CN104805030B - 产高活性动物蛋白水解酶的菌株及其应用 - Google Patents
产高活性动物蛋白水解酶的菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株产高活性动物蛋白水解酶的菌株及其应用，具体地，本发明提供了一株产动物蛋白水解酶的地衣芽孢杆菌，所述菌株表达活性高、适用面广的动物蛋白水解酶。本发明的地衣芽孢杆菌可高效、低成本地生产动物蛋白水解酶，具有很高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体地，本发明涉及一种产高活性动物蛋白水解酶的菌株及其应用。
背景技术
我国是一个动物蛋白生产大国，屠宰畜禽的同时会产生大量的动物血、内脏、羽毛等副产物，这些巨大的动物蛋白副产资源如不能合理利用，不仅会引起环境污染，还会造成严重的资源浪费。
这些动物蛋白中蛋白质含量较高，含多种功能性成分，且氨基酸种类均衡，微量元素丰富。由于蛋白质组成的特殊性，有些蛋白存在消化吸收率不高、功能性丧失等情况，故需通过高水准的深加工技术以提高动物的消化吸收率或充分发挥其功能性成分。
酶解法是目前处理动物蛋白的主要方法之一。但通常动物蛋白酶的价格较高，产品不稳定，直接导致后续的产品质量不稳定。此外，目前现有的动物蛋白酶的性能尚不能令人满意，主要表现能够水解的动物蛋白的种类不广，对蛋白裂解的效率不够高。
因此，本领域迫切需要开发可适用于多种动物蛋白原料且蛋白裂解效率高的新型动物蛋白酶、制剂及相应的技术。
发明内容
本发明的目的就是提供一种可适用于多种动物蛋白原料且蛋白裂解效率高的新型动物蛋白酶、制剂及相应的技术。
在本发明的第一方面，提供了一种产动物蛋白水解酶的菌株，所述菌株为表达动物蛋白水解酶的地衣芽孢杆菌，并且所述的动物蛋白水解酶可酶解选自下组的动物蛋白：血红蛋白、羽毛蛋白、猪肺蛋白、或其组合。
在另一优选例中，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.7287。
在另一优选例，所述动物蛋白水解酶可酶解血红蛋白、羽毛蛋白和猪肺蛋白。
在另一优选例，在以下测定条件下，经所述的动物蛋白水解酶酶解后，酶解产物中小肽的含量≥80%，较佳地≥85%，更佳地≥90%，按酶解产物的干重计：
pH8.5-10(较佳地pH9.0-9.5)，动物蛋白底物浓度10-12%，酶添加量为800-1200U/g底物，温度50-55℃，和酶解时间8-12小时。
在另一优选例，所述的小肽指出分子量≤1000Da的肽。
在另一优选例中，用于生产动物蛋白水解酶或用于制备降解动物蛋白的制剂。
在另一优选例中，所述的制剂为酶制剂或活菌制剂。
在本发明的第二方面，提供了一种生产动物蛋白水解酶的方法，所述的方法包括步骤：
(1)用本发明第一方面提供的菌株进行发酵，得到含动物蛋白水解酶的发酵液；和
(2)从发酵液中分离所述的动物蛋白水解酶。
在另一优选例中，步骤(1)中所述发酵在以下条件下进行：
发酵培养基的碳氮比(以碳源和有机氮源的质量计)为1:1至5:2，优选培养基碳氮比为2:1。
在另一优选例中，所述的培养基碳源选自：淀粉(优选可溶性)、蔗糖、乳糖、麦芽糊精、葡萄糖及其组合。
在另一优选例中，所述碳源为葡萄糖。
在另一优选例中，所述的培养基的氮源选自：牛骨胨、生物氮素、植物蛋白胨、肉蛋白胨、大豆蛋白胨及其组合。
在另一优选例中，所述氮源为大豆蛋白。
在另一优选例，在步骤(1)中的发酵条件包括：
所述碳源的添加量为0.1-3.0wt%，基于培养基总重量计。
所用的氮源添加量为0.1-3.0wt%，基于培养基总重量计；
所述的碳氮比为2:1。
在另一优选例中，所述的发酵液是含菌体的发酵液。
在另一优选例中，所述发酵液是通过包括以下步骤的方法制备：
将所述菌株接种至培养基进行培养，得到种子液；
将所述种子液接种入发酵罐，形成发酵体系；和
对所述发酵体系进行培养，得到发酵后的发酵液。
在另一优选例中，在发酵培养时，在以下条件下培养：培养温度37±3℃，发酵起始pH6.5-8.0(较佳地7.2±0.3)；和/或
在培养或发酵时，当碳氮比为1：1-4：1，较佳地碳氮比为(1.5-2.5):1。
在本发明的第三方面，提供了一种对动物蛋白进行水解的方法，所述方法包括步骤：
