CN104655616A - 用于检测肿瘤标志物muc1的电化学发光适配体传感器的制备方法及其应用 - Google Patents
用于检测肿瘤标志物muc1的电化学发光适配体传感器的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法及其应用,特点是包括磁性氧化石墨烯合成步骤;将电化学发光体和适配体同时标记到磁性氧化石墨烯材料表面形成多功能化氧化石墨烯材料的步骤;最后取5~10μL多功能化氧化石墨烯材料溶液滴涂于磁性玻碳电极表面得到用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的步骤;利用该电化学发光适配体传感器并根据电化学发光强度值与肿瘤标志物MUC1溶液浓度之间的定量关系可确定待测样品中肿瘤标志物MUC1的浓度,优点是检测方法简单、快速,检测结果灵敏、准确、特异性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学发光适配体传感器,尤其是涉及一种用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法及其应用。
背景技术
近年来全球癌症发病状况日趋严重,死于恶性肿瘤的患者逐年增多,能够实现对肿瘤的早期诊断和治疗是降低死亡率的关键,目前癌症的临床诊断主要通过监测人体内肿瘤标志物的含量实现。肿瘤标志物是指在肿瘤发生和增殖过程中,由肿瘤细胞本身产生或者由宿主对体内肿瘤反应而产生的一类生化物质,包括肿瘤相关蛋白类标志物、激素类标志物、酶类标志物、基因类标志物和胚胎抗原等,可在肿瘤组织、血液、体液或***物中检测出来。
MUC1又名多态性上皮粘蛋白,是一种广泛分布于机体各种粘膜表面的高分子量糖蛋白。正常情况下MUC1主要表达于多种器官、组织上皮细胞的细胞膜胞膜顶端,呈顶端分布或极性分布,但在多种肿瘤细胞中,MUC1的表达出现量和质的改变,并与肿瘤的浸润、转移及预后相关,是一种非常有价值的肿瘤标志物。因此,简单、快速、准确地检测肿瘤标志物MUC1,对多种癌症的早期诊断及预后判断具有重要意义。
目前,检测肿瘤标志物MUC1的方法主要有放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶联免疫分析法和电化学免疫分析法等,这些方法都是基于抗原—抗体特异性结合反应,灵敏度高、特异性强,但也存在一个共同的不足之处,即抗体难以获得、成本高、稳定性差,除此之外,上述方法或具有放射性危害、或操作过程繁琐、或检测成本偏高。因此,开发灵敏度高、特异性强、简单价廉于一体的分析方法,实现肿瘤标志物MUC1的快速检测,仍是当前的迫切需求。
核酸适配体是通过指数富集配体***进化技术(SELEX)筛选出的、可通过折叠形成特定空间结构与靶分子特异性结合的人工单链DNA或RNA序列,具有高特异性、高亲和性,被喻为“化学抗体”。作为分子识别体系,与抗体相比,核酸适配体的优越性是显著的:①抗体必须使用动物或者细胞系产生分子,而核酸适配体通过体外方法合成与分离;②核酸适配体容易并且可重复合成,批次间的差异小,易于保存,稳定性、亲和性和特异性均优于抗体;③核酸适配体对温度有高度的稳定性,而抗体是大蛋白分子,对温度敏感,会产生不可逆的变性。因此,核酸适配体在生物传感与分析分离、核酸功能研究、核酸自组装材料及器件、疾病诊断与治疗等研究领域,展现出广阔的应用前景。
电化学发光(ECL)是对浸入含电化学发光物质的体系的电极施加一定电压或者电流而产生的化学发光现象,综合了电化学和化学发光的优点,是一种灵敏度高、可视性强、仪器简单、可控性强、稳定性好、重现性好的分析方法。目前,国内外还没有公开任何关于基于磁性氧化石墨烯、电化学发光体和对肿瘤标志物MUC1具有特异性识别能力的核酸适配体的用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法及其应用方面的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种组装过程简单,操作方法简便,检测结果灵敏和准确性高、特异性强的用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)多功能化氧化石墨烯材料的合成
