CN104814973B - Cappariloside A在制备用于治疗流感以及流感病毒介导的炎症性疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供Cappariloside A在制备用于治疗流感或由流感病毒介导的炎症性疾病的药物中的应用，为临床治疗流感病毒性疾病提供一种新途径。所述Cappariloside A具有抑制流感病毒的子代病毒复制、及抑制流感病毒介导的炎症因子产生的作用。本发明还提供用于治疗流感或由流感病毒介导的炎症的药物，所述药物其活性成分包括前文所述的Cappariloside A。Cappariloside A在治疗流感病毒性疾病方面具有安全有效、毒副作用小的特点。

Description

Cappariloside A在制备用于治疗流感以及流感病毒介导的 炎症性疾病的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，本发明进一步涉及Cappariloside A在制备抗流感病毒药物以及在制备用于治疗流感病毒介导的炎症性疾病的药物中的应用。

背景技术

流感病毒感染人体后，除了病毒本身导致的损害外，病毒也可以引起宿主的免疫反应，释放大量的炎症细胞和炎症因子，造成炎症风暴，进一步加重宿主的损害。已经有研究表明：流感病毒感染人，特别是人感染禽流感病毒后，血液中炎症因子水平明显升高。炎症因子的调节失调与流感病毒导致的疾病严重性以及临床结局相关。也有研究表明炎症因子调节失调加重了H5N6、H7N9等人感染禽流感病毒的致病性，导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。因此现在对于流感病毒感染导致的疾病治疗，除了抗病毒本身外，宿主的炎症免疫调节也受到了重视。目前临床用于抑制流感病毒介导的炎症反应的药物是糖皮质激素，但是激素的使用副作用大，临床使用存在争议，而且激素只能调节宿主本身，对病毒本身无治疗作用。很多中药都已经被证明有免疫调节作用，板蓝根是其中的一种中药，已经有研究证明板蓝根中的有效成分可以调节宿主的免疫功能，同时板蓝根的有效成分也被证明可以抑制流感病毒的复制。因此，从板蓝根中分离制备并筛选出能抑制流感病毒以及抑制流感病毒介导的炎症反应的有效成分，发现其独特的药效机制，并获得自主知识产权，对于发掘祖国医学宝库，加大中药的开发力度具有重大的意义。

目前从北板蓝根中分离和提纯得到的Cappariloside A的结构式为：

目前已有关于Cappariloside A(老鼠瓜苷A)化学分离和结构鉴定的报道(例如Phytochemistry,1999,50:1205-1208)，但是关于Cappariloside A在抗流感病毒以及抑制流感病毒介导的炎症因子的产生中的应用未见报道。

发明内容

本发明提供Cappariloside A的新应用，即Cappariloside A在制备用于治疗流感或由流感病毒介导的炎症性疾病的药物中的应用，为临床治疗流感病毒性疾病提供一种新途径。

进一步的，所述Cappariloside A具有抑制流感病毒的子代病毒复制的作用，具体如抑制人流感病毒H1N1(PR8标准株)感染人气道上皮细胞(16HBE)后子代病毒的复制；还具有抑制流感病毒介导的炎症因子产生的作用，具体如抑制人流感病毒H1N1(PR8标准株)感染小鼠巨噬细胞(RAW264.7)后炎症因子的蛋白产生。本发明也进一步提供CapparilosideA在制备具有上述作用的药物中的应用。炎症因子包括但不限于IP-10、MIG、CCL-5、CCL-5/RANTES。

所述流感病毒包括但不限于甲、乙型流感病毒和禽流感病毒；所述甲、乙型流感病毒和禽流感病毒包括但不限于人流感病毒H1N1亚型、H3N2亚型以及INF B型，还包括禽流感病毒H7N3、H9N2亚型，所述的人流感病毒H1N1亚型包括新甲型H1N1流感病毒。

