购买自Abcam公司。为分析穿透至细胞内的每一蛋白质的作用，细胞系以对应于利用相同方法的蛋白质的抗体处理。
如图37所示，当细胞以HSP79和HSP90特定的抗体处理时，GV1001-F至hPBMC内的吸收显著减少。在另一方面，据发现，当细胞以GAPDA或烯醇酶特定的抗体处理时，对于pep1-F的吸收没有影响。
同样，看起来当细胞以HSP70和HSP90特定的抗体处理时，TAT肽的细胞穿透性质不受影响，且此验证HSP70和HSP90在GV1001至细胞的细胞质内的穿透中起到特殊作用。当以THP-1、人类淋巴球和Jurkat细胞进行实验时，显示类似结果。
HSP90和HSP70的过度表达(DNA和蛋白质表达)已在各种癌症中报告。因此，pep1在癌细胞中可比在正常细胞中更有效地拖曳货物至细胞内，且因此可表明，pep1具有以其中HSP70或HSP9过度表达的特定癌细胞为目标的能力。
实施例4：二茂铁羧基-CPP缀合物的细胞穿透性质
1.二茂铁羧基-CPP缀合物的制造
将以NH2-赖氨酸(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂保护的氨基酸(8当量)和偶联剂HBTU(8当量)/HoBt(8当量)/NMM(16当量)熔融在DMF中用于偶联。添加DMF溶液且室温下反应达2小时，随后以彼顺序的DMF、MeOH、DMF洗涤。随后，含20％哌啶的DMF经添加用于Fmoc去保护且在室温下反应达5分钟2次，随后以彼顺序的DMF、MeOH、DMF洗涤。通过重复上述反应，构成肽的碱性框架(NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Dde)-2-氯-三苯甲基树脂)。添加含2％肼的DMF以移除Dde，该Dde为C端赖氨酸残基的保护基。随后，将二茂铁羧酸(Sigma Aldrich cat.#_46264，16当量)和偶联剂HBTU(16当量)/HoBt(16当量)/NMM(32当量)熔融在DMF中。添加DMF溶液且室温下反应达2小时，随后以彼顺序的DMF、MeOH和DMF洗涤。TFA/TIS/H2O＝95/2.5/2.5经添加至上述所合成肽树脂以使肽与树脂分离。冷却***经添加至所获得混合物，且使用离心分离作用来沉淀所聚集的肽。沉淀物系通过HPLC净化且以MS确定。随后，将肽冷冻干燥。
2.神经干细胞的穿透
皮层是自已怀孕13天的胚胎大鼠的头部移除(Sprague-Dawley，SD)(Orient bio，京畿道，韩国)且将细胞在不含Ca2+/Mg2+的PBS中在涂布有多-L-鸟氨酸/纤连蛋白的板中以2×104细胞/cm2***(GIBCO，格兰德岛，纽约，美国)。在通过每日以10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor；BFGF)处理N2培养基(DMEM/F12，4.4IM胰岛素，100mg/l转移，30nM***盐、0.6IM丁二胺、20nM孕酮、0.2mM抗坏血酸、2nM L-谷氨酰胺、8.6mM D(+)葡萄糖、20nM NaHCO3(Sigma，圣路易斯，密苏里州))4至6天之后，在37℃下在5％CO2环境中获得超过95％的神经干细胞。
上述获得的神经干细胞以1×105在腔室孔式培养板中***。板中的细胞以10μM的二茂铁羧基-pep1处理且在37℃下在5％CO2培育箱中培养。细胞以PBS洗涤两次且在室温下以4％多聚甲醛固定达20分钟。细胞的细胞核以DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)封固培养基(具有DAPI的封固培养基)(载体实验室，加利福利亚州，美国)染色。随后，细胞经比较且在430-500nm的蓝光波长、620-700nm的红光波长和红光波长与蓝光波长的组合下通过共聚焦激光扫描***分析细胞。
结果显示在图38和图39中。
图38为表示在以二茂铁羧基-pep1处理之后神经干细胞随着时间推移的状态的图解。
如图38所示，分析结果显示，10μM的二茂铁羧基-pep1穿透至细胞内达2小时且大量细胞随着时间推移穿透至细胞内。
图39为表示通过共聚焦激光扫描***截取的神经干细胞的穿透状态的图解；其中神经干细胞系以二茂铁羧基-pep1处理且细胞的细胞核系以DAPI染色。在图39中，在430-550nm的波长下表示为蓝色的部分为以DAPI染色的细胞核且在700nm的波长下表示为红色的部分为二茂铁羧基-pep1。如在红光与蓝光的组合波长的图解中所示，二茂铁羧基-pep1系簇生在细胞核周围，且此显示，二茂铁羧基-pep1穿透至细胞内且改变位置至细胞质内。
3.毒性评估
对于与二茂铁羧酸缀合的pep1本身的毒性评估，神经干细胞分别在96孔培养板和24孔培养板中以4×104和2.5×105***，且在37℃下在5％CO2培育箱中培养达至少12小时。不同浓度(0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM)的二茂铁羧基-pep1经处理且培养达24小时，随后使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase；LDH)活化测定进行细胞活性和毒性评估。结果系显示在图40中。
如图40所示，经验证，在每一浓度(0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM)下对神经干细胞的细胞活性和毒性没有影响。
4.体内实验
A.神经干细胞的制备
使自上述实验(2)获得的5×106的神经干细胞在100mm皿中***。10μM的二茂铁羧基-pep1经处理且在37℃下在5％CO2培育箱中培养达24小时且将细胞与TrypLE(GIBCO)板分离且以游离培养基洗涤。制备每一头10μl的3×105二茂铁羧基-pep1标记的神经干细胞。
B.以二茂铁羧基-cpp处理的神经干细胞的移植
本文揭示的所有动物实验系在接收韩国汉阳大学的IACUC认可之后进行。购买8周的SD大鼠且在一周的适应周期之后，在实验中使用290g±15g体重的大鼠。实验以4个不同组的动物进行，例如，具有二茂铁羧基-pep1的NSC组、不具有二茂铁羧基-pep1的NSC组、二茂铁羧基-pep1处理组和盐水处理组。当移植细胞、二茂铁羧基-pep1或盐水至每一组时，前述组使用立体定向手术在SD大鼠的脑部内移植。在移植之前，以***和隆朋(rompun)使大鼠麻醉，且头骨部分系通过在刮毛之后碾磨头皮来移除。二茂铁羧基-pep1或盐水系立体定向移植在AP＝+0.7、R＝+2、V+-5.5的坐标上。
C.MRI影像
使用MRI成像来在体内观察移植的NSC和二茂铁羧基-pep1。MRI成像在移植之后的3天执行且使用菲利普的最佳3T MRI。***和隆朋系用来麻醉大鼠且MRI成像使用多面梯度回波脉冲序列(TR＝596ms，TE＝16ms，截面厚度＝0.7mm，平面内分解：292×290μM(分解大小0.0593mm3)截取，且撷取数量＝1。