在本发明的第一方面所述菌株的存在下，和/或在本发明的第一方面所述菌株产生的动物蛋白水解酶的存在下，对动物蛋白进行水解，从而形成水解产物。
在另一优选例中，所述水解在pH8.0-10条件下进行。
在另一优选例中，所述动物蛋白包括血红蛋白、羽毛蛋白、猪肺蛋白或其组合。
在另一优选例中，所述的酶解条件为底物浓度为5%-20%(以干物质计)，酶添加量为200-1500U/g(以干物质计)，温度为37℃-60℃，时间为6h-12h，pH为7.0-11.0。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明的菌株的形态，其中所述菌种为地衣芽孢杆菌，其细胞形态和排列呈杆状、单生，菌落扁平，边缘不整齐，革兰氏阳性菌。
图2显示了不同碳源对产酶的影响。
图3显示了不同氮源对产酶的影响。
图4显示了不同碳氮比对产酶的影响。
图5显示了不同初始pH对产酶的影响。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，首次从环境(含动物蛋白的污水与污泥)中筛选到一株对动物蛋白具有优良降解效果的菌株，并经过进一步诱变处理，最终筛选到一株对动物蛋白有优异降解效果的地衣芽孢杆菌，该菌株并命名为地衣芽孢杆菌Z5。性能测试表明，该地衣芽孢杆菌Z5的遗传稳定性好，产酶量高，安全性高，产品稳定，制备工艺简便。对于多种常见的动物蛋白原料的测试表明，经本发明菌株所产的动物蛋白酶降解后，小肽含量可高达90%以上，具有极高的应用价值。本发明可有助利用动物蛋白生产功能性蛋白肽。在此基础上完成了本发明。
菌株
如本文所用，术语“本发明菌株”、“本发明地衣芽孢杆菌Z5”、“本发明工程菌”、“本发明的保藏菌株”可互换使用，指保藏于CGMCC的保藏号为CGMCC No.7287菌株或由该菌株得到的衍生菌株，其中包括经传代培养得到的菌株。
本发明菌株是如下获得的：
(a)对从可能存在动物蛋白酶菌株的环境(如含动物蛋白的生产污泥与污水)取一定量的样本，于富集培养基中进行富集，然后对富集液进行稀释，通过涂布进行分离，得到各种不同的单菌落。
(b)对获得的各种单菌落进行初筛，得到酶活性较高的菌株。
(c)对初筛所获得的菌株，进一步制备其发酵产物，制得粗酶液后，测定酶活，进一步选取酶活性高的菌株。
(d)对于步骤(c)中选出的菌株，进一步进行诱变处理，并测定诱变处理后菌株的酶活性，最终确定诱变后酶活性效果优异的菌株，作为工程菌。
在本发明中，经过上述方法，成功地筛选到一株动物蛋白酶活性优异的菌株，即本发明的地衣芽孢杆菌Z5。
对本发明的所述地衣芽孢杆菌Z5进行的研究表明，
本发明菌株为地衣芽孢杆菌。如图1所示，其细胞形态和排列呈杆状、单生，菌落扁平，边缘不整齐，属于革兰氏阳性菌。
对该地衣芽孢杆菌的特性进行的研究表明，该菌株的一些主要特性如下：
最适培养温度37±3℃，发酵起始pH6.5-8.0(较佳地7.2±0.3)，碳源和氮源无特别偏好，其中葡萄糖为优选的碳源,大豆蛋白胨为优选的氮源。
此外，在培养或发酵时，当碳氮比为1：1-4：1时，所得到的动物蛋白酶的酶活较高，尤其是当碳氮比为(1.5-2.5):1时，酶活最高。
对于所制备的本发明动物蛋白酶，其合适酶解pH为7-11，酶解温度为37℃-60℃。
用于培养本发明菌株的培养基中的营养源没有特别的限制。本领域技术人员可以根据公知的技术来选择合适的碳源、氮源和其他营养源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、肌醇、甘露醇等。氮源可以是胨、大豆蛋白胨、大豆粉、黄豆饼粉、肉膏、蛋白粉、麦皮、米糖、酵母粉、玉米浆、铵盐以及其他有机物或无机含氮化合物。另外，培养基中还可适当加入一些无机盐类，如氯化钠、磷酸盐(如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等)、硫酸锰、硫酸铵、硫酸镁、碳酸钙等金属盐。通常可采用各种已知的常规培养基，如LB琼脂培养基、营养琼脂培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基和牛肉浸汁琼脂培养基等对本发明菌株进行斜面固体培养并4℃环境下进行初步保藏。
对于本发明菌株而言，可以选用本领域常用的培养基进行培养。在具体实施方案中，一些代表性的培养基包括(但并不限于)：
(1)富集培养基(g/L)：葡萄糖8.0，氯化钠3.0，血红蛋白10，pH7.2。