a. 磁性氧化石墨烯的合成:在洁净的三颈烧瓶中加入30~50 mL 1 mg/mL的氧化石墨烯(GO),超声1 h;然后在氮气氛保护下加入20~30 mL 0.05~0.07 mol/L的氯化亚铁溶液和20~30 mL 0.10~0.15 mol/L的氯化高铁溶液,于70~90℃搅拌回流,同时缓慢滴加10~15 mL 20%~30%的氨水至溶液的pH = 10~11,回流处理3~5 h;冷却后,用二次水洗涤至溶液的pH = 7,定容到50 mL,即得磁性氧化石墨烯材料溶液,4 ℃储存备用;
b. 取步骤(a)中所得的磁性氧化石墨烯材料溶液200 μL于玻璃瓶中,超声1 h,然后加入200~400 μL偶联试剂,混合均匀,同时滴加稀盐酸溶液至溶液pH = 4~6,振荡孵育1 h,二次水洗涤3次;再加入30~50 μL 0.001~0.1 mol/L的电化学发光体溶液和30~50 μL 10~20 μmol/L的适配体溶液,混合均匀,然后滴加氢氧化钠溶液至溶液pH = 8~10,振荡孵育4 h,二次水洗涤3次;加入质量百分浓度为1~2%的牛血清白蛋白溶液100~200 μL,4℃下浸泡1 h,以封闭电极表面的非特异性活性位点,二次水洗涤3次,定容至200 μL,即可得到适配体和电化学发光体同时标记的多功能化氧化石墨烯材料溶液,4 ℃下储存备用;
(2)电化学发光适配体传感器的组装
将直径为3~5 mm的磁性玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm和0.05 μm的三氧化二铝浆抛光打磨,然后在乙醇和二次水中分别超声2 min,氮气吹干;取5~10 μL步骤(1)中制备的多功能化氧化石墨烯材料溶液,滴涂到上述预处理过的磁性玻碳电极表面,多功能化氧化石墨烯材料即被均匀、牢固地吸附到电极表面,即得电化学发光适配体传感器。
所述的电化学发光体溶液中溶质为鲁米诺或N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺,溶剂为0.1mol/L氢氧化钠溶液。
所述的偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中得到,所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔浓度为10~100 mmol/L,所述的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)摩尔浓度为1~10 mmol/L。
所述的适配体为氨基修饰的DNA片段,碱基序列为:5′-NH2-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3′。
利用上述电化学发光适配体传感器检测肿瘤标志物MUC1的方法,具体步骤如下:
将上述制备的用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器浸泡在不同浓度的肿瘤标志物MUC1溶液中,37℃下温育1 h,然后使用二次水轻轻洗涤后作为工作电极;使用铂丝电极作为对电极,Ag/AgCl电极或饱和甘汞电极作为参比电极,构成三电极体系;将三电极体系置于缓冲溶液中,启动电化学反应,测量体系的电化学发光强度值;获得一系列不同浓度的肿瘤标志物MUC1溶液对应的电化学发光强度值,建立电化学发光强度值与肿瘤标志物MUC1浓度之间的定量关系;根据这个定量关系可以检测待测样品中肿瘤标志物MUC1的浓度。
所述的缓冲溶液为含有1~3 mmol/L H2O2的0.05 mol/L pH = 9~11 的Na2CO3-NaHCO3体系缓冲溶液。
电化学反应的条件如下:电位阶跃计时电流法;脉冲宽度:0.25秒;脉冲间隔:30秒;初始电压:0 V;脉冲电压:1 V。
发明原理:多功能化氧化石墨烯材料是在氧化石墨烯上同时修饰有四氧化三铁纳米磁珠、适配体和电化学发光体的复合材料,具有多种功能:(1)氧化石墨烯具有比表面积大、表面官能团多和生物相容性好等优点,因此可以负载大量的四氧化三铁纳米磁珠、适配体和电化学发光体;(2)四氧化三铁纳米磁珠不仅具有超强的磁性,使多功能化氧化石墨烯材料均匀、牢固地吸附到电极表面,实现电化学发光适配体传感器的一步组装,简化传感器的制备方法,同时还具有优良的导电性,增强多功能化氧化石墨烯材料的导电性,促进电极表面的电子传递过程;(3)适配体对肿瘤标志物MUC1具有特异性的识别能力,可以特异性地识别并捕获溶液中的肿瘤标志物MUC1;(4)电化学发光体在电化学反应中可产生强而稳定的电化学发光信号。