结果显示在图41至图44中。图41为表示移植具有二茂铁羧基-pep1的干细胞组的脑部的MRI影像，且图42为表示移植不具有二茂铁羧基-pep1的干细胞的脑部的MRI影像，图43为表示移植二茂铁羧基-pep1组的脑部的MRI影像且图44为表示移植盐水处理组的脑部的MRI影像。如图41至图44所示，与未以二茂铁羧基-pep1处理过的神经干细胞相比，以二茂铁羧基-pep1处理过的神经干细胞的检测为显著的。在另一方面，与其中移植盐水处理组的脑部的检测(图44)相比，移植二茂铁羧基-pep1组的脑部的检测(图43)系显著的。
实施例5：运送大分子(蛋白质、DNA和小干扰RNA)的PEP1的细胞穿透性质
1.CPP-GFP缀合物的细胞穿透性质
(1)CPP-GFP缀合物的制造
如下制造SEQ ID NO:1的肽与绿色荧光蛋白的缀合物。
首先，如通过图45所示，引物经产生以在pET28a(+)载体(Promega)中克隆绿色荧光蛋白(SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7)。引物经产生以具有在5’处的EcoRI限制位点，在3’处的HindIII限制位点，添加紧接于部分EcoRI限制位点的21bp的GFP前半部序列，添加紧接于部分Hindlll限制位点的终止密码子。对于GFP-CPP蛋白质的DNA的产生，5’经产生与GFP相同且GFP的前部经产生以具有编码CPP的序列。举例而言，在SEQ ID NO:1的肽的情况下，产生具有下列序列：GAA GCG CGC CCG GCG CTG ACC AGC CGC CTG CGC TTT ATT CCG AAA(SEQ ID NO:3)。用于比较的实施例，为产生TAT-GFP，下列序列：TAT GGT CGT AAA AAA CGTCAA CGT CGT CGT(SEQ ID NO:11)，经添加至GFP的前面。
EGFP使用如图45中图解所表示的载体作为样板通过PCR获得。当产生引物时，在EGFP-16p(GAA GCG CGC CCG GCG CTG CTG ACC AGC CGC CTG CGC TTT ATT CCG AAA)的情况中将16p附着至EGFP的前面。在EGFP-TAT的情况中，当产生引物TAT时，TAT经产生至EGFP的前面。
当在大肠杆菌中表达引物时，16P和TAT经修饰用于大肠杆菌密码子使用。
图46为表示pET-28a载体的模拟图解。图47为克隆的模拟图解。
正向引物通过在CPP编码序列之后添加21GFP序列而产生且反向引物通过添加GFP的C端序列的部分而产生，使用上述引物和pET-28a-GFP载体作为样板，且执行PCR。PCR系在95℃下执行30周期，每周期5分钟(变性)、在63℃下执行30秒(黏着)、在72℃下执行7分钟且使用10pmol的每一引物。GFP的片段、GFP-CPP DNA在上述PCR条件下扩展，且将片段在pET28a(+)载体和表达GFP的载体的EcoRI和HindIII部分上克隆且获得GFP-CPP。(图47)
蛋白质通过在细菌中转化上述载体来分离。具体而言，大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福利亚州，美国)以每一上述载体转化且在5ml LB/卡那霉素中生长且移动至100ml培养基且在该培养基中培养。卡那霉素系以1/1000的体积比添加。载体在37℃下旋转培养达2至3小时且生长直至测量吸收度在0.6-0.8范围内且处理10mM的IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)。载体经培养达额外的3至4小时且在5000rpm下离心作用达5分钟。(图48)
在本文1mM IPTG的处理原理如下。处理的条件为：在处理IPTG之前，BL-21转化体(100ml)系在37℃下以约0.6-0.8的O.D生长达2至3小时，且萃取蛋白质。在EGFP-TAT的情况下，在以IPTG处理之后，EGFP-TT在16℃下为o/n。净化蛋白质可使用His卷标净化方法自样本获得。(图49)
可视觉上确定所表达蛋白质的离心分离的结果，该结果显示表示为绿色的蛋白质的过度表达。过度表达的蛋白质根据制造者的说明使用蛋白质分离试剂盒(Prod，#_21277，Thermo Scientific，伊利诺伊州，美国)、His标签净化试剂盒分离。
在分离之后，蛋白质经透析净化和浓缩。具体而言，蛋白质使用无菌4℃PBS净化。首先，透析袋以PBS平衡，上述分离的蛋白质溶液以5ml注射器添加至袋，且在4℃下通过搅拌透析。为增加蛋白质的浓度且移除不必要物质，透析的蛋白质系通过在BIBASPIN 20(Prod，#_VS2092，Sartorius Stedin biotech，德国)中在4℃下以3000rpm的离心分离作用浓缩。
(2)细胞系培养
使5×105的细胞系使用自ATCC获得的HepG2细胞(人类肝细胞癌细胞)在6孔培养板中***，且在37℃下在5％CO2培育箱中在含有10％胎牛血清(Invitrogen公司，美国)、100μg/ml青霉素、100单元/ml链霉素的MEM培养基中培养达12小时。每一CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、HeLA(人类***细胞)、Huh7(人类肝细胞癌细胞)、MCF7(人类乳癌细胞)细胞系系在含有10％胎牛血清(Invitrogen公司，USA)、2mmol/ml L-谷氨酰胺、100μg/ml青霉素和100单元/ml链霉素的每一MEM RPMI 1640培养基中在37℃下在5％CO2培育箱中培养。
(3)荧光显微镜
在以PBS洗涤细胞系之后，在OPTI-MEM中诱导饥饿达一小时。1uM的GFP(SEQ IDNO:6，SEQ ID NO:7)、TAT(YGRKKRRQRRR)-GFP(在实施例5.1(1)中制造)、pep1-GFP(在实施例5.1(1)中制造)经处理且在37℃下在5％CO2培育箱中培养达18小时。在以PBS洗涤细胞系之后，在488nm下观察细胞，其中该细胞系在1ml的PBS中***。荧光显微镜分析显示TAT至细胞内的穿透和在细胞核中的定位和pep1在细胞质中的定位。结果确定，pep1在MCF细胞系中具有比TAT更高的细胞穿透性质且在细胞的穿透之后，pep1在细胞质中定位。(图50)
(4)流式细胞仪分析
在以PBS洗涤细胞系之后，在OPTI-MEM中诱导饥饿达一小时。1uM的GFP、TAT-GFP和16mer GFp经处理且在37℃下在5％CO2培育箱中培养达2小时。在重复三次以PBS洗涤的步骤之后，使细胞系悬浮在0.5ml 1X FACS缓冲剂中且该细胞系的荧光系以FACS Calibur(美国BD公司)分析。以未处理的细胞系作为对照物比较和分析GFP、TAT-GFP和pep1-GFP的细胞摄入态样。与pep1结合的GFP以各种细胞系处理且执行流式细胞仪分析。结果显示，在MCF7细胞系中，pep1的细胞摄入比TAT增加了超过2倍，但在其它细胞系中，pep1的细胞摄入不高于TAT。(图51)
2.DNA缀合物的细胞穿透性质
(1)DNA(聚赖氨酸-CPP)的制造
具有先前已知细胞穿透性质的肽(GGG，TAT)和源自端粒酶的肽hTERT系与15mer赖氨酸结合。聚赖氨酸中有丰富的阳离子且因此该阳离子与阴离子DNA良好结合。肽合成是由Peptron公司执行，所合成的肽以具有1mg/ml的浓度的蒸馏水稀释。图52表示用于实验的肽的主要结构。