(2)酪蛋白琼脂培养基(g/L)：酪蛋白10.0，牛肉浸粉3.0，氯化钠5.0，磷酸氢二钾2.0，琼脂15.0，溴百里香芬兰0.05，pH7.2。
(3)种子培养基(g/L)：葡萄糖6.0，蛋白胨5.0，酵母膏5.0，氯化钠5.0，pH7.2。
(4)初始发酵培养基(g/L)：葡萄糖5.0，大豆蛋白胨10.0，尿素3.0，氯化钠2.0，磷酸二氢钾1.0，pH7.2。
然而，本领域技术人员应当理解，本发明并不局限于本文中列举的这些具体培养基配方。
培养本发明中的菌株的温度、pH、气液比、罐压、转速等条件没有特别严格的限制，只要该条件适合该菌的生长即可。
在一些较佳的实施方案中，pH宜控制在6.5～8.0之间，培养温度宜在25～40℃之间。
应理解，本发明的发酵可以是连续发酵，也可以是间歇式发酵。
动物蛋白酶的制备和制剂
在本发明中，还提供了基于本发明菌株的动物蛋白酶，以及含有所述动物蛋白酶的制剂。
本发明的动物蛋白酶是一种复合的蛋白酶，因此可以非常有效地、协同地发挥酶解作用，从而有效地、广泛地酶解各种不同的动物蛋白。当然，应理解，本发明的动物蛋白酶也可用于酶解非动物蛋白，包括植物蛋白、真菌蛋白、重组蛋白等。
在本发明中，一种优选的动物蛋白酶制剂是本发明菌株的粗酶制剂，即将本发明菌株的发酵产物经离心去除固体杂质(包括菌体)后，所获得的溶液。该粗酶溶液可以直接作为酶制剂使用，也可进一步经后续处理(如冻干处理)后获得固态形式的酶制剂。
在本发明酶制剂中，可任选地添加有利于保持酶活性的物质，如稳定剂等。
对动物蛋白进行水解的方法(应用)
本发明还提供一种对动物蛋白进行水解(或酶解)的方法，该方法包括在本发明菌株所产生的动物蛋白酶存在下，对动物蛋白原料进行酶解处理(如保温一段时间)，从而将动物蛋白酶解为小肽。
通常，本发明的酶解反应可在合适的酶解温度(如37℃-60℃)、pH(如pH8.0-10，较佳地pH8.5-9.5)进行。
在本发明中，酶解时酶用量没有特别限制，通常为100-10000U/g蛋白(底物)，较佳地为500-5000U/g蛋白。
在本发明中，酶解时间没有特别限制，可以为1小时至数天、甚至数周。通常，酶解时间为2-72小时，较佳地4-36小时。
在本发明中，动物蛋白原料没有特别限制，可以是任何含动物蛋白的原料，如动物血、内脏、羽毛等副产物。通常，在本发明中，酶解反应时，底物(动物蛋白)的浓度为0.5-30wt%，较佳地1-20wt%，更佳地2-15wt%。
典型地，在本发明中，酶解反应时，底物浓度为5%-20%(以干物质计)，酶添加量为200U-1500U/g(以干物质计)，温度为37℃-60℃，时间为6h-12h，pH为7.0-11.0。
菌种保藏
本发明的上述菌种已于2013年3月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCCNo.7287，名称为：地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)Z5。
本发明的主要优点包括：
1、产酶活性高、酶解效果好。
2、获得的菌株稳定性好。
3、生产成本低，安全性高。
本发明的菌株和酶制剂有助于将我国大量的废弃动物蛋白转变为优质蛋白肽产品，对缓解国内动物蛋白资源缺乏现状具有重大意义和应用价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用实验方法和材料：
材料
1.培养基：
(1)富集培养基(g/L)：葡萄糖,8.0，氯化钠3.0，血红蛋白10，pH7.2。
(2)酪蛋白琼脂培养基(g/L)：酪蛋白10.0，牛肉浸粉3.0，氯化钠5.0，磷酸氢二钾2.0，琼脂15.0，溴百里香芬兰0.05，pH7.2。
(3)种子培养基(g/L)：葡萄糖6.0，蛋白胨5.0，酵母膏5.0，氯化钠5.0，pH7.2。
(4)初始发酵培养基(g/L)：葡萄糖5.0，大豆蛋白胨10.0，尿素3.00，氯化钠2.0，磷酸二氢钾1.0，pH7.2。
紫外分光光度法测蛋白酶酶活测定
1、原理
蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下(pH7.2和40℃)，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/mL)表示。
