CN107759698A

CN107759698A - 一种egfp‑cta2‑tat融合蛋白在制备荧光探针中的应用

Info

Publication number: CN107759698A
Application number: CN201710842079.6A
Authority: CN
Inventors: 王甜甜; 王华倩; 林丹敏; 何华锋
Original assignee: Guangdong University of Technology
Current assignee: Guangdong University of Technology
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2018-03-06

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种EGFP‑CTA2‑TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用。所述的EGFP‑CTA2‑TAT融合蛋白的结构中含有的TAT部分是穿膜肽能够帮助设计的荧光探针穿过细胞膜进入细胞内部；CTA2部分中含有内质网定位序列KDEL可实现对细胞内内质网的靶向定位；该融合蛋白最终通过激发EGFP发出绿色荧光，可实现对活细胞内内质网及其相应生理变化的实时微观示踪检测。与普通内质网染色剂相比具有良好的生物相容性、安全无毒且具有更高的靶向性和检测灵敏性的特点。

Description

一种EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用。

背景技术

近几十年来，随着一些新的分子识别机理的建立、新型材料的开发与应用以及科技的进步，越来越多的生物荧光探针被发展用于生命科学学科中的基础研究。其研究的对象从均相溶液中的各种离子或分子过渡到生物体内的离子、小分子和生物大分子(酶、核酸、蛋白质等)。科研工作者们除了不断追求具有灵敏度更高、选择性更好的生物荧光探针的构建方法外，更注重将生物荧光探针应用于生物体内重要的信号转导分子的原位检测以及实时监测它们在生命代谢过程中的应激变化。这使得以生物荧光探针为主体的传感器成为研究生命科学工作中的重要工具，它们也极大地推动了生命科学的发展，并有助于研究者们去探索生命过程中的未知领域。已开发且用于检测细胞内目标物的生物荧光探针主要有：基于有机分子荧光探针、核酸或多肽的荧光探针、纳米材料探针以及绿色荧光蛋白探针等。

实验室研究中多功能融合蛋白构建的技术已经相当成熟，EGFP具有绿色荧光、CTA2中含有内质网定位序列KDEL及TAT作为穿膜肽的身份已经众所周知。但是这种利用蛋白融合技术构建的具有良好生物相容性的生物大分子蛋白作为荧光探针的方法目前尚未见报道。

发明内容

为克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白的氨基酸序列如下所示：

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKASEFELGGGGSMSNTCDEKTQSLGVKFLDEYQSKVKRQIFSGYQSDIDTHNRIKDELVDGRKKRRQRRRPPQLEHHHHHH

编码所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白的核苷酸序列如下所示：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGCTAGCGAATTCGAGCTCGGAGGTGGTGGATCCATGAGCAATACGTGCGATGAGAAGACACAAAGCCTGGGCGTGAAATTCTTAGACGAATATCAAAGCAAAGTGAAACGCCAAATCTTCAGCGGATACCAAAGCGATATTGACACGCACAATCGCATCAAGGATGAGTTAGTCGACGGTCGTAAGAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTCCACCACAGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白的制备方法，包含如下步骤：

将含有目的重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的Escherichia coli BL21(DE3)菌种进行活化、扩大培养；然后进行目标蛋白的诱导表达，获得湿菌体；湿菌体悬浮裂解，并离心，得到上清蛋白溶液；上清蛋白溶液进行镍柱亲和层析，透析除盐，冷冻干燥，得到EGFP-CTA2-TAT融合蛋白；

所述的活化的具体步骤优选为：

(1)将含有重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的E.coli BL21(DE3)菌种保藏液在含有终浓度为50μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中37℃、200r/min培养3～4h；

(2)将步骤(1)制得的菌液划平板，37℃固体培养12～14h；

(3)挑步骤(2)培养得到的单菌落于含有终浓度为50μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中37℃、200r/min培养12～14h；

(4)将甘油和步骤(3)制得的菌液混合，得到活化后的含有重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的E.coli BL21(DE3)单克隆菌种菌液；

所述的扩大培养的具体步骤优选为：

(1)将活化后的含有重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的E.coli BL21(DE3)单克隆菌种菌液以体积比1:100的比例接种到含终浓度为50μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃、200r/min培养12～14h；

(2)将步骤(1)中培养的菌液按照体积比1:50转接到含终浓度为50μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃、200r/min扩大培养4h；