进一步的，所述Cappariloside A可为从天然植物提取或化学合成的，所述天然植物例如北板蓝、维药刺山柑等。

进一步的，所述药物可制成药学上允许的任意剂型，其剂型例如为片剂、胶囊等。

本发明还提供一种用于治疗流感或由流感病毒介导的炎症的药物，所述药物其活性成分包括前文所述的Cappariloside A。

本发明为临床治疗流感病毒性疾病提供一种安全有效、毒副作用小的药物。

本发明采用细胞病变抑制法在治疗模式下验证提取自北板蓝的Cappariloside A以及化学合成的Cappariloside A对流感病毒复制的抑制作用，以磷酸奥司他韦为阳性对照药。观察Cappariloside A对MDCK细胞的毒性以及对流感病毒复制的抑制作用，利用MTT法测得提取自北板蓝根的Cappariloside A的半数有毒浓度(TC₅₀)为11.05mg/mL，化学合成的Cappariloside A的半数有毒浓度(TC₅₀)为2.5mg/ml。Cappariloside A提取物在预防模式和治疗模式下均对甲型流感H1N1(PR8)有抑制作用，半数有效浓度(IC₅₀)分别为1.04mg/mL和5.2mg/mL，在直接模式下无效。而化学合成物只是在治疗模式下对甲型流感H1N1(PR8)有抑制作用，半数有效浓度(IC₅₀)为0.743mg/mL，而在预防模式下无作用。

本发明对Cappariloside A作用于宿主细胞抑制流感病毒介导的炎症因子产生的作用进行了进一步探讨，采用Real-time PCR和ELISA的方法研究药物抑制流感病毒刺激人气道上皮细胞(16HBE)后炎症因子的表达。结果显示Cappariloside A可以降低流感病毒H1N1(PR8)刺激16HBE细胞6小时后趋化因子(IP-10、MIG、CCL-5等)的mRNA水平，并且能降低流感病毒H1N1(PR8)刺激16HBE细胞24小时后趋化因子(IP-10、MIG、CCL-5等)的mRNA水平和蛋白水平。结果也显示在药物浓度为2mg/mL和1mg/mL时既可以抑制流感病毒的子代病毒的复制，也可以抑制流感病毒介导的炎症因子的表达；在浓度为0.5mg/ml和0.25mg/mL时对流感病毒的复制没有抑制作用，但是能有效的抑制炎症因子的表达。对于巨噬细胞(RAW264.7)，药物在浓度为1mg/mL和0.5mg/mL时能有效的抑制流感病毒介导的炎症因子(IP-10和CCL-5/RANTES)的蛋白水平的表达。

附图说明

图1是实施例2Cappariloside A化学合成过程图；

图2A-图2G是药物对人气道上皮细胞(16HBE)药物毒性和药物在作用24小时时抑制流感病毒子代病毒的复制以及抑制流感病毒介导的炎症因子mRNA和蛋白的表达；

图3A-图3C是药物在作用6小时时抑制流感病毒介导的炎症因子mRNA的表达。

图4A-图4F是药物对巨噬细胞(RAW264.7)药物毒性和药物作用24小时后抑制流感病毒介导的炎症因子的蛋白表达。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合具体实施例对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实例。

实施例1 Cappariloside A单体成分分离纯化、结构鉴定

采用本技术领域现有分离纯化方法分离纯化Cappariloside A即可，下面对其分离纯化方法介绍如下供参考:将板蓝根甲醇浸膏溶于水，分别用乙酸乙酯、正丁醇萃取，正丁醇部分经大孔树脂D101进一步脱糖，收集乙醇洗脱部分经Sephadex LH-20柱色谱分离，以甲醇-水(0：100-100：0，体积比)梯度洗脱得到Fr.1～Fr.6。Fr.3经制备型HPLC进一步纯化得到白色粉末样结晶。

该结晶经NMR、ESI-MS波谱解析，结果如下：

ESIMS m/z:357.1058[M+Na]⁺(calcd for C₁₆H₁₈N₂O₆:334.1058).1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:11.07(1H,br,H-1)，7.19(1H,s,H-2)，6.68(1H,d,J＝6.0Hz,H-5)，7.02(1H,br,H-6)，6.99(1H,d,J＝6.4Hz,H-7)，4.16(2H,d,J＝18.8Hz,H-8)，4.88(1H,d,J＝7.6Hz,β-glu-1’)，3.36～3.80(5H,m,β-glu-2’～β-glu-6’)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:123.3(C-2),104.2(C-3),117.1(C-3a),152.3(C-4),103.8(C-5)，123.0(C-6),106.5(C-7),138.4(C-7a),15.4(C-8),120.7(C-9),101.8(β-glu-1’),74.0(β-glu-2’),77.2(β-glu-3’),70.3(β-glu-4’),77.5(β-glu-5’),61.2(β-glu-6’)。结构鉴定为：Cappariloside A，其结构和前文背景技术中提及的结构一致。