本发明将多功能化氧化石墨烯材料滴涂到磁性玻碳电极表面后即可成功构建检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器,该传感器在电化学信号激发下,会产生强而稳定的电化学发光;如果待测样品中含有肿瘤标志物MUC1,MUC1就会被电化学发光适配体传感器中的适配体捕获,由于MUC1是一种高分子量的蛋白质,因此附着在电极表面会极大阻碍电极表面的电子传递和光的传输过程,致使电化学发光强度降低;肿瘤标志物MUC1的浓度越大,电化学发光强度值越低,电化学发光强度值与肿瘤标志物MUC1的浓度对数之间呈线性关系,据此可实现待测样品中肿瘤标志物MUC1的定量检测。基于多功能化氧化石墨烯材料检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备流程和检测原理图如图1所示。
与现有技术相比,本发明的优点在于
(1)灵敏度高。本发明制备的电化学发光适配体传感器检测肿瘤标志物MUC1的检测限达到0.001 U/mL,而现有检测方法的检测限一般为0.01~200 U /mL。原因在于:电化学发光技术本身具有高灵敏度,本传感器具有独特的结构设计进一步提高灵敏度。
(2)特异性强。常见的其他肿瘤标志物对本检测体系均无干扰。原因在于:本发明是基于对肿瘤标志物MUC1具有特异性识别能力的适配体与肿瘤标志物MUC1之间的高特异性结合能力而构建的电化学发光适配体传感器,除MUC1外的其它肿瘤标志物都不是适配体的靶标物质,因此待测样品中的其他肿瘤标志物都不能被电化学发光适配体传感器上的适配体捕获,故对检测体系无干扰。
(3)检测结果准确。检测实际样品的加标回收率> 96%。
(4)传感器组装过程简单,检测过程快速。将多功能化氧化石墨烯材料滴涂到磁性玻碳电极表面,通过此一步操作即可成功构建本方法的电化学发光适配体传感器,组装过程极其简单;将组装好的电化学发光适配体传感器与待测样品溶液孵育完成后,即可进行电化学发光检测获得相应的电化学发光信号值,根据线性方程即可实现目标物的定量检测。
综上所述,本发明通过一步组装过程成功构建了一种基于多功能化氧化石墨烯材料检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器,该传感器兼具适配体分析的高特异性和电化学发光技术的高灵敏度,具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、成本低廉等优点,可实现对超低浓度肿瘤标志物MUC1的检测,具有良好的应用前景。
附图说明
图1为基于多功能化氧化石墨烯材料检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备流程和检测原理图;
图2为多功能化氧化石墨烯材料的制备流程图;
图3为检测不同浓度MUC1的电化学发光信号强度值(y)—浓度(x)对数的线性图;
图4为本发明用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的选择性图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
一种用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)多功能化氧化石墨烯材料的合成,其制备流程如图1所示
a. 磁性氧化石墨烯的合成:在洁净的三颈烧瓶中加入40 mL 1 mg/mL的氧化石墨烯(GO),超声1 h(超声波处理1 h,一般使用的功率200W左右);然后在氮气氛保护下加入25 mL 0.06 mol/L的氯化亚铁溶液和25 mL 0.12 mol/L的氯化高铁溶液,于80℃搅拌回流,同时缓慢滴加12 mL 25%的氨水至溶液的pH = 10.5,回流处理4 h;冷却后,用二次水洗涤至溶液的pH = 7,定容到50 mL,即得磁性氧化石墨烯材料溶液,4 ℃储存备用;