所述的诱导表达的条件优选为：

采用终浓度为1mmoL/L的IPTG，37℃、200r/min诱导5h；

所述的悬浮裂解的具体步骤优选为：

将湿菌体悬浮于裂解缓冲液中，加入溶菌酶并搅拌均匀；将上述混合液进行反复冻融，直至菌体充***解，不再粘稠；若反复冻融之后菌液依然粘稠则加入DNA酶进一步裂解，直至菌体充***解，不再粘稠；

所述的湿菌体和裂解缓冲液的质量体积比优选为1g:10mL；

所述的裂解缓冲液优选为PBS缓冲液；

所述的溶菌酶的终浓度优选为80μg/mL；

所述的镍柱亲和层析的具体操作优选为：

层析柱湿法装填料(Ni-琼脂糖凝胶6FF(His标签纯化树脂))，用PBS缓冲液进行层析柱平衡，上清蛋白溶液上样；上样完毕之后再次用PBS缓冲液对层析柱进行平衡；平衡结束之后进行蛋白梯度洗脱，梯度洗脱的洗脱液分别为：含终浓度为20mM咪唑的PBS缓冲液、含终浓度为60mM咪唑的PBS缓冲液、含终浓度为100mM咪唑的PBS缓冲液、含终浓度为200mM咪唑的PBS缓冲液、含终浓度为300mM咪唑的PBS缓冲液、含终浓度为500mM咪唑的PBS缓冲液；收集含终浓度为100mM咪唑的PBS缓冲液洗脱得到的收集液；

所述的透析除盐的具体操作优选为：

将含终浓度为100mM咪唑的PBS缓冲液洗脱得到的收集液分别利用PBS缓冲液、体积分数为50％的PBS缓冲液、水进行透析除盐，每8h内更换一次透析液；其中，水可透析两次保证除盐更彻底；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

EGFP-CTA2-TAT融合蛋白作为荧光探针生物相容性良好、无细胞毒作用且靶向内质网，其中，EGFP-CTA2-TAT融合蛋白不仅具有普通内质网染色剂的染色功能，且EGFP激发光为绿色荧光，绿色属于人眼最敏感的光颜色，大大提高了检测的灵敏度；EGFP-CTA2-TAT融合蛋白结构中的TAT部分属于穿膜肽，具有良好的穿膜活性从而可维持细胞活性，能够帮助设计的荧光探针穿过细胞膜进入细胞内部；EGFP-CTA2-TAT融合蛋白结构中的CTA2部分中含有内质网定位序列KDEL可实现对细胞内内质网的靶向定位，减少对细胞内其他膜结构染色的概率。最终通过激发EGFP发出绿色荧光，可实现对细胞内内质网及其相应生理变化的实时微观示踪检测。因此，EGFP-CTA2-TAT融合蛋白可作为一种生物相容性良好的活细胞内靶向定位内质网的绿色荧光探针。

附图说明

图1是pET22b-EGFP-CTA2-TAT质粒图。

图2是不同梯度洗脱时收集液的SDS-PAGE检测图；其中，1：蛋白样品上样后PBS缓冲液平衡时段收集液；2：含终浓度为20mM咪唑的PBS缓冲液洗脱时段收集液；3：含终浓度为100mM咪唑的PBS缓冲液洗脱时段收集液；4：含终浓度为500mM咪唑的PBS缓冲液洗脱时段收集液。

图3是细胞穿膜活性验证结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中，含有重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的E.coli BL21(DE3)菌种已在申请号为“201410578270.0”，申请名称为“一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质及其制备方法、用途”中公开，该菌种所含重组质粒为EGFP-CTA2-TAT基因片段***pET22b质粒多克隆位点Nde I和Xho I所得(图1)；

实施例中所用培养基的配方如下所示：

LB液体培养基(1L配方)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g；

LB固体培养基(1L配方)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂粉15g。

实施例1菌种活化及甘油管保藏

(1)平板制备：LB固体培养基配料，灭菌121℃、30min；提前开紫外30min的超净工作台点燃酒精灯，平板半开环绕酒精灯放置；灭过菌的LB固体培养基在超净工作台冷却至约60℃，加氨苄抗生素(终浓度50μg/mL)迅速吹打、摇匀；培养基凝固之前完成倒平板，倒完平板半开，工作台开通风，培养基凝固就盖好保鲜膜包起来保存。