实施例2 Cappariloside A的化学合成

下面提供合成Cappariloside A的一种方法供参考，按照如下步骤制备Cappariloside A(该实施例中出现的百分含量若未进行特别说明，均为质量百分含量)：

1)制备N,N-二甲基(4-苄氧基-1H-吲哚-3-基)甲胺(对应于图1中化合物2)

在1000mL圆底烧瓶中加入1,4-二氧六环(100mL)、冰醋酸(100mL)和37％的水合甲醛(3.83mL,50.5mmol)，0℃下依次滴加40％的二甲胺水溶液和4-苄氧基吲哚的1,4-二氧六环溶液(11.16g溶于100mL 1,4-二氧六环)，滴加完毕后，升至室温搅拌36小时。向反应溶液中加入500mL水，用10％的氢氧化钠水溶液调节pH值到8-9之间，将析出的白色沉淀过滤，滤饼先后用水和乙酸乙酯洗涤，得白色固体13.2g，产率94％。

经检测，结果如下:¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.91(s,1H),10.91(s,1H),7.56(d,J＝7.1Hz,2H),7.41(t,J＝7.2Hz,2H),7.34(d,J＝7.0Hz,1H),7.04(s,1H),6.95(s,2H),6.55(s,1H),5.15(s,2H),3.63(s,2H),2.07(s,6H).

¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ153.68,138.40,138.13,128.75,128.04,127.97,123.80,122.05,177.83,112.14,105.47,100.69,69.53,55.30,45.10.

MS m/z(ESI)289.1[M+Na]⁺

2)制备2-(4-苄氧基-1H-吲哚-3-基)乙腈(对应于图1中化合物4)

将化合物2(6.61g,28.25mmol)溶于二氯甲烷和甲苯的混合溶剂中(v/v＝8/15)230mL，滴加碘甲烷(7.02mL,56.49mmol)，室温搅拌12小时。蒸干反应溶剂，将残留物溶于130mL四氢呋喃，依次滴加三甲基氰硅烷(4.91mL,42.37mmol)和四丁基氟化铵溶液85mL(1Nin THF,85mmol)，室温搅拌12小时。蒸干反应溶剂，加入200mL二氯甲烷溶解，用水洗涤(100mL)，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，硅胶柱层析法纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)，得产物2.9g，产率47.4％。

经检测，结果如下:¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.11(s,1H),7.57(d,J＝7.5Hz,2H),7.42-7.31(m,3H),7.23(s,1H),7.05–6.93(m,2H),6.65–6.52(m,1H),5.21(s,2H),4.05(s,2H).

¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ153.10,138.47,128.86,128.11,127.84,123.35,123.07,120.33,116.62,105.77,104.08,101.11,69.67,15.67.

MS m/z(ESI)271.0[M+Na]⁺

3)制备2-(4-羟基-1H-吲哚l-3-基)乙腈(对应于图1中化合物5)

将化合物4(2.62g,10mmol)溶于50mL甲醇中，加入10％的钯碳(0.26g)，用一个大气压的氢气还原10小时。滤除钯碳，蒸干反应溶剂，得产物1.36g，产率80％。

经检测，结果如下:¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.91(s,1H),9.52(s,1H),7.13(s,1H),6.92–6.76(m,2H),6.35(d,J＝7.4Hz,1H),4.04(s,2H).

¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ151.95,138.90,123.16,122.60,120.47,116.24,104.11,103.69,103.65,15.47.

MS m/z(ESI)195.0[M+Na]⁺

4)制备4-(2’,3’,4’,6’--四乙酰氧基-α-D-吡喃葡萄糖)吲哚-3-乙腈(对应于图1中化合物6)

将化合物5(1.72g,10mol)、2,3,4,6-四乙酰氧基-alpha-D-吡喃葡萄糖溴化物(8.2g,20mmol),苄基三丁基氯化铵(0.6g,2mmol)和碳酸钾(6.9g,50mmol)溶于水和氯仿混合溶液中(v/v＝1/10，44mL)，室温搅拌。TLC监测原料反应完全后(约24小时)，滴加10％的盐酸调节pH值到7，分出有机层，依次用饱和碳酸氢钠(30mL)和饱和食盐水(30mL)洗涤有机层，蒸干反应溶剂，柱层析法纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，得产物4.3g，产率83％。

经检测，结果如下:¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.20(s,1H),7.26(d,J＝2.3Hz,1H),7.09-7.01(m,7.6Hz,2H),6.64(d,J＝6.9Hz,1H),5.76(d,J＝7.9Hz,1H),5.47(t,J＝9.5Hz,1H),5.22(dd,J＝9.6,8.0Hz,1H),5.02(t,J＝9.7Hz,1H),4.38–4.25(m,1H),4.21(m,1H),4.06(m,1H),3.92(s,2H),2.01(m,12H).

¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ170.36,170.07,169.94,169.81,150.35,138.58,124.15,122.72,120.10,116.56,107.23,103.69,103.28,96.56,72.74,71.38,71.16,68.68,62.14,20.97,20.89,20.87,20.76,14.98.

MS m/z(ESI)525.1[M+Na]⁺

5)制备2-(4-((2R,3S,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)-四氢化-2H-吡喃)-1H-吲哚-3-基)乙腈(对应于图1中化合物7)

将化合物6(1g,2mmol)溶于四氢呋喃、甲醇和水(v/v/v＝2/3/1)的12mL混合溶剂中，加入0.5g氢氧化锂，室温反应12小时。TLC监测原料反应完全后，蒸干反应溶剂，硅胶柱柱层析法纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:10)，得产物0.32g，产率50％。

经检测，产物为Cappariloside A，检测结果如下:¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.08(s,1H),7.20(s,1H),7.09–6.90(m,2H),6.69(d,J＝6.8Hz,1H),5.31(d,J＝5.5Hz,1H),5.11(d,J＝4.6Hz,1H),5.03(d,J＝5.1Hz,1H),4.90(d,J＝7.7Hz,1H),4.59(t,J＝5.6Hz,1H),4.29–3.83(m,2H),3.75-3.71(m,1H),3.53-3.47(m,1H),3.41–3.35(m,1H),3.31–3.17(m,1H).

¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ152.34,138.45,123.28,123.01,120.63,117.16,106.53,104.26,103.86,101.84,77.56,77.24,74.04,70.32,61.28,15.39.

MS m/z(ESI)357.1[M+Na]⁺

下面提供试验例对Cappariloside A所具有的新功效加以证实，用于进一步阐明本发明，而不构成对本发明范围的限制。

试验例1 Cappariloside A对不同亚型流感病毒的体外抑制作用

1.1.材料

1.1.1药物阳性对照药：磷酸奥司他韦：购自美国GIBCO公司，货号Y0001337；实验药物--Cappariloside A：板蓝根生药材由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供，采自黑龙江大庆及安徽阜阳板蓝根GAP基地，由中国科学院华南植物院叶华国研究员鉴定为菘蓝Isatis infigotica Fort.的根，即板蓝根。将其按照实施例1进行提取、纯化、鉴定，获得Cappariloside A提取物。Cappariloside A化学合成药按照实施例2制得。

1.1.2细胞狗肾细胞(MDCK)引自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库

1.1.3流感病毒株甲型H1N1流感病毒PR8株(A/PR/8/34，H1N1)、甲型H3N2流感病毒Aichi株(A/Aichi/2/68，H3N2)均购自美国经典培养物收藏中心(ATCC)；新甲型H1N1流感病毒株(A/Guangzhou/GIRD07/09，H1N1，Genebank No.HM014332.1)、乙型流感病毒

(B/Guangzhou/GIRD08/09)为本室临床分离株，甲型流感病毒H7N3(A/Duck/Guangdong/1994，H7N3)、H9N2(A/Chicken/Guangdong/1996，H9N2)由华南农业大学兽医学院陈建新教授惠赠。上述毒株流感病毒通过接种于9日龄的鸡胚尿囊腔中扩增，35℃孵育2d，收获尿囊液。用MDCK细胞滴定病毒，以细胞病变抑制法(CPE)判定这些毒株的半数感染量(TCID₅₀/100μL)作为病毒原始滴度。

1.1.4试剂DMSO(美国SIGMA公司)；MEM(美国GIBCO公司)批号：8114414；胎牛血清(美国GIBCO公司)批号：10099；PBS(美国GIBCO公司)批号：20150122；1mg/ml TPCK批号：20140220购自广州捷倍斯生物科技有限公司。MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2)购自Genebase。