2、试剂和溶液
2.1三氯乙酸(CCl3-COOH)，浓度=0.4mol/L
称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。
2.2氢氧化钠溶液(NaOH)，浓度=0.5mol/L
按GB601配制。
2.3盐酸溶液(HCl)，浓度＝1mol/L及0.1mol/L
1mol/L HCl:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
0.1mol/L HCl：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
2.4缓冲溶液
磷酸缓冲液(pH＝7.2)
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·12H2O)0.5g，加水溶解并定容至1000mL。用pH计校正。
2.510g/L酪素溶液
称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。
2.6100ug/mL L-酪氨酸标准溶液
a、称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
b、吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100ug/mL L-酪氨酸标准溶液。
3、仪器和设备
3.1恒温水浴40±0.2℃。
3.2紫外分光光度计，符合GB9721的规定。
4、分析步骤
4.1求K值
按下表配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度(A)，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点),根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(μg)，即为吸光常数K值;(其K值应在(130～135)范围内)。
4.2测定
吸取适量稀释的酶液1.00mL、酪素5.00mL、三氯乙酸5.00mL，其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿，测定其吸光度(A)。
a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min；
b、按下列程序操作：
c、标准曲线作同样处理。
5、计算
在40℃下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。
X＝A×K×11/1×1/10×n×E＝1.1×A×K×n×E
式中：X——样品的酶活力，(u/mL)；
A——试样溶液的平均吸光度；
K——吸光常数；
11——反应试剂的总体积，mL；
1——吸取酶液1.00mL；
1/10——反应时间10min，以1min计；
n——稀释倍数
E——紫外法与福林法的换算系数(中性、碱性蛋白酶系数为0.50；酸性蛋白酶系数为0.77)。
所得结果表示至整数。
6结果的允许差
平行试验测定值之差不得超过3%。
实施例1
菌株的筛选和诱变
1.1.菌株的富集分离
取一定量车间生产污水(1-10ml)，加入到含有50mL富集培养基的250ml三角瓶中，37℃、180r/min振荡培养7-10天，观察培养基颜色变化。
对富集培养液进行梯度稀释，将稀释度为10-5、10-6及10-7的稀释液分别涂布于酪蛋白琼脂平板上，挑取周边有透明圈的菌株于酪蛋白平板上进行分离纯化以得到单菌落。
1.2.酪蛋白平板的初筛
将上述单菌落点种于酪蛋白琼脂平板上，比较各菌透明圈的大小，选取水解圈直径与菌落直径比值较大的菌株进行试管保存备用。
1.3.酶活复筛
将保存菌株以6%的接种量接种于装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，180r/min、36℃振荡培养72h，8000r/min离心10min去除菌体，粗酶液采用紫外分光光度法进行酶活测定。
1.4.菌株的紫外诱变
调整对数期菌液的浓度为105左右，吸取2ml的菌悬液于9cm的培养皿里置距紫外灯30cm的磁力搅拌器上，照射时间为20-360s，稀释涂布后用黑布包裹置培养箱中培养，并与未照射的菌种做对照。