(2)接菌：一管5mL LB液体培养基、先加2.5μL氨苄抗生素母液(母液浓度100mg/mL)、再加50μL含有重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的E.coli BL21(DE3)菌种保藏液；37℃、200r/min培养4h；

(3)划平板：接种环用酒精灯充分灼烧后，沾步骤(2)制得的菌液，“Z”字法划平板；保鲜膜封包37℃培养箱培养12～14h；

(4)挑单克隆：挑步骤(3)制得的单菌落于含2.5μL氨苄抗生素母液(母液浓度100mg/mL)的5mL LB液体培养基37℃、200r/min培养12h；

(5)菌种保藏(体积分数为60％的甘油管)：，50μL甘油和50μL步骤(4)制得的菌液混合，得到活化后的含有重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的E.coli BL21(DE3)单克隆菌种菌液；封口胶封口，做标记并于-20℃冻存。

实施例2目的菌种的扩大培养以及目标蛋白的诱导表达

(1)在超净工作台将实施例1制得的活化后的含有重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的E.coli BL21(DE3)单克隆菌种菌液以体积比1:100的比例接种到含有氨苄抗生素(终浓度50μg/mL)的LB液体培养基中；然后置于37℃，200r/min的摇床过夜培养12h；

(2)超净工作台上将步骤(1)中过夜培养的菌液按照体积比1:50转接到含有氨苄抗生素(终浓度50μg/mL)和LB液体培养基的锥形瓶中；然后置于200r/min、37℃摇床扩大培养4h；

(3)将步骤(2)中扩大培养后的菌液加入终浓度为1mmoL/L的IPTG；摇床37℃、200r/min诱导5h；

(4)将步骤(3)诱导表达后的菌液4℃、10000r/min离心10min，收集菌体弃上清培养基，获得湿菌体并称量其质量。

实施例3EGFP-CTA2-TAT融合蛋白的提取和纯化

(1)将实施例2制得的湿菌体悬浮于裂解缓冲液(PBS缓冲液)中(湿菌体：裂解缓冲液＝1g：10mL)；加入溶菌酶(终浓度80μg/mL)并用磁力搅拌器搅拌均匀；将上述混合液放到冰箱进行反复冻融，若反复冻融之后菌液依然粘稠加入DNA酶进一步裂解；

(2)当步骤(1)中的菌体充***解，保证不再粘稠，使用冷冻离心机4℃、10000r/min离心10min，弃去沉淀收集上清，得到上清蛋白溶液；

(3)层析柱湿法装填料(Ni-琼脂糖凝胶6FF(His标签纯化树脂))，连接层析仪器(核酸蛋白检测仪、蠕动泵、层析柱)各个接管，用PBS缓冲液进行层析柱平衡；利用蠕动泵(0.8rpm)将步骤(2)制得的上清蛋白溶液上样，使目的蛋白充分挂柱，并在柱子达到饱和之后停止上样防止蛋白溶液浪费；

(4)上样完毕之后再次用PBS缓冲液对层析柱进行平衡；

(5)平衡结束之后进行蛋白梯度洗脱，梯度洗脱的洗脱液分别为：含终浓度为20mM咪唑的PBS缓冲液、含终浓度为60mM咪唑的PBS缓冲液、含终浓度为100mM咪唑的PBS缓冲液、含终浓度为200mM咪唑的PBS缓冲液、含终浓度为300mM咪唑的PBS缓冲液、含终浓度为500mM咪唑的PBS缓冲液；收集各流出液，并分别取样进行SDS-PAGE检测。结果如图2所示，含终浓度为100mM咪唑的PBS缓冲液洗脱得到的收集液(蛋白溶液)目的蛋白含量最高且纯度也最高。

(6)将步骤(4)中含终浓度为100mM咪唑的PBS缓冲液洗脱得到的收集液装进预先活化好的透析袋中；分别利用纯PBS缓冲液、体积分数为50％的PBS缓冲液、清水对蛋白溶液进行透析除盐，每8h内更换一次透析液，清水透析两次保证除盐更彻底；

(7)将透析好的目的蛋白溶液装进平皿按要求封口后，放进冰箱使其充分结冰；准备好的样品放入预先预冷好的冻干机内-80℃抽真空条件下进行冻干，得到EGFP-CTA2-TAT融合蛋白，冻干完成后将平皿上的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白(丝絮状蛋白)刮下于洁净灭菌EP管内，并做标记于-20℃冻存。