1.2.实验方法

1.2.1药物溶解Cappariloside A，(包括提取自北板蓝根的提取物和化学合成药物)以DMSO溶解配制成工作母液(浓度500mg/mL)，置4℃保存；阳性药物磷酸奥司他韦用DMEM培养液溶解，过滤后置4℃保存。

1.2.2.药物毒性实验(MTT法)

按每孔约2.5×10⁴MDCK细胞接种到96孔板，24h后待细胞长成单层后，弃去培养液，加入不同稀释度的药物100μL/孔，空白对照和正常细胞对照孔加入100μL/孔MEM，37℃，5％CO₂继续培养36-48小时，每孔加MTT溶液(5mg/mL)20μL，置37℃，5％CO₂温箱中继续孵育4小时。吸弃培养上清液，每孔加100μL二甲基亚砜(DMSO)，低速振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。按照下列公式计算抑制率，并用Reed-Muench法计算50％毒性浓度为药物半数有毒浓度(TC₅₀)。抑制率＝[(正常组平均OD值－空白组平均OD值)－(给药组平均OD值－空白组平均OD值)]/(正常组平均OD值－空白组平均OD值)×100％。

1.2.3.药物体外抗流感病毒活性试验

以细胞病变抑制法(Cytopathic Effect Reduction Method)研究CapparilosideA(包括提取自北板蓝根和化学合成药物)对不同亚型流感病毒的抑制作用。长满单层的96孔细胞培养板内的MDCK细胞吸附病毒2小时，同时设定阳性药物和细胞对照。(1)治疗模式：细胞吸附病毒2h，加入不同浓度药物(除病毒和细胞对照外)在37℃5％CO₂环境下培养。(2)保护模式：细胞孵育药物2h，加入病毒吸附2h后，换含TPCK胰酶的无血清培养基，在37℃、5％CO₂环境下培养。(3)直接模式：病毒与不同浓度的药物37℃孵育1h后接种于细胞中，置于4℃孵育1h，吸弃上清，换含TPCK的无血清培养基37℃、5％CO₂环境下培养8h。

细胞出现病变程度按以下6级标准记录：-为细胞生长正常，无病变出现；±为细胞病变少于整个单层细胞的10％；+为细胞病变约占整个单层细胞的25％；++为细胞病变约占整个单层细胞的50％；+++为细胞病变约占整个单层细胞的75％：++++为细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。用Reed-Muench法计算半数抑制浓度(IC₅₀)，并以选择指数SI表示(SI＝TC₅₀/IC₅₀),SI>2表示低毒高效；SI：1～2表示高毒低效；SI<1表示无效。

1.3.实验结果

1.3.1细胞毒性

利用MTT法测得受试药物(提取自北板蓝根)的半数有毒浓度(TC₅₀)为11.05mg/mL；受试药物(化学合成药)的半数有毒浓度(TC₅₀)为2.5mg/mL。见表1。

1.3.2药物体外抑制流感病毒药效

结果显示Cappariloside A(提取物)在预防模式和治疗模型下均对甲型流感病毒H1N1(PR8)有抑制作用，而且预防模式下作用最强,直接作用模式下效果不佳；而化学合成药物只是在治疗模式下有抑制流感病毒的药效，在预防模式下无作用。进一步实验结果表明Cappariloside A(由于提取物量较少，所以使用化学合成物完成以下实验)在治疗模型下对多种亚型流感病毒，包括甲型，乙型流感病毒，甲型流感病毒包括人流感病毒和禽流感病毒，均有抑制作用。详见表2。

表1 Cappariloside A(包括提取物和化学合成药物)体外不同作用模式下对流感病毒的药效

注：a：保护模式；b：治疗模式；c：直接模式.NT：表示未检测。M5：Cappariloside A的简称

表2 Cappariloside A体外对不同亚型流感病毒药效作用

注:选择指数(SI)，SI>2表示低毒高效；SI：1～2表示高毒低效；SI<1表示无效。M5：Cappariloside A的简称

试验例2 Cappariloside A在气道上皮细胞中抑制流感病毒介导的炎症反应实验

2.1实验材料

2.1.1药物 受试样品：Cappariloside A，简称M5(为实施例2的化学合成药物)。

2.1.2细胞 人气道上皮细胞(16HBE)和狗肾上皮细胞(MDCK)购自中国科学院上海细胞库。

2.1.3病毒株 普通甲型H1N1流感病毒(A/PR/8/34,H1N1)购自ATCC，以Reed-Muench法测定其感染复数(M.O.I)，以M.O.I＝1作为病毒滴度感染细胞。