选取透明圈较大的进行酶活复筛，最终确定诱变效果较好的菌株，选取诱变效果最好的进行培养基的优化。
经过多轮筛选，成功筛选到一株动物蛋白酶活性优异的菌株，命名为地衣芽孢杆菌Z5。
实施例2
发酵条件的优化
在本实施例中，对实施例1中所获得的地衣芽孢杆菌Z5，进行培养基成分的优化试验。
2.1.不同碳源对产酶的影响
分别采用麦芽糊精、乳糖、蔗糖和可溶性淀粉作碳源，添加量为0.5%，并与葡萄糖对照，其余成分和条件与初始发酵培养基相同。考察不同碳源对产酶的影响。
结果如图2所示。其中，葡萄糖对菌株产酶效果较好(酶活可达3940U/mL)，选取葡萄糖为发酵培养基的碳源。
2.2.不同氮源对产酶的影响
在0.5%的葡萄糖的基础上，添加1%的生物氮素、牛骨胨、肉蛋白胨和植物蛋白胨，并与大豆蛋白胨对照，其余成分和条件与初始发酵培养基相同，考察不同氮源对产酶的影响。
结果如图3所示。其中，该菌利用大豆蛋白胨的产酶效果较好(酶活可达4050U/mL)，选用大豆蛋白胨作为进一步优化的氮源。
2.3.不同碳氮比对产酶的影响
在碳源葡萄糖、氮源大豆蛋白胨的基础上，保持大豆蛋白胨的量不变，调整二者之间的比例，碳氮比(以碳源和有机氮源的质量计)按1:1、1.5:1、2:1和2.5:1设置，并与原培养基对照，其余成分和条件与初始发酵培养基相同，考察不同碳氮比对产酶的影响。
结果如图4所示。其中，碳氮比对该菌的产酶影响最为显著，提高葡萄糖的量，酶活快速增加。
当碳氮比为1.5-2.5:1时，酶活很高。其中当碳氮比为2:1时，酶活最高，此时达到13680U/mL，继续提高碳氮比，酶活有所下降。
2.4.不同初始pH值对产酶的影响
在碳源葡萄糖、氮源大豆蛋白胨以及碳氮比2：1保持不变的基础上，采用该条件优化后的培养基成分(初始pH在pH5-9范围内)，观测初始pH值对产酶的影响。
结果如图5所示。其中，pH中性时酶活最高值最高、产酶效果最好，酸性或碱性的初始pH对菌株产酶有一定影响。
2.5.碳氮源同步提高对产酶的影响
在碳源葡萄糖、氮源大豆蛋白胨以及碳氮比2：1保持不变的基础上，考察同步提高碳氮源含量对产酶的影响，结果显示当培养基组成为，发酵培养基(g/L)：葡萄糖22.0，大豆蛋白胨7.0，酵母浸粉4.0，NaCl3.0，KH2PO40.4，K2HPO40.6,NH4Cl3.0,pH7.2。
发酵粗酶液酶活最高活性为8610U/mL(碱性条件下检测为15360U/mL)。
实施例3
酶制剂的制备
在实施例2所获得的最佳碳、氮源及碳氮比的基础上，进行发酵试验，其中发酵条件为36℃，摇床培养80h，将所得发酵液离心去菌体后得到的粗酶液通过冷冻干燥制备酶粉制剂。
冷冻干燥后，酶粉制剂活性在22万U/g(碱性条件检测为44万)以上(其中，冻干后的含酶物质(干物质)占发酵液重量的约1.8%左右)。
实施例4
动物蛋白水解酶活性测定
在本实施例中，将所得发酵液离心去菌体后得到的粗酶液(实施例3制备)用作酶制剂,进行动物蛋白的酶解试验。
1.对血红蛋白的酶解，条件如下：底物浓度为10%，酶添加量为800U/g，温度为50℃，时间为10h，pH为9.0；
2.对羽毛蛋白的酶解，条件如下：底物浓度为12%，酶添加量为1000U/g，温度为55℃，时间为8h，pH为9.5；
3.对猪肺蛋白的酶解，条件如下：底物浓度为10%，酶添加量为1200U/g，温度为50℃，时间为12h，pH为9.0；
同时，对于三种不同的动物蛋白原料，还用一种市售的蛋白酶(2709碱性蛋白酶)作为对照，在厂家建议的条件下进行酶解反应。
测试结果如下表所示：
表1.本发明蛋白酶与市售蛋白酶的酶解活性比较(按酶解后，产物中小肽含量计算)
| 底物种类 | 2709碱性蛋白酶① | 本发明酶(Z5蛋白酶) |
| 血红蛋白 | 68.6% | 92.3% |
| 羽毛蛋白 | 37.8% | 89.3% |
| 猪肺蛋白 | 40.8% | 91.1% |
注：
①酶解条件为厂家推荐酶解条件：2709碱性蛋白酶，40-50℃、pH9-12。
②所述的小肽指出分子量≤1000Da的肽。
菌种保藏