实施例4

将实施例3制得的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白制成溶液(10mg/mL)加入***癌细胞PC-3(购自中科院上海细胞所，按照常规方法培养)中，于37℃的CO₂培养箱中共孵育培养1h；孵育培养过后去除培养基，并将细胞用PBS小心洗涤三次；洗涤好的细胞转移到荧光显微镜下观察细胞内的荧光分布情况。

结果如图3所示，EGFP-CTA2-TAT融合蛋白具有很好的穿膜活性并可定位到内质网上进行荧光显色的特点。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东工业大学

<120> 一种EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 319

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EGFP-CTA2-TAT融合蛋白的氨基酸序列

<400> 1

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala

225 230 235 240

Ser Glu Phe Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Asn Thr Cys Asp

245 250 255

Glu Lys Thr Gln Ser Leu Gly Val Lys Phe Leu Asp Glu Tyr Gln Ser

260 265 270

Lys Val Lys Arg Gln Ile Phe Ser Gly Tyr Gln Ser Asp Ile Asp Thr

275 280 285

His Asn Arg Ile Lys Asp Glu Leu Val Asp Gly Arg Lys Lys Arg Arg

290 295 300

Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Leu Glu His His His His His His

305 310 315

<210> 2

<211> 960

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码EGFP-CTA2-TAT融合蛋白的核苷酸序列

<400> 2

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaaggct 720

agcgaattcg agctcggagg tggtggatcc atgagcaata cgtgcgatga gaagacacaa 780

agcctgggcg tgaaattctt agacgaatat caaagcaaag tgaaacgcca aatcttcagc 840

ggataccaaa gcgatattga cacgcacaat cgcatcaagg atgagttagt cgacggtcgt 900

aagaaacgtc gtcagcgtcg tcgtccacca cagctcgagc accaccacca ccaccactga 960

Claims

1.一种EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，其特征在于：所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，其特征在于：

编码权利要求1中所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，其特征在于：

所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白的制备方法，包含如下步骤：

将含有目的重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的Escherichia coli BL21(DE3)菌种进行活化、扩大培养；然后进行目标蛋白的诱导表达，获得湿菌体；湿菌体悬浮裂解，并离心，得到上清蛋白溶液；上清蛋白溶液进行镍柱亲和层析，透析除盐，冷冻干燥，得到EGFP-CTA2-TAT融合蛋白。

4.根据权利要求3所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，其特征在于：

所述的活化的具体步骤为：

(2)将步骤(1)制得的菌液划平板，37℃固体培养12～14h；

(4)将甘油和步骤(3)制得的菌液混合，得到活化后的含有重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的E.coli BL21(DE3)单克隆菌种菌液。

5.根据权利要求3所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，其特征在于：

所述的扩大培养的具体步骤为：

(2)将步骤(1)中培养的菌液按照体积比1:50转接到含终浓度为50μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃、200r/min扩大培养4h。

6.根据权利要求3所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，其特征在于：

所述的诱导表达的条件为：

采用终浓度为1mmoL/L的IPTG，37℃、200r/min诱导5h。

7.根据权利要求3所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，其特征在于：

所述的悬浮裂解的具体步骤为：

将湿菌体悬浮于裂解缓冲液中，加入溶菌酶并搅拌均匀；将上述混合液进行反复冻融，直至菌体充***解，不再粘稠。

8.根据权利要求3所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，其特征在于：

所述的镍柱亲和层析的具体操作为：

层析柱湿法装填料，用PBS缓冲液进行层析柱平衡；上清蛋白溶液上样；上样完毕之后再次用PBS缓冲液对层析柱进行平衡；平衡结束之后进行蛋白梯度洗脱，梯度洗脱的洗脱液分别为：含终浓度为20mM咪唑的PBS缓冲液、含终浓度为60mM咪唑的PBS缓冲液、含终浓度为100mM咪唑的PBS缓冲液、含终浓度为200mM咪唑的PBS缓冲液、含终浓度为300mM咪唑的PBS缓冲液、含终浓度为500mM咪唑的PBS缓冲液；收集含终浓度为100mM咪唑的PBS缓冲液洗脱得到的收集液。

9.根据权利要求3所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，其特征在于：

所述的透析除盐的具体操作为：

将含终浓度为100mM咪唑的PBS缓冲液洗脱得到的收集液分别利用PBS缓冲液、体积分数为50％的PBS缓冲液、水进行透析除盐，每8h内更换一次透析液。