图53为用于实验的肽的模拟图解。
(2)细胞系培养
将每一CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、HeLA(人类***细胞)、Huh7(人类肝细胞癌细胞)、MCF7(人类乳癌细胞)细胞系分别在含有10％胎牛血清(Invitrogen公司，美国)、2mmol/ml L-谷氨酰胺、100μg/ml青霉素和100单元/ml链霉素的DMEM、MEM和RPMI 1640培养基中在37℃下在5％CO2培育箱中培养。
(3)凝胶电泳
为研究DNA-肽复合体的结合程度，0.05-5ug的肽与0.5ug的Generuler 1kb DNAladder(Fermentas)经混合且在室温下备用达10分钟。DNA-肽复合体经注入含有0.5mg/ml溴化乙锭(EtBr)的1％琼脂糖凝胶内且在1倍TAE缓冲剂中在100v下反应达30分钟。
肽-DNA复合体的电泳的结果显示，所有肽与DNA结合良好(图54)。当肽与DNA经良好结合时，在中和DNA时发生DNA的固定。根据此实验的结果，当(w/w)超过1时观察到固定。
(4)使用pep1肽的荧光素酶的运送能力的分析。
5×104至1×105的上述指定细胞系在12孔培养板的每一孔中培养且以PBS洗涤且以OPTI-MEM置放培养基。piRES2-EGFP载体通过将荧光素酶DNA嵌入OPTI-MEM和pIRES2-EGFP载体而产生。2ug的pIRES2-EGFP荧光素酶载体与每一肽的1、2、4、8倍(w/w)混合且产生100ul/孔总体积的复合体。所产生的DNA-肽复合体经嵌入每一孔内且在37℃下在5％CO2中培养达4小时。在洗涤细胞之后，培养基以完全培养基替换且在37℃下在5％CO2中培养达额外的20小时。培养基在DNA-肽复合体注射之后24小时移除，且在以PBS洗涤细胞两次之后，50ul的裂解缓冲剂经注入每一孔内。对细胞溶解产物执行荧光素酶测定，细胞溶解产物系由在室温下细胞摇动达15分钟而获得。发光通过添加100ul的荧光素酶基质至20ul的细胞溶解产物而测量。结果记录通过BSA测定标准化的平均值。
荧光素酶分析的结果验证，hTERT-pk在所有浓度下显示比对照组(TAT-pK，GGG-pK)更高的荧光素酶表达。特别地，在与DNA相比8倍的浓度下，与TAT-pK和GGG-pK相比，hTERT-pK显示显著水平的荧光素酶表达。(图55)
3.小干扰RNA-CPP的细胞穿透性质
(1)小干扰RNA-CPP缀合物的制造
肽的碱性框架，三苯基-巯基乙酰基-Ahx-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂根据实施例1中描述的制造方法而制造。Ahs在本文意指6-氨基己酸。所制造的三苯基-巯基乙酰基-Ahx-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂的合成系通过HPLC和质量分析验证。
SiLuc-pep1缀合物通过小干扰RNA序列与上述所合成pep1的缀合作用而制造。具体而言，用于与pep1缀合的小干扰RNA序列系如下。
SiLuc正义(5’->3’):CUUACGCUGAGUACUUCGA(dTdT)(SEQ ID NO:4)
SiLuc反义(5’->3’):UCGAAGUACUCAGCGUAA(dTdT)(SEQ ID NO:5)
制造方法为，将通过韩国Bionia公司供应的马来酰亚胺修饰的SiLuc(75umol)熔融在PBS缓冲剂(1x1ml)中且通过在室温下反应达2小时来缀合。缀合通过使肽的硫醇基与小干扰RNA的马来酰亚胺反应而执行。缀合反应使用Ellman’s试剂和5,5'-二硫双-(2-硝苯甲酸或DTNB)来验证。Ellman’s试剂为用来量化样本中的硫醇基的浓度或数量的化学制品。
用于实验中的小干扰RNA序列系用于荧光素酶DNA目的和在我们请求肽合成的情况下由Peptron公司提供的以下小干扰RNA：siLuc-扰乱的pep1[siLuc与巯基乙酰基-Ahx-LRALPKRPFISRLTEA缀合]、siLuc-Tat(47-57)[siLuc与巯基乙酰基-Ahx-YGRKKRRQRRR缀合]、siLuc-细胞穿透肽[siLuc与巯基乙酰基-Ahx-RQIKIWFQNRRMKWKK缀合]、siLuc-pep1[siLuc与巯基乙酰基-Ahx-EARPALLTSRLRFIPK缀合]。Si0Cont-扰乱的pep1、siCont-Tat(47-57)、siCont-细胞穿透肽、siCont-pep1系用作对照物。商业上由BIonia公司出售的荧光素酶小干扰RNA和阴性小干扰RNA(Cat#_:SN-1012，AccuTarget阴性对照小干扰RNA)系分别用作阳性对照物和阴性对照物。
小干扰RNA的序列如下。
SiLuc正义(5’->3’):CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT(SEQ ID NO:4)
SiLuc反义(5’->3’):UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT(SEQ ID NO:5)
SiCont的序列如下。
SiCont正义(5’->3’):GCACCUAUAACAACGGUAGdTdT(SEQ ID NO:8)
SiCont反义(5’->3’):CUACCGUUGUUAUAGGUGCdTdT(SEQ ID NO:9)
(2)细胞系培养
将自ATCC获得的Huh7(人类肝细胞癌)细胞在含有10％胎牛血清(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加尼福利亚州，美国)、2mmol/ml L-谷氨酰胺、100μg/ml青霉素和100单元/ml链霉素的RPMI 1640培养基(Hyclon)中在37℃下在5％CO2培育箱中培养。
(3)荧光素酶测定
将2×105的Huh7细胞嵌入24孔培养板的每一孔内且生长。细胞上的短暂转染系使用2ug的荧光素酶目标DNA和lipofectamin 2000(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加尼福利亚州，美国)来执行。在4小时之后，lipofectamin 2000系以PBS完全洗涤若干次；400nm的最终浓度的小干扰RNA系在500ul的Opti-MEM(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加尼福利亚州，美国)中处理且在37℃培育箱中反应达16小时。为终止反应，细胞以PBS洗涤且使用Reporter Lysis Buffer(Progema公司，麦迪逊市，威斯康星州，美国)溶液溶解蛋白质，且发光使用荧光素酶试剂(Promega公司，麦迪逊市，威斯康星州，美国)通过光度计(TurnerBioSystem，桑尼维尔市，加尼福利亚州，美国)测量。小干扰RNA的功效通过Bradford蛋白质测定来更正。