b. 取步骤(a)中所得的磁性氧化石墨烯材料溶液200 μL于玻璃瓶中,超声1 h,然后加入300 μL偶联试剂,混合均匀,同时滴加稀盐酸溶液至溶液pH = 5,振荡孵育1 h,二次水洗涤3次;再加入40 μL 0.01 mol/L的电化学发光体溶液(溶质为鲁米诺,溶剂为0.1mol/L氢氧化钠溶液)和40 μL 15 μmol/L的适配体溶液(DNA片段溶于水配制而成),混合均匀,然后滴加氢氧化钠溶液至溶液pH = 9,振荡孵育4 h,二次水洗涤3次后;加入质量百分浓度为1.5%的牛血清白蛋白溶液150 μL,4℃下浸泡1 h,以封闭电极表面的非特异性活性位点,二次水洗涤3次,定容至200 μL,即可得到适配体和电化学发光体同时标记的多功能化氧化石墨烯材料溶液,4 ℃下储存备用;其中偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中得到,偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔浓度为50 mmol/L,N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)摩尔浓度为5mmol/L;适配体为氨基修饰的DNA片段,碱基序列为:5′-NH2-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3′;
(2)电化学发光适配体传感器的组装
将直径为3~5 mm的磁性玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm和0.05 μm的三氧化二铝浆抛光打磨,然后在乙醇和二次水中分别超声2 min,氮气吹干;取8 μL步骤(1)中制备的多功能化氧化石墨烯材料溶液,滴涂到上述预处理过的磁性玻碳电极表面,多功能化氧化石墨烯材料即被均匀、牢固地吸附到电极表面,即得电化学发光适配体传感器。
具体实施例二
同上述实施例一,其主要区别在于:
步骤(1)的a步骤中:在洁净的三颈烧瓶中加入30 mL 1 mg/mL的氧化石墨烯,超声1 h;然后在氮气氛保护下加入20 mL 0.07 mol/L的氯化亚铁溶液和20 mL 0.15 mol/L的氯化高铁溶液,于70℃搅拌回流,同时缓慢滴加10 mL 30%的氨水至溶液的pH = 10,回流处理5 h;冷却后,用二次水洗涤至溶液的pH = 7,定容到50 mL,即得磁性氧化石墨烯材料溶液;
步骤(1)的b步骤中,取磁性氧化石墨烯材料溶液于玻璃瓶中超声,然后加入200μL偶联试剂,同时滴加稀盐酸溶液至溶液pH = 4,振荡孵育1 h,二次水洗涤3次;再加入30 μL 0.1 mol/L的电化学发光体溶液(溶质为N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺,溶剂为0.1mol/L氢氧化钠溶液)和30 μL 20 μmol/L的适配体溶液,然后滴加氢氧化钠溶液至溶液pH = 8,振荡孵育4 h,二次水洗涤3次后;加入质量百分浓度为1%的牛血清白蛋白溶液200 μL,4℃下浸泡1 h,二次水洗涤3次,定容至200 μL,即可得到适配体和电化学发光体同时标记的多功能化氧化石墨烯材料溶液;其中偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔浓度为10 mmol/L,所述的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)摩尔浓度为10 mmol/L;
步骤(2)中取5 μL多功能化氧化石墨烯材料溶液滴涂到磁性玻碳电极表面。
具体实施例三
同上述实施例一,其主要区别在于:
步骤(1)的a步骤中:在洁净的三颈烧瓶中加入50 mL 1 mg/mL的氧化石墨烯,超声1 h;然后在氮气氛保护下加入30 mL 0.05 mol/L的氯化亚铁溶液和30 mL 0.10 mol/L的氯化高铁溶液,于90℃搅拌回流,同时缓慢滴加15 mL 20%的氨水至溶液的pH = 11,回流处理3 h;冷却后,用二次水洗涤至溶液的pH = 7,定容到50 mL,即得磁性氧化石墨烯材料溶液;
步骤(1)的b步骤中,取磁性氧化石墨烯材料溶液于玻璃瓶中超声,然后加入400 μL偶联试剂,混合均匀,同时滴加稀盐酸溶液至溶液pH = 6,振荡孵育1 h,二次水洗涤3次;再加入50 μL 0.001 mol/L的鲁米诺电化学发光体溶液和50 μL 10 μmol/L的适配体溶液,然后滴加氢氧化钠溶液至溶液pH = 10,振荡孵育4 h,二次水洗涤3次后;加入质量百分浓度为2%的牛血清白蛋白溶液100 μL,4℃下浸泡1 h,二次水洗涤3次,定容至200 μL,即可得到适配体和电化学发光体同时标记的多功能化氧化石墨烯材料溶液;其中偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔浓度为100 mmol/L,所述的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)摩尔浓度为1 mmol/L;