2.1.4试剂 DMEM培养基(批号：8114176)；PBS(批号：20150122),胎牛血清(批号：10099)均购自GIBCO公司；TPCK(批号：20140220)购自广州捷倍斯公司。ELISA试剂盒购买自RayBio公司,Cat ELH-IP-10；ELH-CCL-5。Reat-time PCR试剂购买自TaKarRa公司，Cat^#RR390A。RIPA裂解液购自美国sigma公司。NP蛋白一抗购自SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司(sc-80481)。GADPH一抗购自Cell Signalling公司(#2118)。山羊抗兔IgG二抗和山羊抗小鼠IgG二抗购自美国KPL公司。

2.2实验方法

2.2.1 16HBE细胞培养

将正常人气道上皮细胞(16HBE)接种于100mm培养皿内，用10％DMEM高糖培养基，于37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下在细胞孵育箱中进行培养，待细胞生长进入对数增殖期时，收集细胞。对收集的细胞进行计数后，以每孔2×10⁵个/mL的密度接种于直径15.6mm的24孔板细胞培养皿中，24小时后显微镜下观察细胞贴壁、生长良好。换1％DMEM高糖培养基将细胞饥饿培养24小时后进行下一步病毒和药物刺激实验，加刺激物时，将细胞培养基换成不含胎牛血清的培养基。

2.2.2病毒和药物刺激

细胞贴壁24小时后，PBS冲洗2遍，用不含血清的DMEM将甲型流感病毒H1N1(PR8)稀释至M.O.I＝1，每孔加入0.5mL病毒液，37℃贴壁2小时。用不含胎牛血清但是含0.4ug/mLTPCR酶的DMED稀释药物，每孔加入1mL，作用6小时或者24小时后收集细胞上清液和细胞RNA。

2.2.3检测药物对16HBE细胞毒性试验(MTT法)

16HBE细胞以每孔2×10⁵个/mL的密度接种于直径6.94mm的96孔板细胞培养皿中，24小时后显微镜下观察细胞贴壁、生长良好。不含血清的DMEM2倍梯度稀释药物，作用48小时后，MTT法(同上述)检测药物毒性。

2.2.4细胞上清液病毒滴度的测定(细胞病变抑制法：CPE法)

细胞上清液用含1.5ug/mL TPCR酶的MEM进行10倍梯度稀释，加到细胞中，48小时后观察细胞的病变。(方法同上)。

2.2.5细胞培养基中炎症因子蛋白ELISA方法检测

按照ELISA试剂盒产品说明书操作

①、试剂取出平衡至室温，加入样品，室温孵育2.5小时或者4℃过夜；

②、Washing buffer冲洗4次；

③、加入稀释好的biotinylated antibdy100μL室温作用1小时；

④、Washing buffer冲洗5次，加入稀释好的Streptavidin solution100μL,室温作用45分钟；

⑤、加入TMB显色液，室温反应30分钟；加入500μL的Stop Solution终止反应，全波长酶标仪读数(450nm)，根据标准曲线计算出样品中炎症因子蛋白的含量。

2.2.616HBE细胞中RNA的提取

①、在每个孔中加入1mL的Trizol裂解液，然后收集细胞RNA。12000g，4℃的条件下离心10min，取上清于1.5ml的离心管；

②、在上清液中加入200uL氯仿，用手上下震荡，使之充分混匀成乳液状，室温孵育3min。标本12000g，4℃的条件下离心15min，然后小心取出离心管置于冰上，避免摇晃，用吸头慢慢吸取上层澄清液(300uL)，避免吸到中间白色蛋白层,置于一新的离心管中；

③、向管内加入0.5mL异丙醇，混匀，室温孵育10min。再置于离心机内12000g，4℃的条件下离心10min.；

④、弃上清，加入事先配好的75％乙醇(用DEPC水和100％的无水乙醇配)，震荡，置于离心机内7500g，4℃的条件下离心5min。倒掉上层乙醇，并保持离心管处于倒置状态，待乙醇刚好挥发干；