为验证pep1的细胞穿透性质，产生用于荧光素酶目的的小干扰RNA且使用Huh7(人类肝细胞癌)细胞和CHO细胞系测量荧光素酶活化。结果验证：与细胞穿透肽和pep1在与Huh细胞系中的对照物结合的小干扰RNA中的情况比较，细胞穿透肽和pep1在与荧光素酶结合的小干扰RNA中的活化减少了近似28％、20％。与此形成对比，当经扰乱且TAT处于与荧光素酶和对照物结合的小干扰RNA中时，没有观察到活化的显著差异。同样，当比较细胞穿透肽和pep1的Tat和与荧光素酶结合的扰乱形式和小干扰RNA之间的荧光素酶活化时，分别观察到27％、55％、40％的活化抑制。(图57)
与其它小干扰RNA不同，与pep1缀合的小干扰RNA在CHO细胞中显示约30％的荧光素酶活性抑制。因此，pep 1的细胞穿透能力可通过使用小干扰RNA观察抑制荧光素酶活性而确定(图58)。
(4)小干扰RNA的运送能力的流式细胞仪分析
用于实验中的小干扰RNA序列以HBx DNA和与荧光素结合的siHBV、正义-5’GAGGAC UCU UGG ACU CUC A dTdT-3’(SEQ ID NO:3)、反义5’UGA GAG UCC AAG AGUC CCU CdTdT-3’)3’(SEQ ID NO:13)为目标。小干扰RNA合成系由韩国BIONEER公司执行且所合成的小干扰RNA系通过HPLC净化。
1×105的HepG2系在一天前培养在24孔培养板的每一孔中且培养基系以Opti-MEM替换。在细胞培养之后4小时，每一摩尔比的FITC标记的小干扰RNA(siHBV)与肽经添加且与300ul的Opti-MEM混合以产生复合体。小干扰RNA经嵌入以具有10uM的最终浓度且在37℃下在5％CO2中培养达一小时。胰蛋白经处理且在室温下备用达5分钟，且以PBS洗涤三次。500ul的FACS缓冲剂经注入每一孔内，且不同于细胞的荧光物质系通过在300rpm和4℃下重复离心分离作用三次来移除。FITC荧光的10000细胞的总体系通过流式细胞仪分析(BDFACSCalibur System；BD公司，法国)测量。通过流式细胞仪分析的细胞摄入分析的结果验证，在上述20摩尔比的浓度下，hTERT-pk显示比对照组(RGD-pK，GGG-pK)高了2.5倍的FITC标记的小干扰RNA细胞摄入(图56)。
实施例6：线粒体内CPP-FITC缀合物的局部运送能力
1.显微镜分析
(1)细胞系培养
使用自ATCC获得的MCH7(人类乳腺癌)附着型细胞系。细胞系在含有10％胎牛血清(Invitrogen公司，美国)、100μg/ml青霉素、100单元/ml链霉素的RPMI1640培养基(Sigma)中在37℃下在5％CO2培育箱中培养。
FITC结合至肽(SEQ ID NO:1)的C端的缀合物系如上述实施例2中所描述而制造。
(2)共聚焦显微镜分析
上述细胞系经***以占据2腔室孔式玻片(NUNC，Lab Tek)表面的50％，且将上述细胞系在37℃下在5％CO2培育箱中培养达12小时。随后，培养基经移除且以PBS洗涤一次且在1ml的OPTI-MEM(Sigma)中培养达一小时且诱导饥饿。FITC经结合至肽(SEQ ID NO:1)的C端的100uM缀合物经添加至每一腔室以变为50μl(10μM)且在37℃下在5％CO2培育箱中培养达2小时。
随后，培养基经移除且以PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)洗涤三次。在每一腔室，0.5mL的4％多聚甲醛(PFA)经添加且在室温下固定达20分钟。细胞以1xPBS洗涤且以4％PFA迅速洗涤两次。
上述细胞以500nM的TO-PRO-3碘化物642/661nm(Invitrogen公司)处理且在室温下染色细胞的细胞核达10分钟。在于室温下处理线粒体达15分钟之后，线粒体以250nM的mototracker深红FM 644/655nm(Invitrogen公司)染色。移除溶液，且细胞以1xPBS洗涤三次，且移除塑料腔室。在移除腔室之后，将VECTASHIELD封固剂(载体实验室)滴在玻片上，覆盖载玻片且在无光情况下执行共聚焦激光扫描***。FITC以TO-PROR-3碘化物(Invitrogen公司)在488nm波长下测量且mitotrackerR深红(Invitrogen公司)在633nm波长下测量。
结果显示在图59中。以结合在肽(SEQ ID NO:1)的C端的FITC与线粒体定位标记物(深红FM 644/655nm(invitrogen公司))染色的缀合物的结果是，(A)单独处理在MCF细胞中在肽(SEQ ID NO:1)的C端结合FITC的缀合物，(B)单独处理线粒体定位标记物(mototracker深红FM 644/665nm(Invitrogen公司))，(C)细胞相位对比造影，(D)A与B的影像的结合。利用该结果可验证，源自端粒酶的肽系在线粒体内定位。
2.抗体结合
根据实施例5.1(1)中所描述的方法制造的pep-GFP缀合物在自ATCC获得的2×107的MCF7(人类乳腺癌)附着型细胞系中处理且以线粒体hsp70抗体执行蛋白质印迹法。作为比较实施例，在仅GFP的处理、11mer-GFP的处理、ccg-GFP的处理之后，以hsp70抗体执行蛋白质印迹分析。具体而言，如下文所述方法执行蛋白质印迹分析。
制备2×107的MCF细胞系，且根据相应协议使用线粒体分离试剂盒(Themoscience，#89874)分离线粒体。具体而言，将800μl的试剂A添加至细胞聚合体(cellpellet)且在中等速率下涡旋振荡达5秒。随后，将细胞置放在冰中达2分钟且将细胞悬浮液移动至Dounce组织磨床且在冰上研磨悬浮液。随后，将裂解的细胞移动至原始试管。将800μl的试剂C添加至原始试管且以200μl的试剂A冲洗磨床。在缓慢混合之后，将700g的细胞离心作用达10分钟。将上清液移动至新试管，且在3000g下再次离心作用达15分钟。将上清液废弃且将500μl的试剂C添加至含有线粒体的聚合体且在12000g下离心作用达5分钟。将上清液废弃且将聚合体置放在冰中。通过添加2％CHAPS至TBS(25mM Tris，0.15M NaCl，pH7.2)产生的100ul缓冲液经涡旋振荡达一分钟。将缓冲液在12000g下离心作用达2分钟，可溶线粒体蛋白质系与如下文的测试蛋白质免疫沉淀反应。
测试蛋白质为如实施例5.1(1)中所述而制造的pep1-GFP缀合物，GFP、11mer-GFP、ccg-GFP系用作对照物。11mer-GFP为11mer蛋白质与GFP结合的缀合物，其中11mer蛋白质由源自HBV的11种氨基酸组成。ccg为乙型肝炎病毒的复制起点。
为附着每一上述测试蛋白质和对照蛋白质至树脂，制备6xHis标记的钴树脂(Prod.#89964，Thermo Scientific，UL，美国)。将50-100μl的树脂添加至管柱且以500μl的洗涤缓冲液洗涤五次。将每一表达蛋白质添加至管柱，通过在4℃下混合达30分钟至1小时而留置。随后，将500μl的表达蛋白质树脂聚合物以洗涤缓冲液洗涤五次。将上文制备的线粒体上清液添加在此且在4℃下搅拌放置过夜。在第二天，将树脂以相同方法洗涤，树脂通过添加200μl的溶析缓冲液来溶析。结果显示在图60中。结果验证，线粒体的hsp70抗体仅结合至pep1-GFP。