本发明的上述菌种已于2013年3月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCCNo.7287，名称为：地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)Z5。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (17)
1.一种产动物蛋白水解酶的菌株，其特征在于，所述菌株为表达动物蛋白水解酶的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），所述菌株的保藏号为CGMCC NO.7287。
2.如权利要求1所述的菌株的用途，其特征在于，用于生产动物蛋白水解酶或用于制备降解动物蛋白的制剂。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的制剂为酶制剂或活菌制剂。
4.一种生产动物蛋白水解酶的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1) 用权利要求1所述的菌株进行发酵，得到含动物蛋白水解酶的发酵液；和
(2) 从发酵液中分离所述的动物蛋白水解酶。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述发酵在以下条件下进行：
发酵培养基中碳源和有机氮源的质量比为1:1至5:2。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵培养基中碳源和有机氮源的质量比为2:1。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的培养基碳源选自：淀粉、蔗糖、乳糖、麦芽糊精、葡萄糖及其组合。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述淀粉为可溶性淀粉。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的培养基的氮源选自：牛骨胨、生物氮素、植物蛋白胨、肉蛋白胨、大豆蛋白胨及其组合。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述氮源为大豆蛋白胨。
12.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中的发酵条件包括：
所述碳源的添加量为0.1-3.0wt%，基于培养基总重量计；
所用的有机氮源添加量为0.1-3.0 wt%，基于培养基总重量计；
所述的碳氮比为2:1。
13.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的发酵液是含菌体的发酵液。
14.如权利要求4-13中的任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵液是通过包括以下步骤的方法制备：
将所述菌株接种至培养基进行培养，得到种子液；
将所述种子液接种入发酵罐，形成发酵体系；和
对所述发酵体系进行培养，得到发酵后的发酵液。
15.一种对动物蛋白进行水解的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
在权利要求1所述菌株的存在下，和/或在权利要求1所述菌株产生的动物蛋白水解酶的存在下，对动物蛋白进行水解，从而形成水解产物。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述水解在pH 8.0-10条件下进行。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述动物蛋白选自下组：血红蛋白、羽毛蛋白、猪肺蛋白或其组合。
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| 碱性蛋白酶高产菌株的选育与酶学性质研究;王建华;《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》;20050831(第8（2005）期);摘要、第21-22页第3.1.2.6节、第26页图3-4、第26页表3-6、第27页表3-7、第29页表3-10、第38页第2段 * |
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