⑤、待乙醇干燥后，加入适量的DEPC水(随提取出来的RNA的量而定)。提供逆转录使用。2.2.7RT-PCR反应

①、使用RNA检测的仪器，依次检测提取好的样品中的RNA的浓度。

②、按照检测结果，将样品稀释至适合的浓度。

③、配好RT-PCR的反应体系，上机。按照之前设计好的程序反应。反应结束后，将CDNA于-80℃保存。

注：RT-PCR反应的条件

37℃ 15min

85℃ 5s

4℃ forever

2.2.8 QPCR反应

①、取出RT产物，探针法检测。

②、配好反应体系，加入反应孔中，然后加入样品，混好，上机反应。

③、QPCR反应的条件

95℃ 30s,

95℃ 5s(40个反应循环)

60℃ 40s.

④、引物序列

IP-10(人)：L：5'-GAAATTATTCCTGCAAGCCAATTT-3'

R：5'-TCACCCTTCTTTTTCAT-TGTAGCA-3'

探针引物：5'-FAM-TCCACGTGTTGAGATCA-3'MGB

MIG(人)：L：5'-TCTTGCTGGTTCTGATTGGAGTG-3'

R：5'-GATAGTCCCTTGGTTGGTGCTG-3'

探针引物：5'-FAM-CAGGAACAGCGACCCTTTCTCACTACTGG-3′BHQ-1

CCL5(人)：L：5'-CAGCAGTCGTCTTTGTCACC-3'

R：5'-GTTGATGTACTCCCGAACCC-3'

探针引物：5'-FAM-CGCCAAGTGTGTGCCAACCC-3′TAMRA

内参(GAPDH)：L：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'

R：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'

探针引物：5′-FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3′TAMRA

2.2.9流感病毒NP蛋白免疫印迹实验

①、RIPA裂解液提取细胞蛋白；

②电泳：100V 10min；150V 50min，或者将溴酚蓝跑至底部；

③、转膜：分离出分离胶，根据目的蛋白片段大小切胶，并剪好PVDF膜和滤纸(大小为滤纸＞PVDF膜＞胶)，用甲醇活化PVDF膜，将活化后的PVDF膜同滤纸一起放入电转液中，按照“海绵—滤纸—凝胶—PDF膜—滤纸—海绵”的顺序放置好，制作“三明治”夹(注意每层之间不能有气泡同时注意电极方向)。将制作好的“三明治”夹放入电转槽中。同时在槽中放入冰袋降温，以防电转时产热过高。转膜条件：300mA，80min；

④、封闭：电转完毕后，将膜取出，作好标记后置于5％牛奶封闭液中，一般常温封闭1小时或4℃过夜；

⑤、一抗孵育：封闭结束后，用2.5％的抗体稀释液将目的蛋白一抗稀释(1:1000)，常温孵育2h或4℃过夜；

⑥、二抗孵育：一抗孵育结束后，用TBST洗液洗膜3次，每次10min，然后加入二抗稀释液(1:3000)，常温孵育1h；TBST洗液洗膜3次，每次10min；

⑦、曝光：按体积1:1配制ECL发光液A和B，使用仪器Tanon-5200曝光。

2.3实验结果

2.3.1药物对16HBE细胞药物毒性

MTT法检测药物作用于16HBE细胞48小时后，4mg/mL浓度对细胞毒性大，2mg/mL对细胞略有毒性，但是1mg/mL浓度以下对16HBE细胞无毒性。见图2A.

2.3.2药物作用24小时后对流感病毒的子代病毒复制的抑制以及抑制流感病毒介导的炎症因子的表达

药物浓度为2mg/mL和1mg/mL作用于16HBE细胞24小时可以抑制流感病毒的子代病毒的复制，浓度为2mg/mL对子代病毒的抑制率接近100％，浓度为1mg/mL时对子代病毒的抑制率接近60％，但是浓度为0.5mg/mL时对子代病毒基本无抑制作用(图2B)。而2mg/mL～0.5mg/mL均能明显抑制炎症因子(如IP-10，MIG，CCL-5等)mRNA和蛋白的产生，在药物浓度为0.5mg/mL时对IP-10蛋白也能减低约30％的表达量，对CCL-5蛋白的表达量也有约50％的减低(和病毒组相比)；而且单纯使用药物(无加病毒刺激)也能降低炎症因子的表达(图2C-图2F)。蛋白免疫印迹结果也显示药物在1mg/mL是能明显的抑制流感病毒的NP蛋白的表达，药物浓度为0.5mg/mL是也能抑制流感病毒的NP蛋白的表达，而药物浓度为0.25mg/mL时抑制流感病毒NP蛋白的药效不明显(图2G)。结果表明检测药物--Cappariloside A能有效的抑制流感病毒以及流感病毒介导的炎症反应。