Claims (17)

1.一种肽在制造包含待运送货物与肽的缀合物的组合物中的应用，其中所述肽是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的细胞穿透运载肽，并且细胞穿透运载肽运送所述货物至细胞，
其中所述货物为生物产品或非生物化合物，
其中所述生物产品是选自蛋白质、核酸和肽中的至少一种，
其中所述非生物化合物为选自以下物质中的至少一种：对比造影剂、荧光物质和用于改善、预防或治疗疾病或病症的药物，并且
其中所述货物的功效标靶为癌细胞、免疫细胞、干细胞或成纤维细胞。
2.如权利要求1所述的应用，
其中所述货物为DNA或RNA，和
其中当所述货物为DNA时，所述运载肽通过聚赖氨酸与DNA缀合。
3.如权利要求1所述的应用，其中所述运载肽和所述货物通过共价键选择性地通过连接子介导来结合。
4.如权利要求1所述的应用，其中所述运载肽和所述货物通过非共价键结合。
5.如权利要求1所述的应用，其中所述货物为蛋白质或肽。
6.如权利要求5所述的应用，其中所述货物为细胞因子、抗体、抗体片段、治疗性酶、可溶性受体或配体。
7.如权利要求1所述的应用，其中所述运载肽与异硫氰酸荧光素结合。
8.如权利要求1所述的应用，其中所述运载肽与绿色荧光蛋白(GFP)结合。
9.如权利要求1所述的应用，其中所述货物与上述运载肽的C端结合。
10.如权利要求1所述的应用，
其中所述癌细胞为选自由以下细胞组成的组中的至少一种癌细胞：肝癌细胞、乳癌细胞和白血病细胞，
其中所述免疫细胞为选自由以下细胞组成的组中的至少一种免疫细胞：T淋巴细胞、B细胞和单核细胞。
11.如权利要求1所述的应用，其中所述对比造影剂选自由以下物质组成的组：不透射线对比造影剂、顺磁对比造影剂、超顺磁对比造影剂和CT对比造影剂。
12.如权利要求1所述的应用，其中所述对比造影剂包含铁。
13.如权利要求12所述的应用，其中所述对比造影剂为二茂铁羧酸盐。
14.权利要求1至13中任一项所述的应用，其中所述组合物是对比造影剂。
15.如权利要求14所述的应用，其中所述对比造影剂用于将细胞对比造影。
16.如权利要求15所述的应用，其中所述细胞为干细胞。
17.如权利要求1至13中任一项所述的应用，其中所述组合物为药物组合物。
CN201380044357.3A 2012-07-11 2013-07-11 细胞穿透肽以及包含该肽的缀合物和组合物 Active CN104822698B (zh)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20120075444 2012-07-11
KR10-2012-0075444 2012-07-11
KR10-2012-0104173 2012-09-19
KR20120104173 2012-09-19
KR20120109207 2012-09-28
KR10-2012-0109207 2012-09-28
KR10-2013-0017046 2013-02-18
KR20130017046 2013-02-18
KR10-2013-0043635 2013-04-19
KR20130043635 2013-04-19
PCT/KR2013/006218 WO2014010971A1 (ko) 2012-07-11 2013-07-11 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104822698A CN104822698A (zh) 2015-08-05
CN104822698B true CN104822698B (zh) 2018-08-10