步骤(2)中取10 μL多功能化氧化石墨烯材料溶液滴涂到磁性玻碳电极表面。
具体实施例四
一种利用上述具体实施例一制备的用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的检测肿瘤标志物MUC1的方法,具体步骤如下:
将具体实施例一制备的用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器浸泡在不同浓度的肿瘤标志物MUC1溶液中,37℃下温育1 h,然后使用二次水轻轻洗涤后作为工作电极;使用铂丝电极作为对电极,Ag/AgCl电极或饱和甘汞电极作为参比电极,构成三电极体系;将三电极体系置于缓冲溶液中,启动电化学反应,测量体系的电化学发光强度值;获得一系列不同浓度的肿瘤标志物MUC1溶液对应的电化学发光强度值,建立电化学发光强度值与肿瘤标志物MUC1浓度之间的定量关系;当MUC1的浓度为0.001~100 U/mL时,电化学发光信号强度值与MUC1的浓度对数之间呈现良好的线性关系如图3所示,线性方程为y=–1997.38 × logx+ 4979.25,线性相关系数R=0.9948。根据线性方程可准确定量未知样品中肿瘤标志物MUC1的浓度。
上述缓冲溶液为含有1~3 mmol/L H2O2的0.05 mol/L pH = 9~11 的Na2CO3-NaHCO3体系缓冲溶液。
上述电化学反应的条件如下:电位阶跃计时电流法;脉冲宽度:0.25秒;脉冲间隔:30秒;初始电压:0 V;脉冲电压:1 V。
具体实施例五
电化学发光适配体传感器特异性试验
实验选取了其他常见的肿瘤标志物神经降压素(NT)、人类免疫球蛋白(hIgG)、甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)来验证本发明具体实施例一、二和三制备的电化学发光适配体传感器对肿瘤标志物MUC1具有特异性的识别能力,结果表明如图4所示:在其他常见肿瘤标志物存在时,该电化学发光适配体传感器的信号大致与空白值相当,这表明常见肿瘤标志物对MUC1的检测无显著性干扰,选择性良好。其中NT、hIgG、AFP和CEA的浓度为1000U/mL,MUC1浓度为10 U/mL。
具体实施例六
取空白血清样品,采用标准加入法分别配制了不同浓度的MUC1溶液,按照发明具体实施例一、二和三中的具体实验步骤构建了电化学发光适配体传感器并对加标样品按具体实施例四方法进行检测。检测结果如表1所示,
表1 人体血清中肿瘤标志物MUC1的检测( ,n = 5)
血清样品 | 加标量/(U/mL) | 检出量/(U/mL) | RSD/% | 回收率/% |
1 | 100 | 97.23 ± 2.2 | 2.3 | 97.2% |
2 | 50 | 51.2 ± 0.82 | 1.6 | 102.4% |
3 | 10 | 9.83 ± 0.25 | 2.5 | 98.3% |
4 | 5 | 5.08 ± 0.14 | 2.7 | 101.6% |
5 | 1 | 0.961 ±0.03 | 3.1 | 96.1% |
由表1可知,相对标准偏差(RSD)小于3.1%,回收率介于96.1~102.4%,表明本发明构建的电化学发光适配体传感器对血清中肿瘤标志物MUC1的检测精密度高,检测结果准确可靠。
以上结果说明,本发明构建的检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器,灵敏度高、检测限低、选择性好、操作简单、检测结果准确可靠。实验过程中只需将多功能化氧化石墨烯材料滴涂到磁性玻碳电极表面即可实现电化学发光适配体传感器的一步组装,进而实现对血清中肿瘤标志物MUC1的高灵敏度、强特异性、简单、快速检测。
当然,上述说明并非对本发明的限制,本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内,作出的变化、改型、添加或替换,也应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)多功能氧化石墨烯材料的合成