2.3.3药物作用6小时后对流感病毒介导的炎症因子表达的抑制

药物作用6小时后，在浓度为1mg/mL～0.25mg/mL均能有效的抑制IP-10，MIG和CCL-5的mRNA表达水平，即使是浓度为0.25mg/mL时对IP-10的mRNA水平也有约30％的抑制作用，对MIG mRNA水平也有约40％的抑制作用(和病毒组相比)，但在浓度为0.125mg/mL时对炎症因子的表达无抑制作用，见图3A-图3C。

试验例3 Cappariloside A在巨噬细胞中抑制流感病毒介导的炎症反应实验

3.1实验材料

3.1.1药物 同试验例2

3.1.2细胞 小鼠巨噬细胞(RAW264.7)购自中国科学院上海细胞库。

3.1.3病毒株 普通甲型H1N1流感病毒(A/PR/8/34,H1N1)购自ATCC，以Reed-Muench法测定其感染复数(M.O.I)，以M.O.I＝0.1作为病毒滴度感染细胞。

3.1.4试剂 ELISA试剂盒购买自RayBio公司,Cat ELM-IP-10；ELM-CCL-5，其余同上。

3.2实验方法

3.2.1RAW264.7细胞培养

同2.2.1

3.2.2病毒和药物刺激

同上

3.2.3细胞培养基中炎症因子蛋白ELISA方法检测

同上

3.3实验结果

3.3.1药物对16HBE细胞药物毒性

MTT法检测药物作用于RAW264.7细胞48小时后，2mg/mL浓度对细胞略有毒性，1mg/mL以下对细胞无毒性。见图4A。

3.3.2药物作用24小时后抑制流感病毒介导的炎症因子蛋白的表达

药物浓度为2mg/mL和1mg/mL作用于RAW264.7细胞24小时均能明显抑制流感病毒子代病毒的复制，抑制率大于80％，而药物浓度为0.5mg/mL时对流感病毒子代病毒无抑制作用(图4B、图4C)。同时，药物浓度为1mg/mL和0.5mg/mL均能明显的抑制炎症因子(如IP-10，CCL-5等)蛋白的产生，药物浓度为1mg/mL时对IP-10和CCL-5的蛋白抑制率接近1倍，药物浓度为0.5mg/mL时对IP-10和CCL-5蛋白表达量的也有明显的抑制作用，(和病毒组相比)；而且单纯使用药物(无加病毒刺激)也能降低炎症因子的表达(和正常组相比)，同时也能抑制它们的mRNA的表达水平。但是当药物浓度为0.25mg/mL和0.125mg/mL时对流感病毒介导的炎症反应无抑制作用(图4D、图4E、图4F)。结果表明在巨噬细胞中，待检测药物--Cappariloside A，简称M5，在高浓度(2mg/mL～1mg/mL)是能同时抑制流感病毒子代病毒的复制和抑制流感病毒介导的炎症反应；在低浓度(0.5mg/mL)时能有效的抑制流感病毒介导的炎症反应。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.Cappariloside A作为唯一活性成分在制备用于治疗流感的药物中的应用，其特征在于，所述药物为具有抑制流感病毒介导的炎症因子产生的作用的药物，所述炎症因子选自IP-10、MIG、CCL-5或CCL-5/RANTES；所述流感病毒为普通甲型H1N1流感病毒A/PR/8/34、甲型H3N2流感病毒Aichi株、新甲型H1N1流感病毒株或乙型流感病毒。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Cappariloside A在制备具有抑制流感病毒的子代病毒复制的作用和/或具有抑制流感病毒介导的炎症因子产生的作用的药物中应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Cappariloside A为从天然植物提取或化学合成的。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述天然植物选自板蓝根、维药刺山柑中的一种或两种。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物制成药学上允许的剂型，所述剂型为片剂或胶囊。