Family

ID=49916328

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380044357.3A Active CN104822698B (zh) 2012-07-11 2013-07-11 细胞穿透肽以及包含该肽的缀合物和组合物

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10967000B2 (zh)
EP (1) EP2873678B1 (zh)
JP (1) JP6272853B2 (zh)
KR (1) KR101799904B1 (zh)
CN (1) CN104822698B (zh)
WO (1) WO2014010971A1 (zh)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9730984B2 (en) 2012-05-11 2017-08-15 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for preventing or treating rheumatoid arthritis
KR20210025132A (ko) 2012-05-11 2021-03-08 주식회사 젬백스앤카엘 항염증 활성을 갖는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
CN110028554B (zh) 2012-09-19 2023-04-07 珍白斯凯尔有限公司 细胞穿透性肽、包含该肽的缀合物、及包含该缀合物的组合物
CN113699133A (zh) * 2012-09-19 2021-11-26 珍白斯凯尔有限公司 细胞穿透肽、包含其的缀合物、及应用
ES2716870T3 (es) 2013-04-19 2019-06-17 Gemvax & Kael Co Ltd Composición para el tratamiento y prevención de lesión isquémica
CN104508485B (zh) 2013-06-07 2017-01-18 杰姆维克斯&凯尔有限公司 在癌症免疫疗法中有用的生物标记
KR20160039152A (ko) 2013-06-21 2016-04-08 주식회사 젬백스앤카엘 호르몬 분비 조절제, 이를 포함하는 조성물, 및 이를 사용한 호르몬 분비 조절 방법
RU2661596C2 (ru) 2013-10-23 2018-07-17 Джемвакс Энд Каэл Ко., Лтд. Композиция для лечения и профилактики доброкачественной гиперплазии простаты
ES2818921T3 (es) 2013-11-22 2021-04-14 Gemvax & Kael Co Ltd Péptido que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis y composición que contiene el mismo
KR102314231B1 (ko) 2013-12-17 2021-10-19 주식회사 젬백스앤카엘 전립선 암 치료용 조성물
EP3130345B9 (en) 2014-04-11 2022-05-04 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having fibrosis inhibitory activity and composition containing same
CN106659149B (zh) 2014-04-30 2020-05-19 珍白斯凯尔有限公司 用于器官、组织或细胞移植的组合物、试剂盒和移植方法
KR102413243B1 (ko) 2014-12-23 2022-06-27 주식회사 젬백스앤카엘 안질환 치료 펩티드 및 이를 포함하는 안질환 치료용 조성물
US10835582B2 (en) 2015-02-27 2020-11-17 Gemvax & Kael Co. Ltd. Peptide for preventing hearing loss, and composition comprising same
WO2016190660A1 (ko) 2015-05-26 2016-12-01 주식회사 젬백스앤카엘 신규 펩티드 및 이를 포함한 조성물
JP6923453B2 (ja) 2015-07-02 2021-08-18 ジェムバックス アンド カエル カンパニー，リミティド 抗ウイルス活性効能を有するペプチド及びこれを含む組成物
CN105018499A (zh) * 2015-08-25 2015-11-04 武汉大学 一种抗乙型肝炎病毒的肽核酸及其用途
JP6920324B2 (ja) * 2015-11-03 2021-08-18 ジェムバックス アンド カエル カンパニー，リミティド 神経細胞の損失予防及び再生の効能を有するペプチド及びこれを含む組成物
KR20230028596A (ko) 2016-04-07 2023-02-28 김상재 텔로머라제 활성 증가 및 텔로미어 연장 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
CA3020393A1 (en) * 2016-04-11 2017-10-19 Carnot, Llc Chiral peptides
CN106236695A (zh) * 2016-06-02 2016-12-21 哈尔滨源茂达生物技术有限公司 一种多肽祛痘修复精华液及其制备方法
WO2017211278A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Asclepiumm Taiwan Co., Ltd Antibody fusion proteins for drug delivery
KR101797167B1 (ko) * 2016-11-09 2017-11-13 주식회사 바이오셀트란 신규의 프로테인 트랜스덕션 도메인 및 이의 용도
CN107759698A (zh) * 2017-09-18 2018-03-06 广东工业大学 一种egfp‑cta2‑tat融合蛋白在制备荧光探针中的应用
CN117567639A (zh) 2017-10-27 2024-02-20 俄亥俄州国家创新基金会 用于细胞内递送装订肽的多肽缀合物
WO2019217682A1 (en) 2018-05-09 2019-11-14 Ohio State Innovation Foundation Cyclic cell-penetrating peptides with one or more hydrophobic residues
CN109553659B (zh) * 2018-11-26 2022-06-21 上海华新生物高技术有限公司 一种细胞穿透肽及透皮干扰素
WO2020130547A1 (ko) * 2018-12-19 2020-06-25 한국화학연구원 인간 엘알알씨24 단백질 유래 세포막 투과 도메인
KR102351041B1 (ko) * 2018-12-19 2022-01-13 한국화학연구원 인간 lrrc24 단백질 유래 세포막 투과 도메인
US20220088213A1 (en) * 2019-01-03 2022-03-24 Sung Chun Kim Drug delivery system using ph-dependent cell-penetrating peptides, and composite thereof with drug
KR102182985B1 (ko) * 2019-01-03 2020-11-26 주식회사 바이오이즈 pH 의존적 막 투과성 펩타이드를 이용한 약물 운반체 및 그것과 약물의 복합체
JP2022529784A (ja) * 2019-04-17 2022-06-24 アーディジェン， エルエルシー 分子を細胞内送達するためのペプチドおよびナノ粒子
WO2021127650A1 (en) * 2019-12-19 2021-06-24 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions for delivery of antisense compounds
US20230279143A1 (en) * 2020-08-13 2023-09-07 Nibec Co., Ltd. Protein comprising antibody for targeting oncogenic protein or single chain fragment variable thereof and cancer cell penetrating peptide, and use of the same
CN114731988B (zh) * 2022-05-23 2023-10-20 昆明市第一人民医院 一种hbv感染的树鼩模型构建方法及树鼩模型

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000002581A1 (en) * 1998-07-08 2000-01-20 Norsk Hydro Asa Antigenic peptides derived from telomerase
EP0990701A1 (en) * 1998-03-26 2000-04-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Monoclonal antibody against human telomerase catalytic subunit
US7078491B1 (en) * 2000-09-21 2006-07-18 Amgen Inc. Selective binding agents of telomerase
WO2010085100A2 (ko) * 2009-01-21 2010-07-29 광주과학기술원 신규한 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 세포내 전달 시스템
US20110318380A1 (en) * 2008-10-01 2011-12-29 Dako Denmark A/S MHC Multimers in Cancer Vaccines and Immune Monitoring