a. 磁性氧化石墨烯的合成:在洁净的三颈烧瓶中加入30~50 mL 1 mg/mL的氧化石墨烯,超声1 h;然后在氮气氛保护下加入20~30 mL 0.05~0.07 mol/L的氯化亚铁溶液和20~30 mL 0.10~0.15 mol/L的氯化高铁溶液,于70~90℃搅拌回流,同时缓慢滴加10~15 mL 20%~30%的氨水至溶液的pH = 10~11,回流处理3~5 h;冷却后,用二次水洗涤至溶液的pH = 7,定容到50 mL,即得磁性氧化石墨烯材料溶液,4 ℃储存备用;
b. 取步骤(a)中所得的磁性氧化石墨烯材料溶液200 μL于玻璃瓶中,超声1 h,然后加入200~400 μL偶联试剂,混合均匀,同时滴加稀盐酸溶液至溶液pH = 4~6,振荡孵育1 h,二次水洗涤3次;再加入30~50 μL 0.001~0.1 mol/L的电化学发光体溶液和30~50 μL 10~20 μmol/L的适配体溶液,混合均匀,然后滴加氢氧化钠溶液至溶液pH = 8~10,振荡孵育4 h,二次水洗涤3次后;加入质量百分浓度为1~2%的牛血清白蛋白溶液100~200 μL,4℃下浸泡1 h,二次水洗涤3次,定容至200 μL,即可得到适配体和电化学发光体同时标记的多功能化氧化石墨烯材料溶液,4 ℃下储存备用;
(2)电化学发光适配体传感器的组装
将直径为3~5 mm的磁性玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm和0.05 μm的三氧化二铝浆抛光打磨,然后在乙醇和二次水中分别超声2 min,氮气吹干;取5~10 μL步骤(1)中制备的多功能化氧化石墨烯材料溶液,滴涂到上述预处理过的磁性玻碳电极表面,多功能化氧化石墨烯材料即被均匀、牢固地吸附到电极表面,即得电化学发光适配体传感器。
2.根据权利要求1所述的用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法,其特征在于:所述的电化学发光体溶液中溶质为鲁米诺或N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺,溶剂为0.1mol/L氢氧化钠溶液。
3.根据权利要求1所述的用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法,其特征在于:所述的偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中得到,所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为10~100 mmol/L,所述的N-羟基琥珀酰亚胺摩尔浓度为1~10 mmol/L。
4.根据权利要求1所述的用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器的制备方法,其特征在于:所述的适配体为氨基修饰的DNA片段,碱基序列为:5′-NH2-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3′。
5.一种利用权利要求1-4中任一项所述的电化学发光适配体传感器检测肿瘤标志物MUC1的方法,其特征在于具体步骤如下:
将权利要求1-4中任一项制备的用于检测肿瘤标志物MUC1的电化学发光适配体传感器浸泡在不同浓度的肿瘤标志物MUC1溶液中,37℃下温育1 h,然后使用二次水轻轻洗涤后作为工作电极;使用铂丝电极作为对电极,Ag/AgCl电极或饱和甘汞电极作为参比电极,构成三电极体系;将三电极体系置于缓冲溶液中,启动电化学反应,测量体系的电化学发光强度值;获得一系列不同浓度的肿瘤标志物MUC1溶液对应的电化学发光强度值,建立电化学发光强度值与肿瘤标志物MUC1浓度之间的定量关系;根据这个定量关系可以检测待测样品中肿瘤标志物MUC1的浓度。
6.根据权利要求5所述的电化学发光适配体传感器检测肿瘤标志物MUC1的方法,其特征在于:所述的缓冲溶液为含有1~3 mmol/L H2O2的0.05 mol/L pH = 9~11 的Na2CO3-NaHCO3体系缓冲溶液。
7.根据权利要求5所述的电化学发光适配体传感器检测肿瘤标志物MUC1的方法,其特征在于电化学反应的条件如下:电位阶跃计时电流法;脉冲宽度:0.25秒;脉冲间隔:30秒;初始电压:0 V;脉冲电压:1 V。
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