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU207799B (en) 1991-07-24 1993-06-28 Beres Export Import Rt Process for producing pharmaceutical composition for influencing the reticuloendothelial system, for treating chronic pain symptomes of degenerative locomotor disorders or tumors, and for treating mucoviscidosis
US5885782A (en) * 1994-09-13 1999-03-23 Nce Pharmaceuticals, Inc. Synthetic antibiotics
EP0930876B2 (en) 1996-07-22 2010-07-07 Renovo Limited Use of compounds that promote oestrogenic activity for acclerating the healing of skin wounds
US6610839B1 (en) 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
SK155799A3 (en) 1997-05-15 2000-06-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Cachexia remedy
CA2294782A1 (en) 1997-07-01 1999-01-14 Cambia Biosystems Llc Vertebrate telomerase genes and proteins and uses thereof
US6378526B1 (en) 1998-08-03 2002-04-30 Insite Vision, Incorporated Methods of ophthalmic administration
IL132406A0 (en) 1998-10-21 2001-03-19 Pfizer Prod Inc Treatment of bph with cgmp elevators
US6815426B2 (en) 2001-02-16 2004-11-09 E. I. Du Pont De Nemours And Company Angiogenesis-inhibitory tripeptides, compositions and their methods of use
EP1378237A4 (en) 2001-04-10 2009-03-25 Nippon Shinyaku Co Ltd THERAPEUTIC AGENT FOR CHRONIC JOINT RHEUMATISM
US20030008822A1 (en) 2001-05-16 2003-01-09 Charles Dinarello Use of IL-18 inhibitors for the treatment or prevention of sepsis
WO2003038047A2 (en) 2001-10-29 2003-05-08 Baylor College Of Medicine Human telomerase reverse transcriptase as a class-ii restricted tumor-associated antigen
US7786084B2 (en) 2001-12-21 2010-08-31 Biotempt B.V. Treatment of burns
US7638480B2 (en) 2002-04-10 2009-12-29 Laboratoires Serono Sa Use of osteoprotegerin for the treatment and/or prevention of fibrotic disease
KR20050020987A (ko) 2002-06-12 2005-03-04 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 아데노신 수용체 길항제를 사용하여 허혈 재관류 손상을치료하는 방법
US20080025986A1 (en) 2003-06-06 2008-01-31 Ozes Osman N Methods of Treating Tnf-Mediated Disorders
JP4705567B2 (ja) 2003-06-25 2011-06-22 株式会社 キャンバス 免疫調整活性、抗炎症活性、および抗ウイルス活性を有するペプチドおよびペプチド模倣物
KR20050040517A (ko) 2003-10-29 2005-05-03 주식회사 오리엔트 허혈성 질환에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 생쥐
PT1530965E (pt) 2003-11-11 2006-05-31 Udo Mattern Sistema de administracao de libertacao controlada de hormonas sexuais para aplicacao nasal
GB0426146D0 (en) 2004-11-29 2004-12-29 Bioxell Spa Therapeutic peptides and method
EP2374508A1 (en) 2005-03-21 2011-10-12 Vicus Therapeutics SPE 1, LLC Combination of angiotension receptor blockers (ARB) and NSAIDs for use in ameliorating cachexia
WO2007061029A1 (ja) 2005-11-25 2007-05-31 Keio University 前立腺癌治療剤
EP1968643A2 (en) 2005-12-16 2008-09-17 Diatos Cell penetrating peptide conjugates for delivering of nucleic acids into a cell
WO2007097561A1 (en) * 2006-02-20 2007-08-30 Ewha University - Industry Collaboration Foundation Peptide having cell membrane penetrating activity
CN101490080A (zh) 2006-07-24 2009-07-22 为人技术株式会社 用于缓解和治疗缺血性病症的药物组合物及其输送方法
CN101616928B (zh) 2007-01-29 2015-04-15 株式会社普罗赛尔制药 新型大分子转导域及其识别方法和用途
KR20120087885A (ko) 2007-06-29 2012-08-07 안국약품 주식회사 난소암의 예측 마커
AU2008287340A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Amunix, Inc. Compositions and methods for modifying properties of biologically active polypeptides
US8362209B2 (en) 2007-08-23 2013-01-29 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Telomerase reverse transcriptase variant
US20090136917A1 (en) 2007-10-25 2009-05-28 Szalay Aladar A Systems and methods for viral therapy
GB2455539B (en) 2007-12-12 2012-01-18 Cambridge Entpr Ltd Anti-inflammatory compositions and combinations
TW200946541A (en) 2008-03-27 2009-11-16 Idenix Pharmaceuticals Inc Solid forms of an anti-HIV phosphoindole compound
US8828403B2 (en) 2008-06-16 2014-09-09 Mediolanum Farmaceutici S.P.A. Anti-tumor immunotherapy
US8252282B2 (en) 2008-06-19 2012-08-28 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Nuclear telomerase reverse transcriptase variant
ES2334315B1 (es) 2008-07-29 2011-02-28 Universitat Pompeu Fabra Peptidos con capacidad de penetracion celular y sus usos.
TW201020245A (en) 2008-08-20 2010-06-01 Schering Corp Ethynyl-substituted pyridine and pyrimidine derivatives and their use in treating viral infections
CN102224161B (zh) 2008-09-22 2016-03-30 日清药业股份有限公司 抗炎症肽
JP5826742B2 (ja) 2009-05-07 2015-12-02 ドンコック ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 神経損傷及び神経疾患の予防または治療用薬学組成物
EP2251028A1 (en) 2009-05-12 2010-11-17 Biocompatibles Uk Ltd. Treatment of eye diseases using encapsulated cells encoding and secreting an anti-angiogenic factor and/or a neuroprotective factor
US7928067B2 (en) 2009-05-14 2011-04-19 Ischemix Llc Compositions and methods for treating ischemia and ischemia-reperfusion injury
CN102428096B (zh) * 2009-05-20 2015-03-25 东丽株式会社 细胞膜通透性肽
KR20110057049A (ko) 2009-11-23 2011-05-31 박의신 기능성 전립선염 치료제
KR20110062943A (ko) 2009-12-04 2011-06-10 주식회사종근당 퀴나졸린 유도체를 유효성분으로 하는 전립선 비대증 예방 또는 치료제
RU2611191C2 (ru) 2010-01-11 2017-02-21 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных со связывающим половые гормоны глобулином (гспг), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к гспг
CN108383894A (zh) 2010-02-16 2018-08-10 阿尔特公司 多肽及其应用
FR2960542B1 (fr) 2010-05-27 2012-08-17 Esther Suzy Arlette Fellous Peptide en tant que medicament, en particulier pour le traitement du cancer
KR101263212B1 (ko) 2010-05-28 2013-05-10 성신여자대학교 산학협력단 신규한 세포막 투과성 펩타이드 및 그의 용도
WO2011150493A1 (en) 2010-05-30 2011-12-08 The Governing Council Of The University Of Toronto Mitochondrial penetrating peptides as carriers for antimicrobials
KR101388372B1 (ko) 2010-06-11 2014-04-23 한국화학연구원 청각보호 작용을 하는 신규 화합물
KR101348284B1 (ko) 2010-09-09 2014-01-03 주식회사 나이벡 인간 유래 세포 투과성 펩타이드와 생리활성 펩타이드 결합체 및 그 용도
US20120208755A1 (en) 2011-02-16 2012-08-16 Intarcia Therapeutics, Inc. Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers
KR20120121196A (ko) 2011-04-26 2012-11-05 주식회사 글루칸 관절염 치료제
KR101284772B1 (ko) 2011-05-24 2013-07-17 정종문 항염증, 진통효과를 가지는 기능성 식품 조성물
KR20120133661A (ko) 2011-05-31 2012-12-11 주식회사 바이오포트코리아 아스타잔틴을 포함하는 항염증제
KR101288053B1 (ko) 2011-07-04 2013-07-23 동국대학교 산학협력단 필발 추출물을 유효성분으로 포함하는 내이손상 예방 및 치료용 조성물
KR101361445B1 (ko) 2011-12-26 2014-02-12 성균관대학교산학협력단 펩타이드, 5-플루오로우라실, 및 성숙수지상세포를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
EP2749639B1 (en) 2012-02-10 2016-10-12 Hakushinkouseikai Foundation Proliferating agent for monocyte, culture medium for proliferating monocyte, method for producing monocyte, method for producing dendritic cell, and method for producing dendritic cell vaccine
WO2013135266A1 (en) 2012-03-12 2013-09-19 Gemvax As Treatment of non-small cell lung carcinoma by active immunotherapy
US9730984B2 (en) 2012-05-11 2017-08-15 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for preventing or treating rheumatoid arthritis
KR20210025132A (ko) * 2012-05-11 2021-03-08 주식회사 젬백스앤카엘 항염증 활성을 갖는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
US20150125438A1 (en) 2012-07-20 2015-05-07 Sang Jae Kim Anti-Inflammatory Peptides and Composition Comprising the Same
TWI678374B (zh) 2012-09-19 2019-12-01 韓商傑姆維克斯＆凱爾有限公司 穿膜胜肽以及包含該胜肽之共軛物及組成物(三)
KR102038487B1 (ko) 2012-09-19 2019-10-30 주식회사 젬백스앤카엘 텔로머라제 펩티드를 포함하는 항균 또는 항진균용 조성물
CN113699133A (zh) 2012-09-19 2021-11-26 珍白斯凯尔有限公司 细胞穿透肽、包含其的缀合物、及应用
CN110028554B (zh) 2012-09-19 2023-04-07 珍白斯凯尔有限公司 细胞穿透性肽、包含该肽的缀合物、及包含该缀合物的组合物
KR20140104288A (ko) 2013-02-20 2014-08-28 주식회사 카엘젬백스 Tnf-알파 저해제
US20140242154A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compounds, Compositions, Methods, and Kits Relating to Telomere Extension
ES2716870T3 (es) 2013-04-19 2019-06-17 Gemvax & Kael Co Ltd Composición para el tratamiento y prevención de lesión isquémica
CN104508485B (zh) 2013-06-07 2017-01-18 杰姆维克斯&凯尔有限公司 在癌症免疫疗法中有用的生物标记
KR20160039152A (ko) 2013-06-21 2016-04-08 주식회사 젬백스앤카엘 호르몬 분비 조절제, 이를 포함하는 조성물, 및 이를 사용한 호르몬 분비 조절 방법
RU2661596C2 (ru) 2013-10-23 2018-07-17 Джемвакс Энд Каэл Ко., Лтд. Композиция для лечения и профилактики доброкачественной гиперплазии простаты
ES2818921T3 (es) 2013-11-22 2021-04-14 Gemvax & Kael Co Ltd Péptido que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis y composición que contiene el mismo
KR102314231B1 (ko) 2013-12-17 2021-10-19 주식회사 젬백스앤카엘 전립선 암 치료용 조성물
EP3130345B9 (en) 2014-04-11 2022-05-04 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having fibrosis inhibitory activity and composition containing same
CN106659149B (zh) 2014-04-30 2020-05-19 珍白斯凯尔有限公司 用于器官、组织或细胞移植的组合物、试剂盒和移植方法
KR102413243B1 (ko) 2014-12-23 2022-06-27 주식회사 젬백스앤카엘 안질환 치료 펩티드 및 이를 포함하는 안질환 치료용 조성물
US10835582B2 (en) 2015-02-27 2020-11-17 Gemvax & Kael Co. Ltd. Peptide for preventing hearing loss, and composition comprising same
JP6920324B2 (ja) 2015-11-03 2021-08-18 ジェムバックス アンド カエル カンパニー，リミティド 神経細胞の損失予防及び再生の効能を有するペプチド及びこれを含む組成物
KR20170054310A (ko) 2015-11-09 2017-05-17 주식회사 젬백스앤카엘 텔로머라제 유래 펩티드를 포함하는 수지상세포 치료제 및 면역 치료제, 및 이를 사용하는 치료방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0990701A1 (en) * 1998-03-26 2000-04-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Monoclonal antibody against human telomerase catalytic subunit
WO2000002581A1 (en) * 1998-07-08 2000-01-20 Norsk Hydro Asa Antigenic peptides derived from telomerase
US7078491B1 (en) * 2000-09-21 2006-07-18 Amgen Inc. Selective binding agents of telomerase
US20110318380A1 (en) * 2008-10-01 2011-12-29 Dako Denmark A/S MHC Multimers in Cancer Vaccines and Immune Monitoring
WO2010085100A2 (ko) * 2009-01-21 2010-07-29 광주과학기술원 신규한 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 세포내 전달 시스템

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Heat shock protein-mediated cell penetration and cytosolic delivery of macromolecules by a telomerase-derived peptide vaccine;Seoung-Ae Lee等;《Biomaterials》;20130701;第34卷(第30期);7495-7505 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104822698A (zh) 2015-08-05
JP2015530358A (ja) 2015-10-15
EP2873678B1 (en) 2024-06-26
KR20150034746A (ko) 2015-04-03
KR101799904B1 (ko) 2017-11-22
EP2873678A1 (en) 2015-05-20
US20160151512A1 (en) 2016-06-02
WO2014010971A1 (ko) 2014-01-16
EP2873678A4 (en) 2016-05-18
US10967000B2 (en) 2021-04-06
JP6272853B2 (ja) 2018-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104822698B (zh) 细胞穿透肽以及包含该肽的缀合物和组合物
CN104768967B (zh) 细胞穿透性肽、包含该肽的缀合物、及包含该缀合物的组合物
CN104981478B (zh) 细胞穿透肽、包含该肽的缀合物、及包含该缀合物的组合物
CN104837859B (zh) 细胞穿透肽、包含该肽的缀合物、及包含该缀合物的组合物
TWI616530B (zh) 穿膜胜肽以及包含該胜肽之共軛物及組成物（一）
CN116874563A (zh) 具有高转染效率的pH响应性多肽及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: South Korea field wide area

Applicant after: Jane white Kell Co., Ltd.

Applicant after: Jin Shangzai

Address before: South Korea field wide area

Applicant before: Jim Vickers & Kyle Ltd

Applicant before: Jin Shangzai

COR Change of bibliographic data
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant