CN104762371B - 用于预测或监控c-Met抑制剂效力的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了预测和/或监控c‑Met抑制剂效力的生物标志物；预测和/或监控c‑Met抑制剂效力的组合物，包括检测该生物标志物的物质；选择适于应用c‑Met抑制剂的受试者的组合物，包括检测该生物标志物的物质；用所述生物标志物预测和/或监控c‑Met抑制剂效力的方法；用所述生物标志物选择适于应用c‑Met抑制剂的受试者的方法；和预防和/或治疗癌症的方法，包括向所选的受试者施用c‑Met抑制剂。

Description

用于预测或监控c-Met抑制剂效力的生物标志物
技术领域
本文提供了通过分析一种或多种生物标志物来预测和/或监控c-Met抑制剂效力的方法；用于预测和/或监控c-Met抑制剂效力的组合物，包括检测生物标志物的物质；用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的组合物，包括检测生物标志物的物质；用一种或多种生物标志物来预测和/或监控c-Met抑制剂效力的方法；用一种或多种生物标志物选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的方法；和预防和/或治疗癌症的方法，包括向选择的受试者施用c-Met抑制剂。
相关技术的描述
生物标志物通常指经过测量的特性(例如，天然存在的蛋白)，其可用作外部因素(例如，损伤)在生物体内引起的一些变化的指示。现已有活跃的研究将生物标志物应用于诊断多种疾病，比如癌症、中风、痴呆等，以及预测或监控一些试剂的治疗作用。与药物研发有关的生物标志物包括药效标志物(PD标志物)和预测性标志物，前者指示药物是否在体内是功能上有效的，后者在用药前指示对具体药物最可能的应答。这样的标志物的使用有助于建立药物的临床策略。例如，可将经设计以指示对于药物作用的灵敏度或抗性的预测性标志物应用于患者的选择以允许更有效的药物治疗，且可利用药效标志物来监控单独的患者中的药物活性，将它们综合可导致确立有效的治疗策略。并且，即使在没有预测性标志物的情况下，药效标志物允许对药物的反应进行早期监控，从而允许在早期阶段鉴别药物有效组和药物无效组。从而，可开发更有效和成功的药物疗法。此外，当应用于以浓度函数监控药物应答时，药效标志物可以作为计算该药物适宜剂量的指标。
目前为止，癌症是几大致死原因之一。虽然医学技术的发展带来了癌症治疗的显著进步，但在过去的二十多年里，所有癌症的5年存活率仅提高了10％。这是因为，癌症的特性，比如快速生长、转移等，使其难以在适宜的时间进行诊断和治疗。对能提供癌症疗法效力信息的适宜生物标志物的鉴定可极大地影响在最佳时间提供最适宜的癌症治疗的能力。例如，患有肺癌的患者在癌症分类、基因型和蛋白分泌方面可彼此各不相同，从而必须利用不同且合适的治疗剂进行治疗。对于用特定药物进行的化疗，对应的生物标志物(若存在)将减少错误试验的次数而增加成功的可能性。在这方面，非常重要的是开发用于预测和监控抗癌治疗剂效力的生物标志物。适当的生物标志物若成功开发，可对抗癌药物的应用和价值以及利用其进行治疗的成功率产生巨大贡献。
c-Met是肝细胞生长因子(HGF)受体。肝细胞生长因子(HGF)作为多功能细胞因子发挥作用，其结合c-Met受体的胞外结构域以调节各种正常细胞和肿瘤细胞中的细胞***、细胞运动和形态发生。c-Met受体是具有酪氨酸激酶活性的膜受体。c-Met是原癌基因，编码代表性的受体酪氨酸激酶。其间或参与负责癌症发展的多种机制，比如癌发生、转移、迁移、血管发生和癌细胞侵入等，而与受体HGF无关，因此作为抗癌治疗的靶标而受到密切关注。因此已开发了靶向的治疗，比如针对c-Met的抗体。
用研发的c-Met靶向药物进行的治疗可能能更有效地治疗癌症，若存在能够预测和监控药物疗效以选择适宜于该药物治疗的患者并监控患者对所述药物的应答的生物标志物，则成功的可能性更大。因此，生物标志物的应用可用于建立有效的治疗策略。
发明简述
一个实施方案提供了生物标志物，其用于预测和/或监控c-Met抑制剂的治疗作用或用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者，其中所述生物标志物包括选自由IL-8、b-IG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种。
另一实施方案提供了生物标志物的用途，所述生物标志物用于预测和/或监控c-Met抑制剂的治疗作用或用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者，其中所述生物标志物包括选自由IL-8、b-IG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种。
另一实施方案提供了组合物和试剂盒，所述组合物和试剂盒用于预测和/或监控c-Met抑制剂效力或用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者，所述组合物和试剂盒包括与选自由IL-8、b-IG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种相互作用的物质。
另一实施方案提供了物质，所述物质与选自由IL-8、b-IG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种相互作用，以用于预测和/或监控c-Met抑制剂效力或用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者。
另一实施方案提供了物质的用途，所述物质与选自由IL-8、b-IG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种相互作用，所述用途为用于预测和/或监控c-Met抑制剂效力或用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者。
还提供了预测和/或监控c-Met抑制剂效力或选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的方法，包括在生物样品中测量选自由IL-8、b-IG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的存在(存在/不存在)、水平和/或突变。
另一实施方案提供了抑制c-Met或预防和/或治疗癌症的方法，该方法包括将c-Met抑制剂施用于通过本文方法选出的适于应用c-Met抑制剂的受试者。
另一实施方案提供了c-Met抑制剂或包括c-Met抑制剂的药物组合物，用于在受试者中抑制c-Met和/或治疗癌症，其中所述受试者相较于其中c-Met抑制剂无效的参照样品具有高水平的IL-8或编码IL-8的核酸；在施用c-Met抑制剂之后(相较于施用之前的水平)显示了降低的水平的IL-8、b-IG-H3、MIF和/或编码其的核酸；和/或具有KRAS、BRAF和/或编码其的核酸的突变。
另一实施方案提供了c-Met抑制剂或包括c-Met抑制剂的药物组合物的用途，用于在受试者中抑制c-Met和/或治疗癌症，其中所述受试者相较于其中c-Met抑制剂无效的参照样品具有高水平的IL-8或编码IL-8的核酸；在施用c-Met抑制剂之后(相较于施用之前的水平)显示了降低的水平的IL-8、bIG-H3、MIF和/或编码其的核酸；和/或具有KRAS、BRAF和/或编码其的核酸的突变。
附图说明
图1A、1B、1C、1D和1E显示抗c-Met抗体的抗癌活性，是在移植了Lovo细胞(图1A)、HT29细胞(图1B)、EBC-1细胞(图1C)、Hs746T细胞(图1D)和MKN45细胞(图1E)的小鼠模型中，因抗c-Met抗体处理导致的肿瘤尺寸变化。
图2是移植了癌细胞的小鼠模型中IL-8水平的图，显示了IL-8水平和对于抗c-Met抗体的反应性之间的关系。
图3的多个图显示，在移植了人癌细胞的小鼠模型中，反应者组和无反应者组应答不同剂量的抗c-Met抗体所致的IL-8血清水平变化。
图4显示，在移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中，对照(载体(PBS)处理)血清样品中的IL-8水平。
图5是，在移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中，抗c-Met抗体处理组和未处理组(对照PBS处理)的血清样品中的IL-8水平，显示了抗c-Met抗体处理之后，抗c-Met抗体的抗癌效力和IL-8水平的变化之间的关系。
图6是显示，在移植了典型的癌细胞系(EBC-1)的小鼠模型中，抗c-Met抗体处理之后肿瘤尺寸的变化。
图7是显示，在移植了典型的癌细胞系(Hs746T)的小鼠模型中，抗c-Met抗体处理之后肿瘤尺寸的变化。
图8是显示，在移植了典型的癌细胞系(EBC-1)的小鼠模型中，抗c-Met抗体处理之后IL-8水平随时间的变化。
图9是显示，在移植了典型的癌细胞系(Hs746T)的小鼠模型中，抗c-Met抗体处理之后IL-8水平随时间的变化。
图10是显示，在移植了U87MG的小鼠模型中，抗c-Met抗体处理之后肿瘤尺寸的变化。
图11显示了用蛋白阵列盒进行化学发光免疫分析所测量的，U87MG细胞中蛋白表达模式的变化。
图12是显示，在抗c-Met抗体处理之后，在来自移植了不同癌细胞的小鼠模型的血清中bIG-H3水平的变化。
图13是显示，在抗c-Met抗体处理之后，在来自移植了患者来源肿瘤组织的小鼠模型的血清中bIG-H3水平的变化。
图14是显示，在抗c-Met抗体处理之后，在来自移植了患者来源肿瘤组织的小鼠模型的癌组织裂解物中bIG-H3水平的变化。
图15显示了用蛋白阵列试剂盒进行化学发光免疫分析所测量的，在移植了患者来源肿瘤组织的小鼠模型(LXFA623)中蛋白表达模式的变化。
图16是显示，在抗c-Met抗体处理之后，在来自移植了不同癌细胞系的小鼠模型的血清中MIF水平的变化。
图17是显示，在抗c-Met抗体处理之后，在来自移植了患者来源肿瘤组织的小鼠模型的血清中MIF水平的变化。
图18显示了通过Western印迹所测量的，在移植了患者来源的癌细胞的小鼠模型中c-Met蛋白的表达水平。
图19的多个图显示，在移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中存在或不存在K-RAS和B-RAF突变的情况下，在抗c-Met抗体处理之后肿瘤尺寸的变化。
图20的多个图显示，抗c-Met抗体反应者细胞系对其他c-Met抑制剂克唑替尼和PHA665752处理的反应性。
图21包含示出抗c-Met抗体无反应者细胞系对其他c-Met抑制剂；克唑替尼和PHA665752的处理的反应性的图。
图22的多个图显示，在不同c-Met抑制剂L3-1Y/IgG2、克唑替尼和PHA665752处理之后，在抗c-Met抗体反应者细胞系的培养液中IL-8的相对水平(％)。
图23的多个图显示，在不同c-Met抑制剂L3-1Y/IgG2、克唑替尼和PHA665752处理之后，在抗c-Met抗体无反应者细胞系的培养液中IL-8的相对水平(％)。
发明详述
一个实施方案提供了用于预测和/或监控c-Met抑制剂的治疗作用或选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的生物标志物，其中所述生物标志物包括选自由IL-8、b-IG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种。
另一实施方案提供了用于预测和/或监控c-Met抑制剂的治疗作用或选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的生物标志物的用途，其中所述生物标志物包括选自由IL-8、b-IG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种。
另一实施方案提供了用于预测和/或监控c-Met抑制剂效力或选择可应用c-Met抑制剂(即，将表现出效力)的受试者的组合物和试剂盒，所述组合物和试剂盒包括与选自由IL-8、b-IG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种相互作用的物质。
另一实施方案提供了包括与选自由IL-8、b-IG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种相互作用的物质的组合物和试剂盒，其用于预测和/或监控c-Met抑制剂效力或选择适于应用c-Met抑制剂的受试者，或用于制备用于预测和/或监控c-Met抑制剂效力或选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的试剂(药物组合物)。
另一实施方案提供了与选自由IL-8、b-IG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种相互作用的物质，其用于预测和/或监控c-Met抑制剂效力或选择适于应用c-Met抑制剂的受试者。
另一实施方案提供了与选自由IL-8、b-IG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种相互作用的物质的用途，所述用途为用于预测和/或监控c-Met抑制剂效力或选择适于应用c-Met抑制剂的受试者。
另一实施方案提供了预测和/或监控c-Met抑制剂效力或选择可应用c-Met抑制剂(即，将表现出效力)的受试者的方法，包括对选自由IL-8、b-IG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种生物标志物进行分析。
另一实施方案提供了预测和/或监控c-Met抑制剂的效力或提供用于预测和/或监控c-Met抑制剂效力的信息的方法，所述方法包括在生物样品中测量选自由IL-8、b-IG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的存在、水平和/或突变。
另一实施方案提供了选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的方法，所述方法包括在获自受试者的生物样品中测量选自由IL-8、b-IG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的存在、水平和/或突变。
另一实施方案提供了用于在受试者中抑制c-Met和/或治疗癌症的c-Met抑制剂或包括该c-Met抑制剂的药物组合物，其中所述受试者相较于其中c-Met抑制剂无效的参照样品具有高水平的IL-8或编码IL-8的核酸；在施用c-Met抑制剂之后(相较于施用之前)显示了降低的水平的IL-8、bIG-H3、MIF和/或编码其的核酸；和/或具有KRAS、BRAF和/或编码其的核酸的突变。
另一实施方案提供了c-Met抑制剂或包括c-Met抑制剂的药物组合物的用途，所述用途用于在受试者中抑制c-Met和/或治疗癌症，或用于制备用来在受试者中抑制c-Met和/或治疗癌症的药物组合物，其中所述受试者相较于其中c-Met抑制剂无效的参照样品具有高水平的IL-8或编码IL-8的核酸；在施用c-Met抑制剂之后(相较于施用之前)显示了降低的水平的IL-8、bIG-H3、MIF和/或编码其的核酸；和/或具有KRAS、BRAF和/或编码其的核酸的突变。
另一实施方案提供了用于预防和/或治疗癌症的方法，包括向受试者施用c-Met抑制剂，其中所述受试者相较于其中c-Met抑制剂无效的参照样品具有高水平的IL-8或编码IL-8的核酸，如下所示；在施用c-Met抑制剂之后(相较于施用之前)显示了降低水平的IL-8、bIG-H3、MIF和/或编码其的核酸；和/或具有KRAS、BRAF和/或编码其的核酸的突变。例如，受试者可通过以上用于选择适于应用c-Met抑制剂的方法来选择。该预防或治疗方法可进一步包括在施用之前选择适于应用c-Met抑制剂的受试者。
另一实施方案提供了用于抑制c-Met的方法，包括将c-Met抑制剂施用于受试者，其中所述受试者相较于其中c-Met抑制剂无效的参照样品具有高水平的IL-8或编码IL-8的核酸，如下所定义的；在施用c-Met抑制剂之后(相较于施用之前)显示了降低的水平的IL-8、bIG-H3、MIF和/或编码其的核酸；和/或具有KRAS、BRAF和/或编码其的核酸的突变。例如，受试者可通过以上用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的方法来选择。该抑制方法可进一步包括在施用之前选择适于应用c-Met抑制剂的受试者。
如本文所用的，术语c-Met抑制剂的“效力”指c-Met抑制剂的抑制活性和/或药物活性，所述活性导致预防、改善、减弱或治疗c-Met相关疾病例如癌症。对癌症的效力指抗癌作用，例如，诱导癌细胞或癌组织的减少或死亡，以及对癌细胞迁移行为和/或引起癌转移的侵入行为进行抑制的能力。换言之，效力可指施用了c-Met抑制剂的受试者对c-Met抑制剂的反应性。
如本文所用的，术语“预测c-Met抑制剂的效力”可指，确定c-Met抑制剂是否对其治疗的受试者表现出所需效力(例如，抗肿瘤或抗癌效力)，或表现出多少这样的效力。
如本文所用的，短语“适于应用c-Met抑制剂的受试者”可指“适宜于c-Met抑制剂给药或治疗的受试者”或“患有可能对c-Met抑制剂有反应的疾病(例如，癌症)的受试者”。
通过定量分析蛋白或编码其的基因(核酸)诸如DNA、cDNA或mRNA可确定某蛋白的表达水平。如本文所用的，术语“基因”指编码蛋白的任何核酸，无论是基因组DNA、cDNA或RNA(mRNA)。KRAS/BRAF突变的确定可在基因水平或蛋白水平上来实现。
IL-8(白细胞介素8)是作为免疫应答的重要的调节者行使功能的趋化因子。IL-8，也称作嗜中性趋化性因子，其具有两个主要的功能：其在靶细胞，主要是嗜中性粒细胞，以及其他粒细胞中诱导趋化性，使所述细胞向感染的部位迁移；且其一旦到达之后还会进行吞噬作用。还已知IL-8是有助于肿瘤细胞的增殖和转移的血管生成的有效的启动子。在本发明的一个示例性的实施方案中，对c-Met抑制剂的反应根据IL-8的表达水平而不同，而利用c-Met抑制剂处理之前和之后的生物样品的IL-8的表达水平的差异取决于对c-Met抑制剂的反应(参见实施例1)。简言之，生物样品中IL-8或其基因的较高水平指示c-Met抑制剂，例如，抗c-Met抗体，对生物样品或生物样品源于其的患者更有效地发挥其功能。此外，在c-Met抑制剂，例如，抗c-Met抗体良好作用的生物样品(药物反应组)中，通常观察到相较于应用之前，在应用c-Met抑制剂之后IL-8或其基因的水平的降低。
即，可使用IL-8的表达水平来预测c-Met抑制剂的效力并从而选择适宜于利用c-Met抑制剂治疗的受试者，或根据c-Met抑制剂的处理的或利用c-Met抑制剂处理之前或之后IL-8的表达水平的变化允许评估(鉴定)或监控c-Met抑制剂的效力，从而用于确定是否应持续应用c-Met抑制剂，或建立c-Met抑制剂在给药、给药间隔和给药次数方面的治疗策略。基于该发现，表明了IL-8作为标志物用于指示和/或监控c-Met抑制剂的效力的用途。
IL-8可起源于脊椎动物，包括哺乳动物，比如啮齿动物，例如，小鼠、大鼠等，和灵长类，例如，人、猴等，鸟、爬虫动物、两栖动物和鱼。例如，IL-8可选自由NP_000575.1,AAH13615.1,AAA59158.1,NP_001028137.1,AAA80141.2,和AAA86711.1组成的组。IL-8-编码基因(cDNA或mRNA)可选自NM_000584.3、BC013615.1(第41-340位),NC_000004,NG_029889,NC_018915.2,AC_000136、M28130.1、NM_001032965.1、S78555.1和U19849.1中。
一个实施方案涉及用于预测和/或监控c-Met抑制剂的效力的生物标志物的分析，包括对选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的分析(例如，测量其水平)。
另一实施方案涉及用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的生物标志物的分析，包括对选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的分析(例如，测量其水平)。
另外的实施方案涉及用于预测和/或监控c-Met抑制剂的效力的组合物和试剂盒，所述组合物和试剂盒包括能够与选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种相互作用的物质。
另外的实施方案涉及用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的组合物和试剂盒，包括与选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种相互作用的物质。
另一实施方案是用于预测和/或监控c-Met抑制剂的效力或用于提供预测和/或监控c-Met抑制剂的效力的信息的方法，包括测量生物样品的选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平。
另一实施方案提供了选择适于应用c-Met抑制剂的受试者或用于提供选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的方法，包括测量生物样品的选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平。
根据一个实施方案提供的是用于预测c-Met抑制剂的效力的方法，用于提供预测c-Met抑制剂的效力的信息，用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者，或用于提供选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的信息，包括在生物样品中测量选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平。在用于预测c-Met抑制剂的效力或用于提供c-Met抑制剂的效力的信息的方法中，当测量生物样品具有高水平的选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种时，可预测生物样品或作为该生物样品来源的患者允许c-Met抑制剂有效地发挥其作用或可认为其适于应用c-Met抑制剂。因此，用于预测c-Met抑制剂的效力或用于提供c-Met抑制剂的效力的信息的方法可进一步包括，当观察到生物样品具有高水平的选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种时，确定c-Met抑制剂在生物样品或患者中表现出其效力。此外，用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者或用于提供选择的信息的方法可进一步包括，当测量之后观察到生物样品具有高水平的选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种时，确定生物样品或患者为适于应用c-Met抑制剂的受试者。
“高水平的选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种”可指大量的IL-8蛋白和/或编码IL-8的核酸(DNA、cDNA或mRNA)，是与施用c-Met抑制剂不会发挥治疗活性的患者的生物样品(参照样品)相比较。例如，当受试患者的受试生物样品中选自IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)的至少一种的水平比施用c-Met抑制剂不会发挥效力(例如，c-Met抑制效力或抗癌效力)的参照生物样品中的水平高至少约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍或约5倍，例如，约1.5倍至约100倍、约2倍至约100倍、约3倍至约100倍、约4倍至约100倍或约5倍至约100倍时，则预测该c-Met抑制剂在受试生物样品或受试患者中有效地发挥其效力(例如，c-Met抑制效力或抗癌效力)，或可认为受试生物样品或受试患者为适宜于应用c-Met抑制剂的受试者。c-Met抑制剂可以是，例如，抗c-Met抗体。参照生物样品可以是用于比较c-Met标志物的表达和/或c-Met抑制剂效力的任何样品，比如含有哺乳动物细胞之类的细胞、且c-Met抑制剂在其中不具有效力(例如，c-Met抑制或抗癌效力)的生物样品。c-Met抑制剂在其中不表现出效力的参照生物样品的例子包括，但不限于，Lovo细胞系(CCL-229，ATCC)和HT-29细胞系(HTB-38，ATCC)。因此，用于预测c-Met抑制剂的效力(或用于提供关于预测c-Met抑制剂的效力的信息)或用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者(或用于提供选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的信息)可进一步包括在参照生物样品中测量选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平的步骤。IL-8和编码IL-8的核酸(例如，定量分析)的水平的测量可通过在受试生物样品和参照生物样品二者中用相同的方法来进行。
测量生物样品选自IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)的至少一种可包括：i)利用与选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种相作用的物质处理(起反应或接触)生物样品；ii)定量分析反应混合物以确定选自IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)的至少一种的水平。在一个实施方案中，可在步骤i)之前进一步进行制备生物样品的步骤，其中所述制备步骤可包括从患者获得(分离)生物样品或获得已经从患者中分离的生物样品。在步骤i)中，相作用的物质可以是选自由以下组成的组的至少一种：化合物(小分子化学物质；包括常用标记物比如荧光物、染料等)，蛋白(抗体、适体，等)、核酸(DNA、RNA等)，和类似物，都是指与IL-8或IL-8基因相结合的那些，和例如，相作用的物质可以是化合物(小分子化学物质；例如，常用标记物比如荧光物、染料等)、抗体、或适体，其均结合(例如，特异性结合)于IL-8，与编码IL-8的核酸(例如，基因)的部分或整体结合的多核苷酸(例如，引物、探针、适体)，或其任何组合，和任选地，可与常用标记物诸如荧光物、第二抗体、珠子(例如，磁珠或聚苯乙烯珠)、染料，或其任何组合。可将步骤i)配置为通过将相作用的物质添加到生物样品而形成复合物。在步骤ii)中，反应混合物可以是来自选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种和相作用的物质之间的相互作用(结合)的复合物，其可在步骤i)中获得。定量分析可包括定量复合物、与复合物缀合的标记物、或IL-8或在从生物样品中分离复合物之后与复合物隔离的编码IL-8的核酸(例如，基因)。
根据另一实施方案提供的是用于监控(评估或鉴定)c-Met抑制剂的效力或用于提供关于c-Met抑制剂的效力的监控(评估或鉴定)的信息的方法，包括在生物样品中测量选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平。在用于监控c-Met抑制剂的效力或用于提供关于监控c-Met抑制剂的效力的信息的方法中，在利用c-Met抑制剂处理之前和之后可在来自患者的生物样品中(或在c-Met抑制剂未处理的生物样品和c-Met抑制剂处理的生物样品中)测量选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平，并相互比较所述水平。当确定选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的处理后水平低于预处理水平时，确定c-Met抑制剂在生物样品所来源(获得)的患者中发挥其效力，而当选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的处理后水平高于预处理水平或与之相同时，确定c-Met抑制剂在该生物样品的来源(获得)患者中不发挥其效力或对c-Met抑制剂有抵抗性。因此，用于监控c-Met抑制剂的效力或用于提供关于监控c-Met抑制剂的效力的信息的方法可进一步包括1)将来自c-Met抑制剂处理组的生物样品中选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平与来自未处理组的生物样品中的水平相比较，和/或2)当c-Met抑制剂处理组的生物样品中选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平相较于未处理组降低了，则确定在生物样品来源的患者中c-Met抑制剂发挥其效力(在该情况中，可进行确定以维持(持续)对受试者施用c-Met抑制剂)，和/或3)当c-Met抑制剂处理组的生物样品中选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平维持不变或增高，则确定在生物样品来源的患者中c-Met抑制剂不发挥其效力或对c-Met抑制剂有抵抗性(在该情况中，可进行确定以停止对受试者施用c-Met抑制剂)。c-Met抑制剂可以是抗c-Met抗体。
如本文所用的，c-Met抑制剂处理组和未处理组分别是指c-Met抑制剂处理之后和之前的同一份生物样品，或生物样品分别经c-Met抑制剂处理和未处理(例如，仅用载剂处理)的同一份等份试样。除非另外指明，术语“c-Met抑制剂未处理组(或生物样品)”和“利用c-Met抑制剂处理之前的生物样品”或“预处理的生物样品”是彼此相同的，而术语“c-Met抑制剂处理组(或生物样品)”和“利用c-Met抑制剂处理之后的生物样品”或“处理后的生物样品”具有相同的含义。在一个实施方案中，术语“c-Met抑制剂处理组(或生物样品)”和“利用c-Met抑制剂处理之后的生物样品”或“处理后的生物样品”可指在利用c-Met抑制剂施用于受试者之后从受试者中获得的生物样品。
通过定量IL-8蛋白和/或编码IL-8的核酸(例如，基因)(DNA、cDNA或mRNA)可测量选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平。例如，当在c-Met处理的组或利用c-Met抑制剂处理之后的生物样品中选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平相较于c-Met抑制剂未处理组或预处理的生物样品、c-Met抑制剂处理组或处理后的生物样品的水平(认为是100wt％)为约0至约80wt％、约0至约70wt％、约0至约60wt％、约0至约50wt％、约0至约40wt％、约0至约30wt％、约0至约20wt％或约0至约10wt％，则确定其相较于c-Met抑制剂未处理的或预处理的生物样品，选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平降低了。当c-Met抑制剂处理组或处理后的生物样品中的IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)的水平为c-Met抑制剂未处理组或预处理的生物样品中的水平的约0wt％，在c-Met处理的组或处理后的生物样品中未检测到(不存在)选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种。c-Met抑制剂未处理组(或预处理)和c-Met抑制剂处理组(或处理后)中IL-8和/或编码IL-8的核酸(例如，基因)的水平可通过对来自相同的患者的相同的样品进行相同的程序来测量。
为了监控c-Met抑制剂的效力，可在相对短的一段时间内，例如在施用c-Met抑制剂之后的一周、5天、3天、2天或1天之时，定量分析IL-8和/或编码IL-8的核酸(例如，基因)，且比较所述施用之前和之后该标志物的水平，就可评估c-Met抑制剂的效力。然后，可获得建立更有效治疗策略的优势，因为有可能在治疗的早期阶段评估c-Met抑制剂的效力。
在一个实施方案中，在生物样品中对选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平的测量可包括1)在利用c-Met抑制剂处理之前在来自患者的生物样品中(或作为来自患者的生物样品的部分的c-Met抑制剂未处理的生物样品)确定选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平，和2)在来自利用c-Met抑制剂处理之后的患者的生物样品中(或作为来自患者的生物样品的c-Met抑制剂处理的生物样品)确定选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平。步骤1)和2)的每个可包括i)向生物样品应用(添加)与选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种相作用的物质；和ii)定量分析所得的反应混合物以确定选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平。在一个实施方案中，在步骤i)之前，还可进行制备生物样品的步骤，其中所述制备步骤可包括从患者中获得(分离)生物样品或获得已从患者中分离的生物样品。在步骤i)中，如以下所进一步阐释的，相作用物质可以是选自由以下组成的组的至少一种：化合物(小分子化学物质；例如，常用标记物比如荧光物、染料，等)、蛋白(抗体、适体，等)、核酸(DNA、RNA，等)和类似物，与IL-8或IL-8基因结合，例如，相作用物质可以是选自由以下组成的组的至少一种：化合物、抗体(例如用于细胞内染色的抗体(人CXCL8/IL-8藻红蛋白MAb；#IC208P；R&D systems)等)、适体，其均特异性结合IL-8，和与编码IL-8的基因的部分或整体结合的多核苷酸(例如，引物(例如，用于进行IL-8的RT-PCR的引物套(登录号:BC013615.1；正向引物:5'-ATG ACT TCC AAG CTGGCC GTG GCT-3'，以及反向引物:5'-TCT CAG CCC TCT TCA AAA ACT TCT-3')，等等)、探针、适体)，和任选地，可以与标记物缀合，比如荧光物或染料。步骤i)可配置为通过向生物样品应用(添加)相作用的物质而形成复合物。在步骤ii)中，反应混合物可以是来自选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种和相作用物质之间的相互作用(结合)的复合物，所述相作用物质可在步骤i)中获得。定量分析步骤可包括定量复合物、与复合物缀合的标志物或在复合物与生物样品分离之后与复合物隔离的IL-8或基因。IL-8的定量分析可通过任何常规蛋白定量方式来进行，比如免疫层析、免疫组化、免疫组化染色、酶联免疫测定(ELISA；如Platinum ELISA Human IL-8/NAP-1(#BMS204/3,eBioscience)等)、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、化学发光免疫测定(LIA)、Western印记、微芯片、表面质子共振(SPR)、流式荧光术(如细胞计数珠阵列(Cytometric Bead Array，CBA)测定(如IL-8flex set(#558277),人类炎性细胞因子试剂盒(#551811)；BD biosciences)、细胞内染色(比如，用诸如人CXCL8/IL-8藻红蛋白MAb(#IC208P；R&D systems))等抗体),Luminex测定,等等，且IL-8基因的定量分析可通过任何常规的基因(DNA或RNA)定量方法来进行，比如PCR(如qPCR，RT-PCT等)、mRNA微阵列，和类似的方法，但不限于此。
监控方法可用于确定是否持续使用c-Met抑制剂，和/或c-Met抑制剂的适宜的给药条件(剂量、给药间隔、给药次数，等)。例如，当c-Met抑制剂处理组中或处理后生物样品中选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平相较于c-Met抑制剂未处理组或预处理的生物样品降低了，例如，当c-Met抑制剂处理组中或处理后的生物样品中选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平为c-Met抑制剂未处理组或预处理生物样品的水平的约0至约80wt％、约0至约70wt％、约0至约60wt％、约0至约50wt％、约0至约40wt％、约0至约30wt％、约0至约20wt％或约0至约10wt％时，可确定持续使用c-Met抑制剂。此外，当c-Met抑制剂处理组中或处理后生物样品中选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平相较于c-Met抑制剂未处理组或预处理的生物样品降低了，例如，当c-Met抑制剂处理组中或处理后的生物样品中选自由IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平为c-Met抑制剂未处理组或预处理生物样品的水平的约0至约80wt％、约0至约70wt％、约0至约60wt％、约0至约50wt％、约0至约40wt％、约0至约30wt％、约0至约20wt％或约0至约10wt％时，可确定c-Met抑制剂的给药条件是适宜的。给药条件可以是选自由剂量、给药间隔和给药数量组成的组的至少一种。
另一个实施方案提供了用于抑制c-Met的方法，包括向受试者施用c-Met抑制剂，所述受试者在施用c-Met抑制剂之后具有高水平的IL-8和编码IL-8的核酸(其中所述高水平如上所限定)和/或显示了降低的水平的IL-8和/或编码IL-8的核酸(相较于施用c-Met抑制剂之前)。该受试者可以是1)通过以上用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的方法所选择或2)通过以上监控c-Met抑制剂的效力的方法确定其中c-Met抑制剂对其表现出效力的受试者。
另一实施方案提供了用于预防和/或治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用c-Met抑制剂，所述受试者在施用c-Met抑制剂之后具有高水平的IL-8或编码IL-8的核酸(其中高水平如上所述)和/或显示了降低的水平的IL-8和/或编码IL-8的核酸(相较于施用c-Met抑制剂)。受试者可以是1)通过以上用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的方法来选择或2)通过以上监控c-Met抑制剂的效力的方法确定其中c-Met抑制剂对其发挥效力的受试者。
用于抑制c-Met的方法或用于预防和/或治疗癌症的方法还可包括在施用步骤之前选择可对其应用c-Met抑制剂的受试者。选择的细节如上所述。c-Met抑制剂可以是抗c-Met抗体。
在一个实施方案中，用于抑制c-Met或用于预防和/或治疗癌症的方法可包括：
鉴定可应用c-Met抑制剂的受试者；和
向所述受试者施用药学上有效量的c-Met抑制剂。
在另一实施方案中，用于抑制c-Met或用于预防和/或治疗癌症的方法可包括：
在生物样品中测量IL-8和编码IL-8的核酸(例如，基因)的水平以选择可应用c-Met抑制剂的受试者；和
向受试者施用药学上有效量的c-Met抑制剂。
关于c-Met抑制剂的给药条件，比如剂量、给药间隔和/或给药数目，可在用于监控c-Met抑制剂效力的方法中来确定。
在具有高水平的IL-8的个体中，一些抗癌剂诸如舒尼替尼(sunitinib)、顺铂、紫杉醇等常不能发挥其抗癌作用，因为它们会引起抗性。相比之下，c-Met抑制剂，例如，抗c-Met抗体，尤其是如以下所描述的那些，可在具有高水平的IL-8的个体中表现出高抗癌活性，从而允许提出更有效的治疗策略。
bIG-H3，也称作TGFBI(转化生长因子β诱导的)，是与I型、II型和IV型胶原结合的含RGD的蛋白。RGD基序发现于ECM(胞外基质)中。作为与a3b1整合素结合的配体，bIG-H3参与细胞粘附和迁移。bIG-H3是可溶性的蛋白并在癌症转移和肿瘤微环境中的血管生成中起作用。迄今对于c-Met和bIG-H3之间的关系无报道。
MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)是先天性免疫的重要调节者，并归类为炎性细胞因子。
在本说明书的实施例章节，观察到c-Met抑制剂处理组和未处理组之间或处理后组和预处理组之间bIG-H3和/或MIF表达水平的差异因对c-Met抑制剂的反应的不同而不同(参照实施例2和3)。具体地，当c-Met抑制剂，例如抗c-Met抗体良好作用时(药物反应性组)，应用c-Met抑制剂之后选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的水平低于应用之前。
换言之，测量了应用c-Met抑制剂之前或之后选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的表达水平以测定(鉴定)或监控c-Met抑制剂效力，从而可有效地使用测量结果来确定c-Met抑制剂是否应继续应用或不应用，或建立c-Met抑制剂在例如剂量、给药间隔、给药次数方面的治疗策略。基于该发现，bIG-H3和/或MIF作为用于c-Met抑制剂的可见的药效标志物出现。
bIG-H3可源自脊椎动物，包括哺乳动物，比如啮齿动物，例如，小鼠、大鼠等，和灵长类动物，例如，人，猴等，鸟、爬行动物、两栖动物和鱼。例如，bIG-H3可选自下组，但不限于，人bIG-H3(NP_000349.1，AAC24944.1，AAC08449.1，AAH00097.1等)，小鼠bIG-H3(NP_033395.1，AAI29901.1，AAI29902.1等)，大鼠bIG-H3(NP_446254)和斑马鱼bIG-H3(NP_878282)。bIG-H3编码基因(cDNA或mRNA)可选自下组，但不限于，NM_000358.2、NM_009369.4、NM_053802.1和NM_182862.1。
MIF可源自脊椎动物，包括哺乳动物，鸟、爬行动物、两栖动物和鱼。例如，MIF可选自下组，但不限于，人MIF(NP_002406.1等),猴MIF(例如，NP_001028087.1等)，绵羊MIF(例如，NP_001072123.1)等)，啮齿类MIF(例如，小鼠MIF(NP_034928.1等),大鼠MIF(NP_112313.1等),NP_001266756.1等),牛MIF(NP_001028780.1等),斑马鱼MIF(NP_001036786.1等),猪MIF(NP_001070681.1等),青蛙MIF(NP_001083650.1,NP_001107147.1等),以及鱼MIF(例如，NP_001118053.1,NP_001135019.1,NP_001027889.1)。MIF编码基因(cDNA或mRNA)可以选自，但不限于，NM_002415.1,NM_001032915.1,NM_001078655.1,NM_010798.2,NM_031051.1,NM_001279827.1,NM_001033608.1,NM_001043321.1,NM_001077213.2,NM_001090181.1,NM_001113675.1,NM_001124581.1,NM_001141547.1,和NM_001032717.1。
一个实施方案提供了用于评估c-Met抑制剂效力的生物标志物，包括选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种。
另一实施方案提供了用于评估c-Met抑制剂效力的组合物和试剂盒，包括选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种。
另一实施方案提供了用于评估(或鉴定或监控)c-Met抑制剂的效力或用于提供关于评估(或鉴定或监控)c-Met抑制剂的效力的信息的方法，包括在生物样品中测量选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的水平。
在用于监控c-Met抑制剂的效力或用于提供关于监控c-Met抑制剂的效力的信息的方法中，在来自利用c-Met抑制剂处理之前和之后的患者的生物样品中(或在c-Met抑制剂处理组生物样品和c-Met抑制剂未处理的生物样品中)测量了选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的水平并进行了比较。当选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的处理后水平相较于预处理水平低的时候，确定c-Met抑制剂在生物样品的来源患者中发挥其活性，而当选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的处理后水平与预处理水平相同或比其更高(增高)时，确定c-Met抑制剂在生物样品所来源(获得)的患者中不发挥其效力或对c-Met抑制剂有抗性。因此，用于监控c-Met抑制剂的效力或用于提供关于监控c-Met抑制剂的效力的信息的方法可进一步包括1)将来自c-Met抑制剂处理组的生物样品中选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的水平与来自未处理组的生物样品中的水平相比较，和/或2)当c-Met抑制剂处理组的生物样品中选自由bIG-H3或MIF和编码bIG-H3或MIF的核酸(例如，基因)组成的组的至少一种的水平相较于未处理组的水平降低了，确定c-Met抑制剂在生物样品来源的患者中发挥其效力(在该情况中，可确定维持(继续)向受试者施用c-Met抑制剂)，和/或3)当c-Met抑制剂处理组的生物样品中选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的水平保持不变或增高时，确定c-Met抑制剂不会在生物样品来源的患者中发挥其效力或发生对c-Met的抵抗性(在该情况总，可确定停止向受试者施用c-Met抑制剂)。C-Met抑制剂可以是抗c-Met抗体。
通过利用以上所描述的定量技术定量bIG-H3蛋白、MIF蛋白和核酸(DNA、cDNA或mRNA)可测量选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的水平。例如，当在c-Met抑制剂处理组中或在用c-Met抑制剂处理之后的生物样品中的选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的水平为c-Met抑制剂未处理组或预处理的生物样品的水平的约0至约80wt％、约0至约70wt％、约0至约60wt％、约0至约50wt％、约0至约40wt％、约0至约30wt％、约0至约20wt％或约0至约10wt％，确定c-Met抑制剂处理组或处理后生物样品在选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的水平上相较于c-Met抑制剂未处理的或预处理生物样品降低了。当c-Met抑制剂处理组或处理后的生物样品中选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的水平为c-Met抑制剂未处理组或预处理生物样品中的水平的0wt％时，在c-Met抑制剂处理组或处理后生物样品中未检测到(不存在)选自bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸的至少一种。C-Met抑制剂未处理组(或预处理)和c-Met抑制剂处理组(或后处理)中bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸的水平可通过对来自相同的患者的相同的样品进行相同的程序来测量。
可在相对短的时间内定量分析编码蛋白的bIG-H3、MIF和核酸，例如，在施用c-Met抑制剂一个月、两周、一周、5天、3天、2天或1天之后，且施用之后和之前的标志物的水平的比较可评估c-Met抑制剂的效力。然后，可获得建立更有效的治疗测量的优点，因为可能在治疗的早期阶段评估c-Met抑制剂的效力。
在一个实施方案中，在生物样品中测量选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的水平可包括，1)在用c-Met抑制剂治疗之前，在来自患者的生物样品中确定选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的水平(或在c-Met抑制剂未处理的生物样品中，其是来自患者的生物样品)和2)在来自用c-Met抑制剂处理后的患者的生物样品中(或在c-Met抑制剂处理的生物样品中，其为来自患者的生物样品的部分)确定选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的水平。步骤1)和2)可包括i)将与选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种相互作用的物质应用(添加)于生物样品；和ii)定量分析所得的反应混合物以确定选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种的水平。在一个实施方案中，在步骤i)之前，可再进行制备生物样品的步骤，其中制备步骤可包括从患者中获得(分离)生物样品或获得已经从患者中分离的生物样品。在步骤i)中，如以下将进一步阐释的，相互作用物质可以是选自由以下组成的组的至少一种：化合物(小分子化学物质；例如，常用标记物诸如荧光物、染料，等)、蛋白(抗体、适体，等)，核酸(DNA、RNA，等)，和类似物，结合于bIG-H3、MIF、bIG-H3基因或MIF基因，和例如，相互作用物质可以是选自由以下组成的组中的至少一种：化合物、抗体、适体，其均特异性结合bIG-H3或MIF，和与编码bIG-H3或MIF的部分或整体结合的多核苷酸(例如，引物、探针、适体)，和任选地，可与标记物缀合，比如荧光物、第二抗体、珠子(例如，磁珠或聚苯乙烯珠)或染料。步骤i)可配置为通过将相互作用物质应用(添加)于生物样品而形成复合物。在步骤ii)中，反应混合物可以是从选自由bIG-H3、MIF和编码这些蛋白的核酸组成的组的至少一种和相互作用物质之间的相互作用(结合)产生的复合物，所述相互作用物质可在步骤i)中获得。定量分析步骤可包括定量复合物、与复合物缀合的标记物或bIG-H3或MIF，或编码其的核酸，其在将复合物与生物样品分离之后与复合物隔离。bIG-H3或MIF的定量分析可通过任何常规蛋白定量方式来进行，比如免疫层析、免疫组化、免疫组化染色、酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、化学发光免疫测定(LIA)、Western印记、微芯片、表面质子共振(SPR)、流式荧光术(如细胞计数珠阵列(CBA)测定,人类炎性细胞因子试剂盒；BD biosciences)、细胞内染色,Luminex测定,等等，且bIG-H3或MIF基因的定量分析可通过任何常规的基因(DNA或RNA)定量方法来进行，比如PCR(如qPCR，RT-PCT等)、mRNA微阵列，和类似的方法，但不限于此。
评估方法可用于确定是否继续使用c-Met，和/或c-Met抑制剂的适宜的给药条件(剂量、给药间隔和给药次数)。例如，当与c-Met未处理组或预处理生物样品相比较，c-Met抑制剂处理组或处理后生物样品中的选自由bIG-H3、MIF和基因组成的组的至少一种的水平降低了，例如，当c-Met抑制剂处理组或处理后生物样品中的选自由bIG-H3、MIF和基因组成的组的至少一种的水平为c-Met抑制剂未处理组或预处理生物样品的水平的约0至约80wt％、约0至约70wt％、约0至约60wt％、约0至约50wt％、约0至约40wt％、约0至约30wt％、约0至约20wt％、or about 0至约10wt％时，确定继续使用c-Met抑制剂。此外，与c-Met抑制剂未处理组或预处理生物样品相比较，c-Met抑制剂处理组或处理后生物样品中的选自由bIG-H3、MIF和基因组成的组的至少一种的水平降低了，例如，当c-Met抑制剂处理组或处理后的生物样品中的选自由bIG-H3、MIF和基因组成的组的至少一种的水平为c-Met抑制剂未处理组或预处理生物样品的水平的约0至约80wt％、约0至约70wt％、约0至约60wt％、约0至约50wt％、约0至约40wt％、约0至约30wt％、约0至约20wt％、or about 0至约10wt％时，可确定c-Met抑制剂的给药条件为适宜的。给药条件可以是选自下组的至少一种：剂量、给药间隔和给药次数。给药条件可利用以上描述的技术来确定。
另一实施方案提供了用于抑制c-Met的方法，包括向需要其的受试者施用c-Met抑制剂。另一实施方案提供了用于预防和/或治疗癌症的方法，包括向需要其的受试者施用c-Met抑制剂。在用于抑制c-Met或用于预防和/或治疗癌症的方法中，受试者可以是在施用c-Met抑制剂之后显示降低的水平的bIG-H3、MIF和/或编码其的核酸的受试者(相较于施用之前)。例如，受试者可以是1)通过以上的用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的方法选择的，或2)通过监控c-Met抑制剂的效力确定其中c-Met抑制剂发挥其效力的受试者。
在用于抑制c-Met或用于预防和/或治疗癌症的方法中，c-Met抑制剂的施用可根据通过评估方法确定的适宜的给药条件来进行，比如剂量、给药间隔和/或给药次数。
IL-8、bIG-H3、MIF和编码其的核酸(例如，基因)可通过利用与蛋白或基因相互作用的物质进行的任何常用的蛋白或基因测定方法来测量。与任何蛋白或基因相互作用的物质可以是化合物、抗体或适体，其君特异性结合IL-8、bIG-H3或MIF 8蛋白，或与编码IL-8、bIG-H3或MIF 8蛋白的基因的部分或整体结合的多核苷酸(例如，引物、探针、适体)。例如，IL-8、bIG-H3或MIF蛋白的水平可通过利用结合(例如，特异性结合)IL-8、bIG-H3或MIF8蛋白的化合物(小分子化学物质；例如，常用标记物诸如荧光物、染料，等)、抗体和/或适体检测酶反应、荧光、发光和/或放射活性来测量。具体地，蛋白的水平可利用选自但不限于以下的分析技术来确定：免疫层析法、免疫组化(IHC)、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(LIA)、Western印迹、显微阵列、表面质子共振(SPR)、流式细胞术测定(例如，Cytometric Bead Array(CBA)测定(BD biosciences)，细胞内染色，等)，Luminex测定和类似的分析技术。此外，编码IL-8、bIG-H3或MIF的基因的水平可通过利用可与基因杂交的引物、探针或适体进行典型基因测定方法来测量，例如，通过聚合酶链式反应(PCR；例如，qPCR或RT-PCR)，FISH(荧光原位杂交)或微阵列测定。在一个实施方案中，设计引物以检测编码IL-8、bIG-H3或MIF5的基因(全长DNA、cDNA或mRNA)的连续的碱基对的片段，例如，约5至2000bp或5至1000bp的片段，例如，约10至1500bp、约10至1000bp、约10至约500bp、约20至约200bp或约50至约200bp，且可以是具有核苷酸序列的一对引物，其分别可与大小范围在从约5至2000bp，约5至1500bp，约5至500bp，约5至约100bp，例如，约5至约50bp，约5至约30bp或约10至约25bp的3’端和5’端区域杂交。可与基因杂交的探针或适体可具有大小为从约5至约100bp、从约5至约50bp、从约5至约30bp或从约5至约25bp的核苷酸序列，其可与IL-8、bIG-H3或MIF编码基因(全长的DNA、cDNA或mRNA)的片段杂交(或互补)。如本文所用的，术语“可杂交”意为以引物、探针或适体和基因区域之间80％或更高，例如，90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或100％的序列互补性与基因的特异性区域互补性结合。
RAS-RAF途径是代表性的细胞增殖信号通路，癌细胞利用该途径进行生长。为此原因，RAS-RAF途径是抗癌药物的主要靶标。因此，RAS-RAF途径的突变可以是可影响靶向该途径的药物的效力的重要因素。迄今无关于c-Met和RAS-RAF之间关系的报道。
在本发明的一个示例性的实施方案中，对c-Met抑制剂的应答可根据RAS和/或RAF的突变而不同(参见实施例4)。更具体地，当观察到生物样品具有RAS和/或RAF突变时，c-Met抑制剂，例如，抗c-Met抗体不在生物样品中或生物样品的来源患者中起作用。
换言之，RAS和/或RAF的突变的检测可有效地用于预测c-Met抑制剂的效力或用于选择可应用c-Met抑制剂的受试者。基于该发现，首次表明RAS-RAF为c-Met抑制剂的预测性标志物。
RAS，是GTP酶超家族的成员，可选自下组：KRAS、NRAS和HRAS，其均源自脊椎动物，包括哺乳动物，比如啮齿动物，例如，小鼠、大鼠等，和灵长类动物，例如，人，猴等，鸟、爬行动物、两栖动物和鱼。例如KRAS可选自但不限于下组：人KRAS(NP_004976.2,NP_203524.1,etc.),小鼠KRAS(NP_067259.4,etc.),斑马鱼KRAS(NP_001003744.1,etc.),青蛙KRAS(NP_001095209.1),牛KRAS(NP_001103471.1),鸡KRAS(NP_001243091.1),猴KRAS(NP_001248441.1),NP_001028153.1,NP_113703.1,和NP_001008034.1。KRAS编码基因(cDNA或mRNA)可以选自，但不限于，NM_004985.4,NM_033360.3,NM_021284.6,NM_001003744.1,NM_001101739.1,NM_001110001.1,NM_001256162.1,NM_001261512.2,NM_001032981.2,NM_031515.3,和NM_001008033.1。
与c-Met抑制剂的预测相关联的KRAS的突变可以是野生型KRAS(登录号：NM_004985)的密码子12GGT(对应于氨基酸序列NP_004976的第12位的Gly)和/或密码子13GGC(对应于氨基酸序列NP_004976的第13位的Gly)上的置换，如以下表1所示。
表1
NP_004976的氨基酸修饰的例子
密码子# 碱基置换 氨基酸置换(NP_004976中)
12 GGT→GCT Gly→Ala(G12A)
12 GGT→GAT Gly→Asp(G12D)
12 GGT→CGT Gly→Arg(G12R)
12 GGT→TGT Gly→Cys(G12C)
12 GGT→AGT Gly→Ser(G12S)
12 GGT→GTT Gly→Val(G12V)
13 GGC→GAC Gly→Asp(G13D)
13 Gly→Asn(G13N)
13 Gly→Cys(G13C)
23 Leu→Arg(L23R)
24 Ile→Phe(I24F)
59 Ala→Thr(A59T)
61 Gln→Leu(Q61L)
61 Gln→His(Q61H)
61 Gln→Lys(Q61K)
146 Ala→Thr(A146T)
此外，突变可以是选自下组的至少一个氨基酸残基：NP_004976的氨基酸序列上的第13位的Gly、第24位的Ile、第59位的Ala、第61位的Gln和第146位，和/或KRAS编码核酸中诱导上述氨基酸突变的突变。例如，KRAS的突变可包括选自下组的至少一个：NP_004976的氨基酸序列的G12A、G12D、G12R、G12C、G12S、G12V、A146T、A59T、L23R、G13N、G13D、I24F、Q61L、Q61H、G13C和Q61K，和/或KRAS编码核酸中诱导上述氨基酸突变的突变，或它们的组合。
NP_004976的氨基酸序列(188个氨基酸：SEQ ID NO:109)
MTEYKLVVVG AGGVGKSALT IQLIQNHFVD EYDPTIEDSY RKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQ YMRTGEGFLC VFAINNTKSF EDIHHYREQI KRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQA QDLARSYGIP FIETSAKTRQ GVDDAFYTLV REIRKHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM
RAF可选自下组：BRAF、c-RAF A-RAF、V-RAF、KSR1和KSR2，其均源自脊椎动物，包括哺乳动物，比如啮齿动物，例如，小鼠、大鼠等，和灵长类动物，例如，人，猴等，鸟、爬行动物、两栖动物和鱼。例如，BRAF可选自下组，但不限于，人BRAF(NP_004324.2等)、小鼠BRAF(NP_647455.3等)、青蛙BRAF(NP_001083526.1等)、斑马鱼BRAF(NP_991307.2等)、大鼠BRAF(NP_579817.1等)、以及鸡KRAS(NP_990633.1等)。BRAF编码基因(cDNA或mRNA)可选自但不限于下组：NM_004333.4、NM_139294.5、NM_205744.3、NM_001090057.1、NM_133283.1,和NM_205302.1。
与c-Met抑制剂的预测相关的BRAF的突变可以是选自下组的位置处的氨基酸中的至少一个的置换：596(G)、600(V)、601(K)、469(G)、466(G)、581(N)、597(L)、464(G)和类似物。例如，与c-Met抑制剂效力的预测相关的BRAF的突变可包括基于野生型BRAF(编号NP_004324)的至少一种以下的突变：G596R(第596位的碱基G由R置换)、V600E、V600K、V600R、K601E、K601E、G469A、V600M、G469A、V600L、G466V、V600D、G469V、D594G、D594N、N581S、L597V、L597S、L597Q、K601N、G466V、G466E、G464V、G469E等；BRAF编码核酸中诱导上述氨基酸突变的突变；或它们的组合。
NP_004324的氨基酸序列(766氨基酸：SEQ ID NO:110)
MAALSGGGGG GAEPGQALFN GDMEPEAGAG AGAAASSAAD PAIPEEVWNIKQMIKLTQEHIEALLDKFGG EHNPPSIYLE AYEEYTSKLD ALQQREQQLL ESLGNGTDFSVSSSASMDTVTSSSSSSLSV LPSSLSVFQN PTDVARSNPK SPQKPIVRVF LPNKQRTVVPARCGVTVRDSLKKALMMRGL IPECCAVYRI QDGEKKPIGW DTDISWLTGE ELHVEVLENVPLTTHNFVRKTFFTLAFCDF CRKLLFQGFR CQTCGYKFHQ RCSTEVPLMC VNYDQLDLLFVSKFFEHHPIPQEEASLAET ALTSGSSPSA PASDSIGPQI LTSPSPSKSI PIPQPFRPADEDHRNQFGQRDRSSSAPNVH INTIEPVNID DLIRDQGFRG DGGSTTGLSA TPPASLPGSLTNVKALQKSPGPQRERKSSS SSEDRNRMKT LGRRDSSDDW EIPDGQITVG QRIGSGSFGTVYKGKWHGDVAVKMLNVTAP TPQQLQAFKN EVGVLRKTRH VNILLFMGYS TKPQLAIVTQWCEGSSLYHHLHIIETKFEM IKLIDIARQT AQGMDYLHAK SIIHRDLKSN NIFLHEDLTVKIGDFGLATVKSRWSGSHQF EQLSGSILWM APEVIRMQDK NPYSFQSDVY AFGIVLYELMTGQLPYSNINNRDQIIFMVG RGYLSPDLSK VRSNCPKAMK RLMAECLKKK RDERPLFPQILASIELLARSLPKIHRSASE PSLNRAGFQT EDFSLYACAS PKTPIQAGGY GAFPVH
一个实施方案提供了用于预测c-Met抑制剂的效力的组合物和试剂盒，包括检测选自由KRAS蛋白、BRAF蛋白和编码所述蛋白的核酸组成的组的至少一种的突变的物质。
另一实施方案提供了用于检测选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的组合物和试剂盒，包括检测选自由KRAS蛋白、BRAF蛋白和编码所述蛋白的核酸组成的组的至少一种的突变。
根据另一实施方案还提供了用于预测c-Met抑制剂的效力、用于提供关于预测c-Met抑制剂的效力的信息、用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者、或用于提供选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的信息的方法，所述方法包括在生物样品中检测选自由KRAS蛋白、BRAF蛋白和编码所述蛋白的核酸组成的组的至少一种的突变。在用于预测c-Met抑制剂的效力或用于提供关于c-Met抑制剂的效力的信息的方法中，当在生物样品中未检测到选自由KRAS蛋白、BRAF蛋白和编码所述蛋白的核酸组成的组的至少一种的突变时，可预测生物样品或生物样品所来源的患者允许c-Met抑制剂有效发挥其活性或可认为其适宜于应用c-Met抑制剂。因此，用于预测c-Met抑制剂的效力或用于提供关于c-Met抑制剂的效力的信息的方法还可包括评估当选自由KRAS蛋白、BRAF蛋白和编码所述蛋白的核酸组成的组的至少一种的突变时，c-Met抑制剂将在生物样品或患者中发挥其效力。此外，用于选择适于应用c-Met抑制剂或用于提供关于选择的信息的方法还可包括，当在生物样品中未检测到选自由KRAS蛋白、BRAF蛋白和编码所述蛋白的核酸组成的组的至少一种的突变时，确定生物样品或患者为适于应用c-Met抑制剂的受试者。
在生物样品中检测选自由KRAS蛋白、BRAF蛋白和编码所述蛋白的核酸组成的组的至少一种的突变可包括i)利用检测选自由KRAS蛋白、BRAF蛋白和编码所述蛋白的核酸组成的组的至少一种的突变的物质处理所述生物样品；和ii)分析反应混合物以确定突变的存在。在一个实施方案中，在制备步骤i)之前，可进一步进行制备生物样品的步骤，其中制备步骤可包括从患者中获得(分离)生物样品或获得已从患者中分离的生物样品。在步骤i)中，检测性物质可以是选自下组的至少一种：1)多核苷酸(例如，探针或适体)，所述多核苷酸包括可与KRAS基因和/或BRAF基因(全长DNA、cDNA或mRNA)的含突变的片段杂交(例如，互补)的核苷酸序列，所述核苷酸序列大小范围在从约5至约2000bp、约5至约1500bp、约5至约500bp、约5至约100bp、从约5至约50bp、从约5至约30bp或从约5至约25bp，和具有分别可与具有大小为约5至约2000bp或约5至约1000bp，例如，从约10至约1500bp、约10至约1000bp、约10至约500bp，从约20至约200bp或从约50至约200bp的基因的3’端区域和5’端区域杂交(例如，互补)的核苷酸序列的一对引物，所述3’端区域和5’端区域大小范围在从约5至约100bp、从约5至约50bp、从约5至约30bp或从约5至约25bp；2)化合物(小分子化学物质；例如，常用标记物诸如荧光物、染料，等)、抗体、适体，均结合(例如，特异性结合)于具有氨基酸突变的KRAS或BRAF蛋白。任选地，检测性物质可与标记物缀合，比如荧光物、第二抗体、珠子(例如，磁珠或聚苯乙烯珠)、染料或其组合。如本文所用的，术语“可杂交”意为以引物、探针或适体和基因区域之间80％或更高，例如，90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或100％的序列同源性与基因的特异性区域互补性结合。步骤i)可配置为通过将检测性物质添加(应用)至生物样品来形成复合物。
在步骤ii)中，反应混合物可以是从选自KRAS基因和BRAF基因(其为突变的)和检测性物质的基因之间的杂交产生的或从化合物(小分子化学物质；例如，常用标记物诸如荧光物、染料，等)、抗体、或适体，和具有氨基酸突变(例如，置换)的KRAS或BRA蛋白(其可在步骤i)中获得)之间的相互作用产生的复合物。分析可包括检测复合物或与复合物缀合的标记物、或碱基或氨基酸，对在将复合物和生物样品分离之后与复合物隔离的KRAS、BRAF、KRAS基因和/或BRAF基因片段进行测序。
另一实施方案提供了用于抑制c-Met的方法，包括向具有KRAS、BRAF和编码其的核酸的至少一种的突变的受试者施用c-Met抑制剂。例如，受试者可通过以上用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的方法来选择。
另一实施方案提供了用于预防和/或治疗癌症的方法，包括向具有KRAS、BRAF和编码其的核酸的至少一种的突变的受试者施用c-Met抑制剂。例如，受试者可通过以上用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者来选择。
用于抑制c-Met的方法或用于预防和/或治疗癌症的方法可进一步包括在施用步骤之前选择可应用c-Met抑制剂的受试者。选择的细节如上所述。C-Met抑制剂可以是抗c-Met抗体。
在一个实施方案中，用于抑制c-Met或用于预防和/或治疗癌症的方法可包括：
鉴定可应用c-Met抑制剂的受试者；和
向所述受试者施用药学上有效量的c-Met抑制剂。
在另一个实施方案中，用于抑制c-Met或用于预防和/或治疗癌症的方法可包括：
在生物样品中检测KRAS、BRAF或编码其的核酸的突变以选择c-Met抑制剂可应用的受试者；和
将药学上有效量的c-Met抑制剂施用于所选择的c-Met抑制剂可应用的受试者。如本文所用的，KRAS或BRAF蛋白的突变可指以上所述的氨基酸突变(例如，置换)，和编码KRAS或BRAF的核酸的突变可指核酸中的突变(例如，置换)，其诱导如上所述的KRAS或BRAF的突变。
从利用c-Met抑制剂如抗c-Met抗体的观点出发，c-Met在癌细胞中的具体表达水平是c-Met抑制疗法的先决条件。
因此，用于预测c-Met抑制剂的效力、选择用于应用c-Met抑制剂的受试者或监控c-Met抑制剂的效力的组合物和/或试剂盒还可包括与选自由c-Met和c-Met编码基因组成的组的至少一种相互作用的物质，以及与选自由IL-8、bIG-H3、MIF、KRAS/BRAF和其编码基因组成的组的至少一种相互作用的物质，和编码其的基因。与c-Met和/或c-Met编码基因相互作用的物质可以是选自下组的至少一种：化合物(小分子；例如，常用标记物诸如荧光物、染料，等)、蛋白、肽、核酸(多核苷酸、寡核苷酸等)，和类似物，其与c-Met和/或c-Met编码基因特异性相互作用(或结合)。例如，与c-Met和/或c-Met编码基因相互作用的物质可以是选自由化学物质、抗体和适体组成的组的至少一种，其特异性结合c-Met，和核酸(例如，引物、探针、适体等)，其结合c-Met编码基因的全部或部分(例如，约5至约100bp、约5至约50bp、约5至约30bp或约5至约25bp)，其可利用常用标记物质来标记，比如荧光物、第二抗体、珠子(例如，磁珠或聚苯乙烯珠)、着色剂和类似物。
此外，用于预测c-Met抑制剂的效力(或用于提供关于预测c-Met抑制剂的效力的信息)的方法或用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者(或用于提供选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的信息)的方法还可包括在来自患者的生物样品中测量c-Met蛋白或其基因(例如，全长DNA、cDNA、mRNA)的水平。测量c-Met和/或c-Met编码基因的水平和测量选自由IL-8、bIG-H3、MIF、KRAS/BRAF和编码其的基因组成的组的至少一种的水平可以任何顺序同时或顺序地来进行。测量步骤的细节如上所述。例如，可应用western印迹技术。在这方面，当将预定量的(例如约10μg)的获自生物样品(例如，癌细胞或组织)的蛋白加载到SDSPAGE凝胶上，转移至膜并与抗c-Met抗体相反应，然后在ECL反应下曝光一定时间(例如，约30秒)时，条带的检测可指示建立了c-Met抑制剂治疗的先决条件。在另一实施方案中，若利用肿瘤组织的组织切片(例如，***固定石蜡包埋的组织(FFPE))通过免疫组织化学(IHC)确定c-Met水平为+2或更高，可确定肿瘤组织为c-Met抑制剂可对其发挥治疗效力。在另一实施方案中，当发现如Affymetrix阵列(Affymetrix GeneChip Human GenomeU133Plus 2.0array；引物套为“203510_at”)，所测量的生物样品具有约12,000或更高、约13,000或更高或约14,000或更高的c-Met水平时，可建立c-Met抑制剂疗法的先决条件。通过高表达水平的c-Met表征的癌细胞包括来自肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和肾癌的细胞。然而，任何癌细胞，虽然源自不同种类，若其根据患者的个人特性表达高水平的c-Met，则可以是c-Met抑制剂的靶标。
在另一实施方案中，在用于预测c-Met抑制剂的效力(或用于提供关于c-Met抑制剂的效力的预测的信息)的方法中或在用于选择适于应用c-Met抑制剂的受试者(或用于提供选择适宜于应用c-Met抑制剂的受试者的信息)的方法中使用的生物样品可以是组织、细胞或体液(血液、血清、尿液、唾液等)，其显示了高表达水平的c-Met，例如，如通过Affymetrix阵列(Affymetrix GeneChip Human Genome U133Plus 2.0array；引物套为“203510_at”)所测量的约12,000或更高、约13,000或更高或约14,000或更高的c-Met水平。
预测、监控或选择的方法还可包括将c-Met抑制剂施用于受试者，所述受试者通过选择方法来选择，或经预测或监控c-Met抑制剂在其中发挥其效力。
预测、监控或选择的方法还可包括通过以下来优化c-Met抑制剂的应用或利用c-Met抑制剂的治疗1)当从受试者中获得的(分离的)的生物样品中的IL-8和/或编码IL-8的核酸高于对照样品的水平时，或当在生物样品中不存在KRAS、BRAF和编码蛋白的核酸的至少一种时，根据预测或选择方法的确定步骤的确定(例如，确定向受试者施用c-Met抑制剂)确定是否将c-Met抑制剂施用于受试者，或当在从受试者中获得(分离)的生物样品中IL-8和/或编码IL-8的核酸的水平等于或小于参照样品的水平时或当生物样品中存在KRAS、BRAF和编码蛋白的核酸的至少一种的突变时，或2)当施用c-Met抑制剂之后的生物样品中的IL-8、bIG-H3、MIF和/或编码蛋白的核酸相较于施用之前降低了时，确定是否维持(继续)或停止向受试者施用c-Met抑制剂(例如，当施用c-Met抑制剂之后生物样品中的IL-8、bIG-H3、MIF和/或编码蛋白的核酸的水平相较于施用之前降低了)，或当施用c-Met抑制剂之后生物样品中的IL-8、bIG-H3、MIF和/或编码蛋白的核酸的水平与施用之前相等或增高了，确定停止施用c-Met抑制剂。
如本文所用的的，术语“c-Met抑制剂可应用的受试者”或“适于应用c-Met抑制剂的受试者”意为对其可适宜地应用c-Met抑制剂疗法的患者，和术语“受试者”可选自由以下组成的组：哺乳动物，比如啮齿动物，例如，小鼠、大鼠等，和灵长类，例如，人、猴等，例如，癌症患者。生物样品可以是患者自身(哺乳动物，比如灵长类，例如，人、猴等，或啮齿动物，例如，小鼠、大鼠等)或细胞、组织或体液(例如，血液、血清、尿液、唾液等)，其自患者中分离或从人工培养物中人工分离。生物样品可以是血液或血清。
参照样品可选自由以下组成的组：c-Met抑制剂对其无效力(例如，c-Met抑制剂效力或抗癌效力)哺乳动物，哺乳动物细胞或组织(包括肿瘤(例如癌症)细胞或组织)，等等。
本文中，术语“c-Met抑制剂”可以指能抑制c-Met活性和或表达、或通过抑制c-Met的配体而阻断c-Met信号传递的任何试剂。在具体实施方案中，c-Met抑制剂可选自下组：抗c-Met抗体或其抗原结合片段，克唑替尼(PF-02341066；3-((R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基)-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-胺)、卡博替尼(cabozantinib)(XL-184；N-(4-(6,7-二甲氧基喹啉-4-基氧基)苯基)-N-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺)，弗瑞替尼(foretinib)(N-(3-氟-4-(6-甲氧基-7-(3-吗啉代丙氧基)喹啉-4-基氧基)苯基)-N-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺)，PHA-665752((R,Z)-5-(2,6-二氯苄磺酰基)-3-((3,5-二甲基-4-(2-(吡咯烷-1-基甲基)吡咯烷-1-羰基)-1H-吡咯-2-基)亚甲基)吲哚-2-酮)、SU11274((Z)-N-(3-氯苯基)-3-((3,5-二甲基-4-(1-甲基哌嗪-4-羰基)-1H-吡咯-2-基)亚甲基)-N-甲基-2-氧代二氢吲哚-5-磺酰胺)、SGX-523(6-(6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-[1,2,4]***并[4,3-b]哒嗪-3-基硫代)喹啉)、PF-04217903(2-(4-(3-(喹啉-6-基甲基)-3H-[1,2,3]***并[4,5-b]吡嗪-5-基)-1H-吡唑-1-基)乙醇)、EMD 1214063(苯甲腈，3-[1,6-二氢-1-[[3-[5-[(1-甲基-4-哌啶基)甲氧基]-2-吡啶基]苯基]甲基]-6-氧代-3-哒嗪基])、钩伐替尼(golvatinib)(N-(2-氟-4-((2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-甲酰氨基)吡啶-4-基)氧基)苯基)-N-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺)、INCB28060(2-氟-N-甲基-4-(7-(喹啉-6-基甲基)咪唑并[1,2-b][1,2,4]三嗪-2-基)苯甲酰胺)、MK-2461(N-((2R)-1,4-二噁烷-2-基甲基)-N-甲基-N'-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-氧代-5H-苯并[4,5]环庚[1,2-b]吡啶-7-基]磺酰胺)，提万替尼(tivantinib)(ARQ 197；(3R,4R)-3-(5,6-二氢-4H-吡咯并[3,2,1-ij]喹啉-1-基)-4-(1H-吲哚-3-基)吡咯烷-2,5-二酮)、NVP-BVU972(6-[[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-基]甲基]喹啉)、AMG458({1-(2-羟基-2-甲基丙基)-N-[5-(7-甲氧基喹啉-4-基氧基)吡啶-2-基]-5-甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1H-吡唑-4-甲酰胺})、BMS794833(N-(4-((2-氨基-3-氯吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-5-(4-氟苯基)-4-氧代-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺)、BMS 777607(N-[4-[(2-氨基-3-氯吡啶-4-基)氧基]-3-氟苯基]-4-乙氧基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)、MGCD-265(N-(3-氟-4-(2-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氧基)苯基硫代甲酰基(carbamothioyl))-2-苯基乙酰胺)、AMG-208(7-甲氧基-4-[(6-苯基-1,2,4-***并[4,3-b]哒嗪-3-基)甲氧基]喹啉)、BMS-754807((2S)-1-[4-[(5-环丙基-1H-吡唑-3-基)氨基]吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-2-基]-N-(6-氟-3-吡啶基)-2-甲基-2-吡咯烷甲酰胺)、JNJ-38877605(6-[二氟[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-***并[4,3-b]哒嗪-3-基]甲基]喹啉)，和其药学上可接受的盐，或其任何组合。
抗c-Met抗体或其抗原结合片段可以是特异性识别c-Met为抗原和/或特异性结合c-Met的任何抗体，或其抗原结合片段。例如，抗c-Met抗体可以是作用于c-Met以诱导c-Met的胞内内化和降解的任何抗体，或其抗原结合片段。抗c-Met抗体可识别c-Met的任何特定区域，例如，SEMA结构域中的特定的区域，以作为抗原。
在本文中，除非另外指明，术语“抗c-Met抗体”可意在包括完整形式的(例如，IgG形式)抗c-Met抗体，还有其抗原结合片段。其抗原结合片段可以是选自下组的至少一种：抗c-Met抗体的scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab'和F(ab')2。
“c-Met”或“c-Met蛋白”指结合肝细胞生长因子(HGF)的受体酪氨酸激酶(RTK)。c-Met可来源于(获自)任何物种，特别市哺乳动物，例如，灵长类，比如人c-Met(例如，GenBank编号NP_000236)、猴c-Met(例如，猕猴，GenBank编号NP_001162100)或啮齿动物比如小鼠c-Met(例如，GenBank编号NP_032617.2)，大鼠c-Met(例如，GenBank编号NP_113705.1)和类似物。c-Met蛋白可包括由鉴定为GenBank编号NM_000245的核苷酸序列所编码的多肽，具有鉴定为GenBank编号NP_000236的氨基酸序列的多肽或其胞外域。受体酪氨酸激酶c-Met参与多种机制，比如癌症发生、转移、癌细胞的迁移、癌细胞的侵入、血管生成和类似机制。
c-Met是肝细胞生长因子(HGF)的受体，可分为三部分：胞外、跨膜和胞内。胞外部分包括经二硫键相互连接的α-亚基和β-亚基，且包括负责结合HGF、PSI结构域(plexin(从状蛋白)-semaphorins(信号素)-integrin(整合素)同一性/同源性结构域)和IPT结构域(plexin和转录因子结构域共有的免疫球蛋白样折叠)的SEMA结构域。c-Met蛋白的SEMA结构域可具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列，且是结合HGF的胞外域。SEMA结构域的特定区域，即，具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的区域，对应于SEMA结构域的氨基酸序列从氨基酸残基106至124的范围，是SEMA结构域的表位中的第二和第三β螺旋桨之间的环区域。该区域作为抗c-Met抗体的表位起作用。
如本文所用的，术语“表位”指抗原决定簇，由抗体所识别的抗原的部分。在一个实施方案中，表位可以是包括c-Met蛋白的SEMA结构域(SEQ ID NO:79)中的约5个或更多个连续的(一级、二级(二维)或三级(三维)结构上连续的)氨基酸残基的区域，例如，SEQ ID NO:71的氨基酸序列中的约5个至约19个连续的氨基酸残基。例如，表位可以是具有选自由SEQID NO:71的氨基酸序列的部分组合的约5个至约19个连续的氨基酸的多肽，其中所述多肽包括至少SEQ ID NO:73(EEPSQ)的氨基酸序列，其作为表位的必需元素起作用。例如，表位可以是多肽，包括、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72或SEQID NO:73的氨基酸序列。
具有SEQ ID NO:72的表位对应于c-Met蛋白的SEMA结构域中的第二和第三β螺旋桨之间的环的最外层部分。具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的表位是根据一个实施方案的抗体或抗原结合片段最能特异性结合的位点。
因此，抗c-Met抗体可特异性结合表位，所述表位包括约5至约19个连续的氨基酸，所述氨基酸选自SEQ ID NO:71的氨基酸序列的部分组合，包括作为必要元素的SEQ ID NO:73。例如，抗c-Met抗体可特异性结合包括SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的氨基酸序列的表位。
在一个实施方案中，抗c-Met抗体或其抗原结合片段可包括以下或基本上由以下组成：
(i)至少一个重链互补决定区(CDR)，选自下组：(a)CDR-H1，包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列、SEQ ID NO:2的氨基酸序列或包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的8-19个连续的氨基酸的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的从第3至第10部分的氨基酸残基；和(c)CDR-H3，包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列、SEQ ID NO:85的氨基酸序列或包括SEQ ID NO:85的氨基酸序列中的6-13个连续氨基酸的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:85的氨基酸序列的第1至第6部分的氨基酸残基，或包括至少一种重链互补决定区的重链可变区。
(ii)至少一种轻链互补决定区(CDR)，选自下组：(a)CDR-L1，包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列，(b)CDR-L2，包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列，和(c)CDR-L3，包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列、SEQ ID NO:15的氨基酸序列、SEQ ID NO:86的氨基酸序列或包括SEQ IDNO:89的氨基酸序列中的9-17个连续氨基酸的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:89的氨基酸序列的第1至第9部分的氨基酸残基，或包括至少一种轻链互补决定区的轻链可变区；
(iii)至少一个重链互补决定区和至少一个轻链互补决定区的组合；或
(iv)重链可变区和轻链可变区的组合。
在本文中，SEQ ID NOS:4至9的氨基酸序列分别由下式I至VI所代表：
式I：Xaa1-Xaa2-Tyr-Tyr-Met-Ser(SEQ ID NO:4)，其中Xaa1不存在或为Pro或Ser，且Xaa2是Glu或Asp，
式II：Arg-Asn-Xaa3-Xaa4-Asn-Gly-Xaa5-Thr(SEQ ID NO:5)，其中Xaa3是Asn或Lys，Xaa4是Ala或Val和Xaa5是Asn或Thr，
式III：Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa6-Tyr(SEQ ID NO:6)，其中Xaa6是Ser或Thr，
式IV:Lys-Ser-Ser-Xaa7-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa8-Gly-Asn-Xaa9-Xaa10-Asn-Tyr-Leu-Ala(SEQ ID NO:7)，其中Xaa7是His、Arg、Gln或Lys，Xaa8是Ser或Trp，Xaa9是His或Gln，和Xaa10是Lys或Asn，
式V：Trp-Xaa11-Ser-Xaa12-Arg-Val-Xaa13(SEQ ID NO:8)，其中Xaa11是Ala或Gly，Xaa12是Thr或Lys，和Xaa13是Ser或Pro，和
式VI：Xaa14-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa15-Pro-Xaa16-Thr(SEQ ID NO:9)，其中Xaa14是Gly，Ala或Gln，Xaa15是Arg，His、Ser、Ala、Gly或Lys和Xaa16是Leu、Tyr、Phe或Met。
在一个实施方案中，CDR-H1可包括选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:24组成的组的氨基酸序列。CDR-H2可包括选自由SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:25和SEQ ID NO:26组成的组的氨基酸序列。CDR-H3可包括选自由SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:85组成的组的氨基酸序列。
CDR-L1可包括选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:106组成的组的氨基酸序列。CDR-L2可包括选自由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36组成的组的氨基酸序列。CDR-L3可包括选自由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:89组成的组的氨基酸序列。
在另一实施方案中，抗c-Met抗体或其抗原结合片段可包括以下或基本上由以下组成：
重链可变区，包括或基本上由以下组成：多肽(CDR-H1)，包括选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24组成的组的氨基酸序列，多肽(CDR-H2)，包括选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成的组的氨基酸序列，多肽(CDR-H3)，包括选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:85组成的组的氨基酸序列；和
轻链可变区，包括或基本上由以下组成：多肽(CDR-L1)，包括选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ IDNO:106组成的组的氨基酸序列，多肽(CDR-L2)，包括选自由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36组成的组的氨基酸序列，和多肽(CDR-L3)，包括选自由SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:37、SEQID NO:86和SEQ ID NO:89组成的组的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗c-Met抗体或其抗原结合片段可包括或基本上由以下组成：重链可变区，包括SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:94的氨基酸序列，和轻链可变区，包括SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:88、SEQID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99或SEQ ID NO:107的氨基酸序列。
在另一实施方案中，抗c-Met抗体或抗原结合片段可以是奥纳图珠单抗(Onartuzumab,MetMab)、LY2875358(重链：SEQ ID NO:111，轻链：SEQ ID NO:112)、瑞罗图木单抗(Rilotumumab,AMG102)或其抗原结合片段，和类似物。
用所需抗原对未经免疫的动物进行免疫，所产生的动物来源的抗体，在注射到人体中用于医学治疗目的时，常引起免疫原性，因此研发了嵌合抗体以抑制所述免疫原性。嵌合抗体通过用基因工程用人抗体的恒定区替换导致抗同种型反应的动物来源的抗体的恒定区而制备。相较于动物来源的抗体，嵌合抗体在抗同种型反应方面有显著改进，但动物来源的氨基酸仍具有可变区，因此嵌合抗体具有在潜在的抗独特型反应方面的副作用。开发了人源化的抗体以降低该副作用。通过将嵌合抗体可变区中对抗原结合起重要作用的互补决定区(CDR)移植到人类抗体框架中，产生了人源化的抗体。
用CDR移接产生人源化抗体时，最重要的是选择优化的人抗体来接受动物来源的抗体的CDR。抗体数据、晶体结构的分析和分子建模技术都被采用。然而，甚至当将动物来源的抗体的CDR移接到最优化的人抗体框架时，存在影响抗原结合的位于动物来源的CDR的框架中的氨基酸。因此，在许多情况中，并未维持抗原结合亲和力，且因此用于恢复抗原结合亲和力的另外的抗体基因工程技术的应用是必需的。
抗c-Met抗体可以是小鼠来源的抗体、小鼠人嵌合抗体、人源化的抗体或人抗体。抗体或其抗原结合片段可从活体或非天然存在的物质中分离。抗体或其抗原结合片段可以是重组的或合成的。抗体可以是单克隆的。
完整的抗体包括两个全长的轻链和两个全长的重链，其中每个轻链通过二硫键与重链连接。抗体包括重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区是gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)或epsilon(ε)类型，可将其进一步分类为gamma 1(γ1)、gamma 2(γ2)、gamma 3(γ3)、gamma 4(γ4)、alpha 1(α1)或alpha 2(α2)。轻链恒定区是kappa(κ)或lambda(λ)类型。
如本文所用的，术语“重链”指全长重链，和其片段，包括含足以提供对抗原的特异性的氨基酸序列的可变区VH，和三个恒定区，CH1、CH2和CH3，和铰链。术语“轻链”指全长轻链和其片段，包括含足以提供对抗原的特异性的氨基酸序列的可变区VL，和恒定区CL。
术语“互补决定区(CDR)”指见于重链或轻链免疫球蛋白的超变区的氨基酸序列。重链和轻链可分别包括三个CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3；和CDRL1、CDRL2和CDRL3)。CDR可提供接触性残基，所述接触性残基在抗体与抗原或表位的结合中起重要作用。术语“特异性结合”和“特异性识别”是本领域技术人员熟知的，并表示抗体和抗原特异性相互作用以导致免疫学上的活性。
如本文所用的术语“抗原结合片段”指完整的免疫球蛋白的片段，包括含具有特异性结合抗原的能力的抗原结合区域的多肽的部分。在一个实施方案中，抗原结合片段可选自由scFv、(scFv)2、Fab、Fab'和F(ab')2组成的组，但不限于此。
在抗原结合片段中，Fab包括轻链和重链可变区、轻链恒定区和第一重链恒定区CH1，包括一个抗原结合位点。
Fab'片段不同于Fab片段，在于Fab'包括在CH1的C-末端具有至少一个半胱氨酸残基的铰链区。
F(ab')2抗体通过Fab'片段的铰链区中的半胱氨酸残基的二硫桥形成。Fv是最小的抗体片段，仅具有一个重链可变区和轻链可变区。生成Fv片段的重组技术是本领域中熟知的。
两链Fv包括由非共价键连接的重链可变区和轻链可变区。单链Fv通常包括由经由肽接头的共价键连接或在C末端连接的重链可变区和轻链可变区以具有如两链Fv一样的二聚体结构。肽接头可以是多肽，包括约1至约100个氨基酸或约2至约50个氨基酸，其中氨基酸可选自任何氨基酸，不受限制。
抗原结合片段可利用蛋白酶而获得(例如，Fab片段可通过利用木瓜蛋白酶对整个抗体的限制性裂解来获得，F(ab')2片段可通过利用木瓜蛋白酶来裂解)，或通过利用基因工程重组技术来制备。
如本文所用的术语“铰链区”指抗体的重链中的CH1和CH2结构域之间的区域，其提供抗原结合位点的柔性。
当动物抗体经历嵌合化过程时，可利用人IgG1铰链或IgG2铰链来替代动物来源的IgG1铰链，而两个重链之间的二硫桥减少至三个至两个。此外，动物来源的IgG1铰链比人IgG1铰链短。因此，改变了铰链的刚性。因此，铰链区的修饰可带来人源化的抗体的抗原结合效率的提高。通过氨基酸缺失、添加或置换对铰链区的修饰是本领域技术人员熟知的。
在一个实施方案中，抗c-Met抗体或其抗原结合片段可通过删除、***、添加或置换铰链区的氨基酸序列的至少一个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)氨基酸残基来修饰，从而表现出增强的抗原结合效力。例如，抗体可包括含SEQ IDNO:100(U7-HC6)、101(U6-HC7)、102(U3-HC9)、103(U6-HC8)或104(U8-HC5)的氨基酸序列的铰链区，或含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的铰链(未修饰的人铰链)。优选地，铰链区包括SEQ ID NO:100或101的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗c-Met抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可通过于2009年10月6日保藏于韩国首尔市钟路区仁寺洞的国际保藏机构韩国细胞系研究基金会，保藏编号为KCLRF-BP-00220，能特异性结合c-Met蛋白胞外域的杂交瘤细胞系来产生(参照韩国专利公开第2011-0047698号，其全部公开内容通过引用并入本文)。抗c-Met抗体可包括韩国专利公开第2011-0047698号中限定的全部抗体。
在抗c-Met抗体中，轻链和重链部分除CDR、轻链可变区和重链可变区的其余部分，例如，轻链恒定区和/或重链恒定区可来自免疫球蛋白的任何亚型(例如，IgA、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM等)。
以进一步举例的方式，抗c-Met抗体可包括或基本上由以下组成：
(a)重链，包括选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:62的氨基酸序列(其中来自第1位至第17位的氨基酸残基的氨基酸序列是信号肽)，来自SEQ ID NO:62的第18位至第462位的氨基酸序列，SEQ ID NO:64的氨基酸序列(其中来自第1位至第17位的氨基酸序列是信号肽)，来自SEQ ID NO:64的第18位至第461位的氨基酸序列，SEQ ID NO:66的氨基酸序列(其中来自第1位至第17位的氨基酸序列是信号肽)和来自SEQ ID NO:66的第18位至第460位的氨基酸序列；和
(b)轻链，包括选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:68的氨基酸序列(其中来自第1位至第20位的氨基酸序列是信号肽)，来自SEQ ID NO:68的第21位至第240位的氨基酸序列，SEQ ID NO:70的氨基酸序列(其中来自第1位至第20位的氨基酸序列是信号肽)，来自SEQ ID NO:70的第21位至第240位的氨基酸序列，和SEQ ID NO:108的氨基酸序列。
例如，抗c-Met抗体可选自由以下组成的组：
(i)抗体，包括以下：(a)重链，包括SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62的第18位至第462位的氨基酸序列，和(b)轻链，包括SEQ ID NO:68的氨基酸序列或SEQ IDNO:68的第21位至第240位的氨基酸序列；
(ii)抗体，包括以下：(a)重链，包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64的第18位至第461位的氨基酸序列，和(b)轻链，包括SEQ ID NO:68的氨基酸序列或SEQ IDNO:68的第21位至第240位的氨基酸序列；
(iii)抗体，包括以下：(a)重链，包括SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66的第18位至第460位的氨基酸序列，和(b)轻链，包括SEQ ID NO:68的氨基酸序列或SEQ IDNO:68的第21位至第240位的氨基酸序列；
(iv)抗体，包括以下：(a)重链，包括SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62的第18位至第462位的氨基酸序列，和(b)轻链，包括SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ IDNO:70的第21位至第240位的氨基酸序列；
(v)抗体，包括以下：(a)重链，包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64的第18位至第461位的氨基酸序列，和(b)轻链，包括SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ IDNO:70的第21位至第240位的氨基酸序列；
(vi)抗体，包括以下：(a)重链，包括SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62的第18位至第462位的氨基酸序列，和(b)轻链，包括SEQ ID NO:108的氨基酸序列；
(vii)抗体，包括以下：(a)重链，包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64的第18位至第461位的氨基酸序列，和(b)轻链，包括SEQ ID NO:108的氨基酸序列；和
(viii)抗体，包括以下：(a)重链，包括SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66的第18位至第460位的氨基酸序列，和(b)轻链，包括SEQ ID NO:108的氨基酸序列。
包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的多肽是含人kappa(κ)恒定区的轻链，和包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的多肽是通过用酪氨酸替代含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的多肽的第62位(对应于根据kabat编号的SEQ ID NO:68的第36位)的组氨酸获得的多肽。抗体的产量可通过替代来提高。含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的多肽是通过用色氨酸替代SEQ ID NO:108的多肽的第32位的丝氨酸获得的多肽(对应于SEQ ID NO:68的第52位，其对应于在来自SEQ ID NO:68的第21位至第240位氨基酸残基的氨基酸序列中根据kabat编号的第27e位)。通过这样的替代，抗体和包括这样的序列的抗体片段表现出增高的活性，比如c-Met结合亲和力、c-Met降解活性、Akt磷酸化抑制和类似的活性。
在另一个实施方案中，抗c-Met抗体可包括含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的轻链互补决定区，含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的轻链可变区或含SEQ ID NO:108的轻链。
c-Met抑制剂可与药学上可接受的载体一起应用(施用)。药学上可接受的载体可以是常用于配制抑制剂(例如，抗体)的那些，其可以是选自下组的一个或多个：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、***树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯酸酯、丙基羟基苯酸酯、云母、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。c-Met抑制剂可进一步包括选自下组的一种或多种：润滑剂、湿润剂、增甜剂、增味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。
c-Met抑制剂可口服施用或胃肠外施用。胃肠外施用可选自下组：静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、内皮施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用和直肠施用。因为口服施用导致蛋白或肽的吸收，可包覆或配制用于口服施用的c-Met抑制剂以防止胃中的消化。此外，c-Met抑制剂可利用能够将活性物质递送到靶细胞的任意装置。
如本文所用的，术语“药学有效量”可指活性成分的量可发挥药学上显著作用。用于单一剂量的药学上有效量的c-Met抑制剂可以多种方式来开处方，取决于以下因素，比如配制方法、施用方式、患者年龄、患者体重、患者性别、患者疾病状况、饮食、施用时间、施用间隔、施用途径、***速度和反应灵敏性。例如，用于单一剂量的药学上有效量的c-Met抑制剂可以在0.001至100mg/kg或0.02至10mg/kg的范围，但不限于此。可将用于单一剂量的药学上有效量以单位剂量形式配制成单一制剂，或以适宜分开的剂量形式来配制，或可制造其以含于多剂量容器中。
c-Met抑制剂可用于预防和/或治疗癌症。癌症可与c-Met的过表达和/或异常激活相关联。癌症可以是实体癌或血癌，癌症可以是，但不限于，选自由以下组成的组的一种或多种：鳞状性别癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼球中的黑素瘤、直肠癌、***附近的癌症、食道癌、小肠肿瘤、内分泌腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞瘤、肝细胞瘤、胃癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质母细胞瘤、子***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞腺瘤、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺瘤、肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、头颈癌、脑癌、骨肉瘤，和类似物。癌症可以是原发癌或转移癌。癌症可以是c-Met抑制剂(例如，抗c-Met抗体)抗性的癌症。
癌症的预测和/或治疗可通过c-Met抑制剂的选自以下的至少一种作用来实现：癌细胞死亡、癌细胞增殖的抑制、迁移的抑制、侵入的抑制或癌症的转移的抑制、与癌症相关的症状的改善，等。
能够预测和/或监控c-Met抑制剂的效力的生物标志物可导致c-Met抑制剂的治疗作用的改善，并能够提供对于个体患者优化的定制治疗，从而提高了治疗效力。
实施例
下文将通过实施例详细地描述本发明。
以下的实施例旨在阐释本发明而不应理解为限制本发明。
参考例1:抗c-Met抗体的构建
1.1.生产“AbF46”，一种针对c-Met的小鼠抗体
1.1.1.小鼠的免疫
为获得生成杂交瘤细胞系所需的免疫小鼠，5只4-6周龄的BALB/c小鼠(JapanSLC,Inc.)各自经腹膜内注射100μg人c-Met/Fc融合蛋白(R&DSystems)和1倍体积的完全弗氏佐剂的混合物。注射的两周后，对相同小鼠第二次腹膜内注射50μg人c-Met/Fc蛋白和1倍体积不完全弗氏佐剂的混合物。在第二次免疫的一周后，免疫应答被末次加强。三天后，从小鼠尾部取血并将血清以1/1000稀释于PBS中，并用于通过ELISA检查抗体对c-Met的效价。选择有足够抗体效价的小鼠用于细胞融合过程。
1.1.2.细胞融合和杂交瘤的生成
在细胞融合的三天前，BALB/c小鼠(Japan SLC,Inc.)经腹膜内注射50μg人c-Met/Fc融合蛋白和1倍体积PBS的混合物而免疫。将免疫小鼠麻醉，然后将脾脏从左侧身体切除。将脾脏过筛以分离脾细胞，然后将脾细胞悬浮于培养基(DMEM,GIBCO,Invitrogen)中。离心该细胞悬浮液以回收细胞层。将所获得的脾细胞(1x108细胞)与骨髓瘤细胞(Sp2/0)(1x108细胞)混合，然后自旋以得到细胞沉淀(pellet)。将该细胞沉淀缓慢地悬浮，用含45％聚乙二醇(PEG)(1mL)的DMEM在37℃处理1分钟，补加1mL DMEM。在10分钟内向这些细胞中添加10mL DMEM，然后在37℃水浴中温育5分钟。将细胞体积调整至50mL，然后离心。将所形成的细胞沉淀以密度为1～2×105细胞/mL再悬浮于选择培养基(HAT培养基)中，给96孔板的每个孔分配0.1mL细胞悬浮液，随后在37℃在CO2培养箱中温育，以建立杂交瘤细胞群。
1.1.3.选择产生针对c-Met蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞
用人c-Met/Fc融合蛋白和人Fc蛋白作为抗原，通过ELISA，从参考例1.1.2所建立的杂交瘤细胞群中筛选对c-Met蛋白显示特异性应答的杂交瘤细胞。
将人c-Met/Fc融合蛋白以50μL(2μg/mL)/孔的量接种于微量滴定板，使其附着于每个孔的表面。通过洗涤除去仍未结合的抗体。为了用于选择不结合c-Met但识别Fc的抗体，以相同的方式将人Fc蛋白附着于微滴板表面。
将参考例1.1.2所获得的杂交瘤细胞培养物以50μL的量添加至所述板的各孔中并培养1小时。使用足量的Tris缓冲盐水和吐温20(TBST)洗出仍未反应的细胞。将山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)添加至所述板并在室温培养1小时。使用足量的TBST洗涤所述板，随后将过氧化物酶与底物(OPD)反应。在ELISA读数器上测量450nm处的吸光度。
重复地选择出分泌特异性地并强烈地结合人c-Met但不结合人Fc的抗体的杂交瘤细胞系。在经重复选择获得的杂交瘤细胞系中，通过有限稀释最终分离出产生单克隆抗体的单个克隆。根据布达佩斯条约，所述产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系的单个克隆于2009年10月9日保藏于韩国细胞系研究基金会(Korean Cell Line Research Foundation)，一家位于Yungun-Dong,Jongno-Gu,Seoul,Korea的国际保藏单位，保藏号为KCLRF-BP-00220(参考韩国专利公开(Laid-Open Publication)2011-0047698)。
1.1.4.单克隆抗体的产生和纯化
将参考例1.1.3中获得的杂交瘤细胞系培养于无血清培养基中，并从该细胞培养物中产生和纯化单克隆抗体(AbF46)。
首先，将于补充有10％(v/v)FBS的50ml培养基(DMEM)中培养的杂交瘤细胞离心，细胞沉淀用20ml PBS洗涤两次或更多次以从中除去FBS。然后将细胞再悬浮于50mL DMEM中，37℃在CO2培养箱中培养3天。
通过离心除去细胞后，上清液在4℃保存备用或者立即用于抗体的分离和纯化。使用配备有亲和柱(G蛋白琼脂糖柱；Pharmacia，USA)的AKTAsystem(GE Healthcare)从50-300mL上清液中纯化抗体，然后使用过滤器(Amicon)浓缩。将抗体贮存在PBS溶液中，以备下述实施例所用。
1.2.构建chAbF46，一种针对c-Met的嵌合抗体
小鼠抗体易于在人中激发免疫原性。为了解决该问题，用人IgG1抗体的氨基酸序列替换恒定区而不是对抗体特异性负责的可变区，从而从参考例1.1.4所产生的小鼠抗体AbF46构建嵌合抗体chAbF46。
为此，将基因设计成包括重链核苷酸序列“EcoRI-信号序列-VH-NheI-CH-TGA-XhoI”(SEQ ID NO:38)和轻链核苷酸序列“EcoRI-信号序列-VL-BsiWI-CL-TGA-XhoI”(SEQID NO:39)，并合成。然后，具有重链核苷酸序列(SEQ ID NO:38)的DNA片段和具有轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:39)的DNA片段被EcoRI(NEB,R0101S)和XhoI(NEB,R0146S)消化，然后被分别克隆至OptiCHOTM抗体表达试剂盒(目录号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVECTM-TOPO TA克隆试剂盒中，和克隆至pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(目录号8300-01)中。
所构建的载体每一个都用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增，并用FreestyleTM MAX 293表达***(invitrogen)进行瞬时表达。293F细胞用于表达并以悬浮培养的方式在FreeStyleTM293表达培养基中培养。在瞬时表达的前一天，以5x105细胞/ml的浓度提供细胞，24小时后，当细胞数目达到1x106细胞/ml时，进行瞬时表达。通过脂质体试剂法使用FreestyleTM MAX试剂(invitrogen)进行转染，其中在一个15ml管中，将1:1的DNA混合物(重链DNA:轻链DNA)与2ml OptiProTMSFM(invitrogen)混合(A管)，在另一15ml管中，100μl(微升)FreestyleTM MAX试剂和2ml OptiProTMSFM混合(B管)，随后将A管和B管混合并保温15分钟。将所获得的混合物与瞬时表达前一天提供的细胞缓慢混合。在结束转染后，将细胞在37℃、80％湿度和8％CO2的条件下在130rpm培养箱中培养5天。
然后将细胞在37℃和5％CO2条件下在补充有10％(v/v)FBS的DMEM中培养5小时，然后在37℃好5％CO2条件下在无FBS的DMEM中培养48小时。
离心后，将上清液应用于AKTA prime(GE Healthcare)以纯化抗体。为此，将100mL上清液以5mL/min的流速上样至配备有蛋白A柱的AKTAPrime(GE healthcare,17-0405-03)，随后用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)进行洗脱。将所述缓冲液与PBS交换，以纯化嵌合抗体AbF46(以下称为“chAbF46”)。
1.3.从嵌合抗体chAbF46构建人源化抗体huAbF46
1.3.1.重链的人源化
为设计H1-重链和H3-重链这两个域，分析了与参考例1.2中纯化的小鼠抗体AbF46的VH基因享有最高同一性/同源性的人种系基因。一项Ig BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/ igblast/)结果显示，VH3-71在氨基酸水平具有83％的同一性/同源性。小鼠抗体AbF46的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3根据Kabat编号法定义。设计将小鼠抗体AbF46的CDR引入VH3-71的框架中。于是，在位置30(S→T)、48(V→L)、73(D→N)和78(T→L)处进行了小鼠AbF46的氨基酸序列的回复突变。然后，H1进一步在位置83(R→K)和84(A→T)处突变，以最终建立H1-重链(SEQ ID NO:40)和H3-重链(SEQ ID NO:41)。
为了设计H4-重链，通过BLAST搜索分析多个人抗体框架。结果显示，已知的最稳定的VH3亚型在框架和序列方面与小鼠抗体AbF45非常相似。小鼠抗体AbF46的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3根据Kabat编号法定义并被引入至VH3亚型以构建H4-重链(SEQ ID NO:42)。
1.3.2.轻链的人源化
为设计H1-轻链(SEQ ID NO:43)和H2-轻链(SEQ ID NO:44)两种结构域，分析了与小鼠抗体AbF46的VH基因享有最高同一性/同源性的人种系基因。Ig BLAST搜索结果显示，VK4-1在氨基酸水平具有75％的同一性/同源性。小鼠抗体AbF46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3根据Kabat编号法定义。设计将小鼠抗体AbF46的CDR引入VK4-1的框架中。于是，在位置36(Y→H)、46(L→M)和49(Y→I)处进行了小鼠AbF46的氨基酸序列的回复突变。H2-轻链仅在位置49(Y→I)处进行一个回复突变。
为了设计H3-轻(SEQ ID NO:45)，通过BLAST搜索分析了多个与小鼠抗体AbF46的VL基因享有最高同一性/同源性的人种系基因。结果，选择了VK2-40。发现小鼠抗体AbF46的VL与VK2-40在氨基酸水平具有61％的同一性/同源性。所述小鼠抗体的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3根据Kabat编号法定义并被引入至VK2-40的框架中。在H3-轻的位置36(Y→H)、46(L→M)和49(Y→I)处进行回复突变。
为了用于设计H4-轻链(SEQ ID NO:46)，分析了多个人抗体框架。BLAST搜索显示，已知的最稳定的Vk1亚型在框架和序列方面与小鼠抗体AbF46非常相似。小鼠抗体AbF46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3根据Kabat编号法定义并被引入至Vk1亚型中。于是，在H4-轻链的位置36(Y→H)、46(L→M)和49(Y→I)处进行回复突变。
此后，具有重链核苷酸序列(H1-重链:SEQ ID NO:47，H3-重链:SEQ ID NO:48，H4-重链:SEQ ID NO:49)的DNA片段和具有轻链核苷酸序列(H1-轻链：SEQ ID NO:50，H2-轻链：SEQ ID NO:51，H3-轻链：SEQ ID NO:52，H4-轻链：SEQ ID NO:53)的DNA片段经EcoRI(NEB,R0101S)和XhoI(NEB,R0146S)消化，然后被分别克隆至OptiCHOTM抗体表达试剂盒(目录号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVECTM-TOPO TA克隆试剂盒中，和克隆至pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(目录号8300-01)中，从而构建多个重组载体以表达人源化抗体。
所构建的载体每一个都用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增，并用FreestyleTM MAX 293表达***(invitrogen)进行瞬时表达。293F细胞用于表达并以悬浮培养的方式在FreeStyleTM293表达培养基中培养。在瞬时表达的前一天，以5x105细胞/ml的浓度提供细胞，24小时后，当细胞数目达到1x106细胞/ml时，进行瞬时表达。通过脂质体试剂法使用FreestyleTM MAX试剂(invitrogen)进行转染，其中在一个15ml管中，将1:1的DNA混合物(重链DNA:轻链DNA)与2ml OptiProTMSFM(invitrogen)混合(A管)，在另一15ml管中，100μl(微升)FreestyleTM MAX试剂和2ml OptiProTMSFM混合(B管)，随后将A管和B管混合并保温15分钟。将所获得的混合物与瞬时表达前一天提供的细胞缓慢混合。在结束转染后，将细胞在37℃、80％湿度和8％CO2的条件下在130rpm培养箱中培养5天。
离心后，将上清液应用于AKTA prime(GE Healthcare)以纯化抗体。为此，将100mL上清液以5mL/min的流速上样至配备有蛋白A柱的AKTA Prime(GE healthcare,17-0405-03)，随后用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)进行洗脱。将所述缓冲液与PBS交换，以纯化人源化抗体AbF46(以下称为“huAbF46”)。以下实施例中所用的人源化抗体huAbF46包括H4-重链(SEQ ID NO:42)和H4-轻链(SEQ ID NO:46)的组合。
1.4.构建huAbF46抗体的scFV文库
为了用于从huAbF46抗体的重链和轻链可变区构建huAbF46抗体的scFV，将一个基因设计成对于每个重链和轻链可变区具有“VH-连接子-VL”的结构，该连接子具有氨基酸序列“GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS”(SEQ ID NO:54)。在Bioneer中合成编码所设计的huAbF46的scFV的多核苷酸序列(SEQ ID NO:55)并且该多核苷酸的表达载体具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列。
表达之后，发现产物表现出对c-Met的特异性。
1.5.构建用于亲和力成熟的文库基因
1.5.1.靶CDR的选择和引物的合成
实现了huAbF46的亲和力成熟。首先，根据Kabat编号定义了六个互补决定区(CDR)。CDR在以下表2中示出。
表2
CDR 氨基酸序列
CDR-H1 DYYMS(SEQ ID NO:1)
CDR-H2 FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO:2)
CDR-H3 DNWFAY(SEQ ID NO:3)
CDR-L1 KSSQSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:10)
CDR-L2 WASTRVS(SEQ ID NO:11)
CDR-L3 QQSYSAPLT(SEQ ID NO:12)
为了将随机序列引入抗体的CDR中，如下设计引物。通常，使用N密码子以相同的比例(25％A,25％G,25％C,25％T)将碱基引入所需的突变位点。在本实验中，以如下方式将随机碱基引入至huAbF46的CDR中：在编码每个CDR的野生型多核苷酸中，对于每个密码子的三个核苷酸而言，第一和第二核苷酸在整个序列的85％中是保守的，而另外三个核苷酸以相同的百分数(各为5％)引入，并且向该第三个核苷酸赋予了相同的可能性(33％G、33％C、33％T)。
1.5.2.huAbF46抗体文库的构建和对c-Met的亲和力
使用以与参考例1.5.1相同的方式合成的引物通过引入随机序列进行抗体基因文库的构建。使用覆盖huAbF46scFV的多核苷酸作为模板，获得两种PCR产物，对它们实施重叠延伸PCR，以得到huAbF46抗体(其中仅所需的CDR是突变的)的多个scFV文库基因。对于从所述scFV文库基因制备的6个CDR，构建靶向它们中的每一个的文库。
每个文库对c-Met的亲和力与野生型的亲和力相比较。与野生型相比，大多数文库对c-Met的亲和力较低。在一些突变体中对c-Met的亲和力得到保留。
1.6.从文库中选择具有提高的亲和力的抗体
在对构建的文库进行了c-Met亲和力成熟后，分析来自每个克隆的scFv的核苷酸序列。如此获得的核苷酸序列汇总于表3，并且将其转化成IgG形式。在随后的实验中使用分别从克隆L3-1、L3-2、L3-3、和L3-5生成的4种抗体。
表3
克隆 构建的文库 CDR序列
H11-4 CDR-H1 PEYYMS(SEQ ID NO:22)
YC151 CDR-H1 PDYYMS(SEQ ID NO:23)
YC193 CDR-H1 SDYYMS(SEQ ID NO:24)
YC244 CDR-H2 RNNANGNT(SEQ ID NO:25)
YC321 CDR-H2 RNKVNGYT(SEQ ID NO:26)
YC354 CDR-H3 DNWLSY(SEQ ID NO:27)
YC374 CDR-H3 DNWLTY(SEQ ID NO:28)
L1-1 CDR-L1 KSSHSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:29)
L1-3 CDR-L1 KSSRSLLSSGNHKNYLA(SEQ ID NO:30)
L1-4 CDR-L1 KSSKSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:31)
L1-12 CDR-L1 KSSRSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:32)
L1-22 CDR-L1 KSSHSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:33)
L2-9 CDR-L2 WASKRVS(SEQ ID NO:34)
L2-12 CDR-L2 WGSTRVS(SEQ ID NO:35)
L2-16 CDR-L2 WGSTRVP(SEQ ID NO:36)
L3-1 CDR-L3 QQSYSRPYT(SEQ ID NO:13)
L3-2 CDR-L3 GQSYSRPLT(SEQ ID NO:14)
L3-3 CDR-L3 AQSYSHPFS(SEQ ID NO:15)
L3-5 CDR-L3 QQSYSRPFT(SEQ ID NO:16)
L3-32 CDR-L3 QQSYSKPFT(SEQ ID NO:37)
1.7.将选择的抗体转化为IgG
将编码4种所选抗体的重链的相应多核苷酸设计为具有“EcoRI-信号序列-VH-NheI-CH-XhoI”(SEQ ID NO:38)的结构。这些huAbF46抗体的重链照原样使用，因为它们的氨基酸在亲和力成熟期间没有变化。然而，在铰链区的情况中，采用U6-HC7铰链(SEQ IDNO:57)代替人IgG1的铰链。将轻链基因设计为具有“EcoRI-信号序列-VL-BsiWI-CL-XhoI”的结构。编码经过亲和力成熟而选出的4种抗体的轻链可变区的多肽在Bioneer中合成。然后，将具有重链核苷酸序列的DNA片段(SEQ ID NO:38)和一组具有轻链核苷酸序列的DNA片段(包含L3-1衍生的CDR-L3：SEQ ID NO:58的DNA片段，包含L3-2衍生的CDR-L3：SEQ ID NO:59的DNA片段，包含L3-3衍生的CDR-L3：SEQ ID NO:60的DNA片段，和包含L3-5衍生的CDR-L3：SEQ ID NO:61的DNA片段)用EcoRI(NEB,R0101S)和XhoI(NEB,R0146S)消化，之后分别克隆到OptiCHOTM抗体表达试剂盒(产品目录编号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVECTM-TOPO TA克隆试剂盒中的载体中，和克隆到pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(产品目录编号8300-01)中的载体中，从而构建用于表达亲和力成熟的抗体的重组载体。
所构建的载体每一个都用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增，并用FreestyleTM MAX 293表达***(invitrogen)进行瞬时表达。293F细胞用于表达并以悬浮培养的方式在FreeStyleTM293表达培养基中培养。在瞬时表达的前一天，以5x105细胞/ml的浓度提供细胞，24小时后，当细胞数目达到1x106细胞/ml时，进行瞬时表达。使用FreestyleTMMAX试剂(invitrogen)通过脂质体试剂法进行转染，其中在一个15ml管中，将1:1的DNA混合物(重链DNA:轻链DNA)与2ml OptiProTMSFM(invitrogen)混合(A管)，在另一15ml管中，100μl(微升)FreestyleTM MAX试剂和2ml OptiProTMSFM混合(B管)，随后将A管和B管混合并保温15分钟。将所获得的混合物缓慢地与瞬时表达前一天提供的细胞混合。在完成转染后，将细胞在130rpm培养箱中在37℃、80％湿度和8％CO2的条件下温育5天。
离心后，将上清液应用于AKTA Prime(GE Healthcare)以纯化抗体。为此，将100mL上清液以5mL/min的流速上样到装备有蛋白A柱(GE healthcare,17-0405-03)的AKTAPrime，接着用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。用PBS更换缓冲液以纯化4种亲和力成熟的抗体(下文分别称为“huAbF46-H4-A1(L3-1起源)、huAbF46-H4-A2(L3-2起源)、huAbF46-H4-A3(L3-3起源)、和huAbF46-H4-A5(L3-5起源)”)。
1.8.构建恒定区取代的和/或铰链区取代的huAbF46-H4-A1
在参考例1.7所选出的4种抗体中，发现huAbF46-H4-A1对c-Met的亲和力最高而Akt磷酸化和c-Met降解程度最低。在该抗体中，替换铰链区，或替换恒定区加铰链区。
抗体huAbF46-H4-A1(U6-HC7)由重链和轻链组成，所述重链包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、U6-HC7铰链、和人IgG1恒定区的恒定区，所述轻链包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区和人kappa恒定区。抗体huAbF46-H4-A1(IgG2铰链)由重链和轻链组成，所述重链包含重链可变区、人IgG2铰链区、和人IgG1恒定区，所述轻链包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区和人kappa恒定区。抗体huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)由huAbF46-H4-A1的重链可变区、人IgG2铰链区和人IgG2恒定区及轻链组成，所述轻链包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区和人kappa恒定区。此后，在所有三种抗体中将轻链的人kappa恒定区上第36位的组氨酸残基改变成酪氨酸，以增加抗体生成。
为了用于构建三种抗体，在Bioneer中合成多核苷酸(SEQ ID NO:63)、多核苷酸(SEQ ID NO:65)、多核苷酸(SEQ ID NO:67)、以及多核苷酸(SEQ ID NO:69)，其中，多核苷酸(SEQ ID NO:63)编码多肽SEQ ID NO:62(其包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、U6-HC7铰链区和人IgG1恒定区)，多核苷酸(SEQ ID NO:65)编码多肽SEQ ID NO:64(其包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、人IgG2铰链区和人IgG1恒定区)，多核苷酸(SEQ ID NO:67)编码多肽SEQ ID NO:66(其包含huAbF46-H4-A1的重链可变区、人IgG2铰链区和人IgG2恒定区)，多核苷酸(SEQ ID NO:69)编码多肽SEQ ID NO:68(其包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区(其中位置36处的组氨酸被酪氨酸替换)和人kappa恒定区)。然后，将具有重链核苷酸序列的那些DNA片段***OptiCHOTM抗体表达试剂盒(目录号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVECTM-TOPO TA克隆试剂盒中的载体中，而将具有轻链核苷酸序列的那些DNA片段***pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(产品目录编号8300-01)中的载体中，从而构建表达这些抗体的载体。
所构建的每一个载体都用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增，并用FreestyleTM MAX 293表达***(invitrogen)进行瞬时表达。293F细胞用于表达并以悬浮培养的方式在FreeStyleTM293表达培养基中培养。在瞬时表达的前一天，以5x105细胞/ml的浓度提供细胞，24小时后，当细胞数目达到1x106细胞/ml时，进行瞬时表达。使用FreestyleTMMAX试剂(invitrogen)通过脂质体试剂法进行转染，其中在一个15ml管中，将1:1的DNA混合物(重链DNA:轻链DNA)与2ml OptiProTMSFM(invitrogen)混合(A管)，在另一15ml管中，100μl(微升)FreestyleTM MAX试剂和2ml OptiProTMSFM混合(B管)，随后将A管和B管混合并保温15分钟。将所获得的混合物缓慢地与瞬时表达前一天提供的细胞混合。在完成转染后，将细胞在130rpm培养箱中在37℃、80％湿度和8％CO2的条件下温育5天。
离心后，将上清液应用于AKTA Prime(GE Healthcare)以纯化抗体。为此，将100mL上清液以5mL/min的流速上样到装备有蛋白A柱(GE healthcare,17-0405-03)的AKTAPrime，接着用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。用PBS更换缓冲液以最终纯化3种抗体(huAbF46-H4-A1(U6-HC7)、huAbF46-H4-A1(IgG2铰链)、和huAbF46-H4-A1(IgG2Fc))。在三种抗体中，代表性地选出huAbF46-H4-A1(U6-HC7)和huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)进行以下实施例，并分别称作抗-c-Met抗体L3-1Y和L3-1Y/IgG2。
实施例1：利用IL-8预测和评估抗-c-Met抗体的效力
1.1.在移植了癌细胞的小鼠模型中用IL-8预测和评估抗-c-Met抗体效力的试验
1.1.1.移植了癌细胞的小鼠模型的构建
给小鼠移植各种常规癌细胞系(Lovo,HT-29、EBC-1、MKN45和Hs746T)，制得异种移植小鼠模型，以便在预测和评估抗-c-Met抗体效力的试验中使用。
简言之，将人结直肠癌细胞系HT 29(ATCCHTB-38)或Lovo(ATCCCCL-229)以5x106个细胞的剂量皮下(s.c.)注射到BALB/C裸鼠(4-5周龄，雄鼠；上海SLAC实验室动物有限公司)以构建异种移植的小鼠模型。对于模型构建，将15个小鼠分配至每组。同样，以相同的方式使用人胃癌细胞系Hs746T(ATCC HTB-135)和MKN45(ATCC RCB1001)，以及人非小细胞癌细胞系EBC-1(ATCC JCRB0820)来构建异种移植小鼠模型。
即，构建了分别移植Lovo、HT-29、EBC-1、Hs746T和MKN45的小鼠模型，并将其用于以下的实验中。
1.1.2.用IL-8预测抗c-Met抗体在移植了癌细胞的小鼠模型中的效力
在将参考例1中制备的抗-c-Met抗体L3-1Y/IgG2施用于实施例1.1.1中构建的Lovo、HT-29、EBC-1、MKN45或Hs746T移植的小鼠模型之后，测量肿瘤尺寸以鉴定对L3-1Y/IgG2有反应(反应者；有效的抗癌活性)和无反应(无反应者；无抗癌活性)的组。
简言之，在移植后7-10天，将抗c-Met抗体注射到实施例1.1.1所建小鼠模型的每个组。注射经由静脉内途径以7天的规律间隔进行，持续4周。每两周测量肿瘤体积并记录。给对照注射PBS。抗c-Met抗体以0.2、1、5或10mg/kg的剂量注射于HT29或Lovo移植的组，以0.03、0.1、0.3、1.0、3.0或10.0mg/kg的剂量注射于EBC-1、MKN45或Hs746T移植的组。结果显示于图1A至1E(1a：Lovo，1b：HT29，1c：EBC-1，1d：Hs746T，1e：MKN45)。图1A至1E仅显示了对照PBS组和代表性的抗c-Met抗体组的结果(HT29、Lovo、MKN45、EBC-1和Hs746T模型，前三组以5mg/kg的剂量来注射，其余两组以3mg/kg的剂量来注射)。抗体注射或安乐死的时间点由箭头示出。如图1A至1E中所见，L3-1Y/IgG2的抗癌效力在Lovo或HT-29移植的小鼠模型中未检测到，但在EBC-1、Hs746T或MKN45移植的小鼠模型中出现。所以，确定Lovo和HT-29移植的小鼠模型为对L3-1Y/IgG2无反应的(无反应者组)，而EBC-1、Hs746T和MKN45移植的小鼠模型归类为反应者组。
检查了反应者组和无反应者组之间的血清IL-8水平的差异。将Lovo、HT-29、EBC-1和Hs746T移植的小鼠模型与那些对照小鼠(仅用PBS注射；以每7天100μL的剂量进行，持续4周)相比较，并研究了血清IL-8水平和对L3-1Y/IgG2的反应性之间的关联。
简言之，利用BD Cytometric Bead Array试剂盒分析了来自每个模型的对照的血清。将来自小鼠模型的血清收集到BD vacutainer SSTTM试管中。然后将试管温和颠倒5分钟进行混合，再于室温凝结30分钟。保温后，将试管放在冷冻离心机中1500xg离心10分钟，以除去凝结块。将上清转移到一个新的试管中，得到血清样品。利用人炎性细胞因子试剂盒进行了实验。根据制造商的指南，将小鼠血清在试验稀释缓冲液中进行1/4(v/v)稀释，并与生物素化的抗人IL-8抗体覆盖的珠子(BD Cytometric Bead Array(CBA)人炎性细胞因子试剂盒，#551811,BD biosciences)一起保温1.5小时。之后，从BD Cytometric Bead Array(CBA)人炎性因子试剂盒中取1mL洗涤缓冲液，与样品混合，并离心。在去除上清液之后，将残余物与该试剂盒中的链霉亲和素-PE一起保温1.5小时，与1mL的上述洗涤缓冲液相混合。离心(200g，5分钟)之后，弃去含未反应的物质的上清液。将沉淀物悬浮于200μL的洗涤缓冲液中，然后进行FACS分析(BD FACS CantoII流式细胞仪，BDBioscience)。从所获得的数据中，利用FCAP阵列程序(BD Biosciences)计算血清IL-8浓度，并通过乘以稀释倍数进行定量。
结果显示于图2中。如图2中所见，在两个反应者组中测出IL-8水平为约500pg/mL或更高，但在无反应者组中低至约50-150pg/ml。观察到反应者组的血清IL-8水平比无反应者至少高3倍。因此，预期具有高IL-8水平的癌细胞能使L3-1Y/IgG2更有效地发挥其抗癌活性。
1.1.3.用IL-8评估抗-c-Met抗体在移植了癌细胞的小鼠模型中的效力
为检查IL-8水平和针对抗c-Met抗体的反应性之间的关系，监控移植了癌细胞的小鼠模型中抗c-Met抗体治疗后的血清IL-8水平的变化。
简言之，从实施例1.1.2的小鼠异种移植模型获得血清样品，从中制备高剂量和低剂量的载剂处理样品(PBS处理，对照)和抗c-Met抗体处理样品。为此，从以0.2mg/kg和5mg/kg的剂量注射的HT29模型和Lovo模型(无反应者组)以及以1mg/kg和3mg/kg的剂量注射的EBC-1模型和Hs746T模型(反应者组)中采集血清样品，并检查抗c-Met抗体的抗癌效力和抗c-Met抗体处理之后IL-8水平的改变之间的关联。参照实施例1.1.2分析了血清IL-8水平。
结果示于图3中。由图3的数据可知，在用L3-1Y/IgG2处理之后，无反应者组与未处理组(“载剂处理”；仅用载剂PBS注射)相比，IL-8水平无显著差异或显示增高，而反应者组与未处理组相比，IL-8水平显著降低。这些数据暗示，在用L3-1Y/IgG2处理的患者中，通过测量IL-8的表达水平，可监控患者对于L3-1Y/IgG2的反应性，也即，监控L3-1Y/IgG2的效力。
1.2.在移植患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中通过测量IL-8的血清水平而预测和评估抗c-Met抗体的效力的试验
1.2.1.移植患者来源的肿瘤组织的小鼠模型的构建
为检查当IL-8应用于患者时是否可在抗c-Met抗体效力的预测或评估中用作可信赖的生物标志物，构建了移植罹患癌症(肺癌)的患者来源的肿瘤组织的小鼠模型。
在专门的公司Oncotest(Oncotest GmbH,Freibrug Germany)中进行了该实验。简言之，培养患者来源的肺癌细胞系(非小细胞肺癌(NSCLC))LXFA297、526、623、983、1041和1647并皮下注射到NMRI裸鼠(4-6周龄，雌鼠；Harlan)以构建异种移植的小鼠模型。所述构建根据Oncotest SOP"Subcutaneous implantation(皮下移植)"指南进行。每个组分配10只小鼠。移植之后，将小鼠模型随机化以降低组间平均肿瘤体积的测量偏差，然后用所述药物进行注射。按上述方法，用患者来源的胃癌细胞系GXF214和GXF251，以及患者来源的肾癌细胞系RXF488,RXF1114和RXF1220进行实验。
给这些移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型注射L3-1Y/IgG2，检验它们对于抗c-Met抗体的反应性。
简言之，为监控所述抗体的抗癌效力，定期测量肿瘤体积。在完成注射之后，用每个抗体处理组(5mg/kg，静脉内)的肿瘤体积除以对照组(注射PBS)的肿瘤体积，计算抗癌效力(％抑制＝100-(检验组的肿瘤体积/对照的肿瘤体积*100))。结果总结于表4和5中。
将L3-1Y/IgG2处理后肿瘤体积缩小30％或缩小得更多视为有统计学显著性，从而将该抗体确定为有效，并将该组确定为反应者。
表4
Figure BDA0000652961910000521
在表4中，％抑制＝100-(检验组的肿瘤体积/对照的肿瘤体积*100)
表5
Figure BDA0000652961910000522
从表4和5的数据可见，移植了肺癌细胞的小鼠模型LXFA526、LXFA623和LXFA1647，以及移植了肾癌细胞的小鼠模型RXF1114对L3-1Y/IgG2有响应(反应者)，而其它的移植了患者来源肿瘤组织的小鼠模型对抗体无反应(无反应者)。
1.2.2.用IL-8血清水平的测量结果预测抗c-Met抗体在移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中的效力
检查了反应者和无反应者之间的血清IL-8基础水平的差异。为此，从实施例1.2.1构建的小鼠模型的载剂组采集血清样品，并使用血清样品来检查与L3-1Y/IgG2的反应性的关联。
简言之，将从移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中采集的血清样品按检验组进行归类。在来自肺癌模型的6个样品、胃癌模型的2个样品、肾癌模型的3个样品中，测量了载剂处理组的IL-8水平。以实施例1.1.2中相同的方式进行IL-8水平的测量。
结果显示于图4中。如从图4中可见的，在反应者组中血清IL-8水平高于750pg/ml，但在无反应者组中该水平低于约500pg/ml。观察到反应者组的血清IL-8水平比无反应者的高至少1.5倍。因此，预期具有高IL-8水平的人癌细胞允许L3-1Y/IgG2更有效地发挥抗癌活性。
1.2.3.用IL-8血清水平的测量结果评估抗c-Met抗体在移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中的效力
为检查IL-8水平和对于抗c-Met抗体的反应性之间的关联，对移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中抗c-Met抗体处理后的血清IL-8水平变化进行监控。
简言之将从移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中采集的血清样品按检验组进行归类。在注射了抗c-Met抗体(5mg/kg，静脉内)之后的肺癌模型6个样品、胃癌模型2个样品、肾癌模型3个样品以及在对照样品(注射PBS)中测量了IL-8水平，检查了抗c-Met抗体的抗癌效力和抗c-Met抗体处理之后IL-8水平的改变之间的关联。以实施例1.1.2中相同的方式进行IL-8水平的测量。
结果显示于图5中。如从图5的数据中所理解的，在无反应者组，载剂处理和L3-1Y/IgG2处理的样品之间的血清IL-8无显著差异，而在反应者组，L3-1Y/IgG2处理之后血清IL-8水平显著降低。这些数据暗示，在用L3-1Y/IgG2处理的患者中，通过测量IL-8的表达水平，可监控患者对于L3-1Y/IgG2的反应性，也即，监控L3-1Y/IgG2的效力。
1.3.注射抗c-Met抗体之后IL-8水平随时间的变化
1.3.1.移植了癌细胞的小鼠模型的构建和对小鼠模型中抗c-Met抗体的抗癌活性的测定
在异种移植的小鼠模型中确定了作为抗c-Met抗体的药效标志物的IL-8的作用，所述异种移植模型通过移植已知对该抗体有反应的癌细胞系来制备。
与实施例1.1相反的，本实验是在肿瘤体积没什么变化的条件下检查反应性。移植之后，肿瘤增大至1000mm3，然后，以不同的剂量将所述抗体注射至小鼠模型。在注射后的不同时间，每组从三只小鼠采集血清样品和肿瘤组织。此外，以规律的时间间隔测量肿瘤体积。
简言之，采用的是移植了人胃细胞系Hs746T(编号HTB-135)或人非小细胞肺癌系EBC-1(编号JCRB0820)的异种移植小鼠模型。将每种癌细胞系以5x106个细胞的剂量皮下注射到150只Balb/c裸鼠(上海SLAC实验动物有限责任公司)。所有的实验动物为雄性，在移植时为5-6周龄，并在SPF条件下喂养。为将肿瘤增大到预定的尺寸，小鼠在移植了癌细胞之后仅16-20天时用所述药物(抗体)处理。当肿瘤增大至约1000mm3的尺寸时，将小鼠随机分到各有30个成员的几个组：PBS处理组(组1)和抗c-Met抗体处理组(组2、3和4)。各处理组按抗体剂量归类：1mg/kg(组2)、3mg/kg(组3)和10mg/kg(组4)。以7天的规律间隔施用所述抗体和载剂两次。在第一次注射之后的1小时、1天(24小时)、2天(48小时)、3天(72小时)和7天(168小时)时取样。在第二次注射之后重复相同的采样时间表：1小时(169小时)、1天(192小时)、2天(216小时)、3天(240小时)和7天(336小时)。关于采样，血清和组织是在每个时间点从处死的三只小鼠中采集。在取样时还测量了肿瘤体积以监控所述抗体的抗癌活性(PharmaLegacy Laboratories Vivarium)。
如上述获得的抗癌活性显示于图6(移植EBC-1)和图7(移植Hs746T)。
从图6和7的数据中清楚的是，抗c-Met抗体在携带EBC-1和Hs746T肿瘤的小鼠中表现出抗癌活性，并且，该抗癌活性是剂量依赖性的。
1.3.2利用IL-8的血清水平的测量结果在移植了癌细胞的小鼠模型中评估了抗c-Met抗体的效力
以下的实验利用从实施例1.3.1所得EBC-1或Hs746T移植小鼠模型采集的样品来进行。为检查抗c-Met抗体诱导的IL-8反应性是否直接反映了抗c-Met抗体效力所致的肿瘤尺寸缩小，从EBC-1或Hs746T移植小鼠模型按时间取血清样品进行分析，以测量对L3-1Y/IgG2的短期反应。
简言之，在施用抗体之后，按时从每组3只小鼠的每只中以100μL的量采集了血清样品(参见图8)。混合来自相同的组的血清样品，并利用CBA方法定量分析了IL-8水平。
结果总结于图8和9中。
如图8和9所示，血清IL-8水平在用抗c-Met抗体处理之后以剂量依赖的方式降低，在高剂量处理组(10mg/kg)中于处理后的1小时之时已降低。同时，在该时间点，在L3-1Y/IgG2处理的小鼠中肿瘤大小未显著变化(处理后1小时)。这些数据表明，血清IL-8水平的变化在体内异种移植模型中显示了对药物的反应，而不仅仅依赖于肿瘤大小。从而，可将IL-8用作表示对于抗c-Met抗体的体内反应性的早期标志物。总之，数据表明了，IL-8的反应性并不仅仅对肿瘤尺寸的变化有贡献，还可作为c-Met靶向治疗的有效生物标志物。
1.4.检验并非抗c-Met抗体的其它c-Met抑制剂的效力
验证了IL-8水平的变化是否可作为标志物用于监控对并非抗c-Met抗体的其它c-Met靶向药物的反应性。
具体地，选出EBC-1(人肺癌细胞系；编号JCRB0820)和Hs746T(人胃癌细胞系；编号HTB-135)(抗c-Met抗体反应者组)，以及Lovo(人结肠癌细胞系；编号CCL-229)和HT29(人结肠癌细胞系；编号HTB-38)(抗c-Met抗体无反应者组)进行培养，其中抗c-Met抗体L3-1Y/IgG2对EBC-1和Hs746T表现出抗癌效力，对Lovo和HT29不表现抗癌效力。将这4种细胞系以相同的量(1x104细胞/孔)接种于96孔板上并培养24小时(培养基：RPMI(Gibco,Invitrogen)，培养条件：37℃，5％CO2)。所培养的细胞用反应性c-Met抑制剂，克唑替尼(crizotinib)(Selleck chemical)和PHA665752((R,Z)-5-(2,6-二氯苯甲磺酰基)-3-((3,5-二甲基-4-(2-(吡咯烷-1-基甲基)吡咯烷-1-羰基)-1H-吡咯-2-基)亚甲基)吲哚啉-2-酮)分别处理。为进行对比，以人对照IgG(chrompure human IgG(009-000-003,JACKSONIMMUNORESEARCH LABS INC.))作为对照，还使用了抗c-Met抗体L3-1Y/IgG2(参考例)。所述的每种抑制剂(或抗体)以1000nM至0.01nM的10倍连续稀释的浓度来处理。处理的72小时后，每个处理组的细胞培养中的IL-8水平用BD Cytometric Bead Array试剂盒按Cytometric Bead Array(CBA)方法测定(参见实施例1.1.2)。此外，为验证这些c-Met抑制剂的抗癌效力，在c-Met抑制剂处理的72小时之后，通过Cell-Titer Glo(CTG)试验测量了细胞增殖(％)。
所获得的72小时之时的细胞增殖(％)(即，CTG试验)的结果显示于图20(抗c-Met抗体反应者组)和图21(抗c-Met抗体无反应者组)中。如图20和21中所示的，针对c-Met抑制剂克唑替尼或PHA665752的反应性的曲线与针对抗c-Met抗体L3-1Y/IgG2的反应性的曲线相似。即，当用克唑替尼或PHA665752处理时，在10nM或更高的抑制剂浓度，L3-1Y/IgG2反应者组中EBC-1和Hs746T细胞系的细胞增殖受到显著抑制(降低)(参见图20)，而L3-1Y/IgG2无反应者组中Lovo和HT29细胞系的细胞增殖无显著降低(参见图21)。
此外，由于从10nM浓度开始就可观察到对于这些抑制剂的反应性，因此用BDCytometric Bead Array试剂盒按Cytometric Bead Array(CBA)方法测量了每个处理组的细胞培养中的IL-8水平(参见，实施例1.1.2)，获得的结果显示于图22和23中，表示为培养基中IL-8水平(100％)的相对比率。如图22和23中所示，在表现出细胞增殖显著降低的反应者组的EBC-1和Hs746T细胞系中，IL-8水平显著降低了，而在无反应者组的Lovo和HT-29细胞系中未观察到IL-8的水平的任何显著降低。
这些结果表明，IL-8水平的降低也可以作为标志物用于评估抗c-Met抗体以及除抗c-Met抗体之外的其它c-Met抑制剂的效力。
实施例2：用bIG-H3评估抗c-Met抗体的效力
2.1.选择bIG-H3作为抗c-Met抗体的药效标志物
利用能够检测119种可溶性受体的抗体阵列膜(可以采用人可溶性受体阵列试剂盒非造血组,cat#ARY012；R&D；或者，人细胞因子试剂盒(例如,#ARY005；R&D)，选出在抗c-Met抗体处理组和未处理组因应答抗c-Met抗体所致的表达水平有显著差异的那些蛋白，作为评估抗c-Met抗体效力的可能的生物标志物。
以与实施例1.1.1中相似的方式用U87MG(编号HTB-14)构建小鼠模型，用抗c-Met抗体L3-1Y/IgG2对该小鼠模型进行处理，监控肿瘤尺寸的变化。结果显示于图10中。如图10中可见，在U87MG移植的小鼠模型中，抗c-Met抗体L3-1Y/IgG2以剂量依赖方式表现出抗癌活性。
U87MG细胞被认为对于抗c-Met抗体是有反应的，为此，在U87MG细胞中，研究了抗c-Met抗体处理组的细胞与未处理组的细胞之间蛋白表达水平的差异。
在这方面，将以与实施例1.1.1中相同方式用U87MG(编号HTB-14)构建的小鼠模型中采集的血清样品与抗体阵列膜(R&D，cat#ARY012)一起保温，以检查对于抗c-Met抗体的反应性。在膜中，将200μl的小鼠血清与缓冲液和捕捉抗体一起在4℃保温过夜，然后使膜在化学发光免疫试验中显影。在移植的7-10天后，每7天用抗体L3-1Y/IgG2以10mg/ml的剂量进行静脉内注射，共4周。
结果显示于图11中，在膜上，阳性对照点出现在角落和中央区域，检测到的显著改变以框内的点示出。发现它们是bIG-H3。与对照(PBS处理)相比，L3-1Y/IgG2显著降低了bIG-H3的表达水平。基于该发现，首次提示Big-H3可以作为抗c-Met抗体的药效标志物。
2.2.在移植了癌细胞的小鼠模型中用bIG-H3评估抗c-Met抗体的效力
2.2.1.构建移植了癌细胞的小鼠模型
为了在评估抗c-Met抗体效力的试验中使用，以与实施例1.1.1相同的方式给小鼠移植下列癌细胞系，从而制得异种移植小鼠模型：抗c-Met抗体无反应性细胞系：Lovo(编号CCL-229)、HT-29(编号HTB-38)、PC3(编号CRL-1435)、BxPC3(编号CRL-1687)、MDAMB231(编号HTB-26)；抗c-Met抗体反应性细胞系：Hs746T(编号HTB-135)、MKN45(编号RCB1001)、EBC-1(编号JCRB0820)、U87MG(编号HTB-14)、MHCC97H(编号NB100-122)。
在这些小鼠模型中，发现Hs746T、MKN45和EBC-1移植的小鼠模型对于抗c-Met抗体有反应性，如实施例1.1.2中所证明的。
2.2.2.用bIG-H3在移植了癌细胞的小鼠模型中评估抗c-Met抗体的效力
为检查bIG-H3水平与抗c-Met抗体反应性之间的关联，移植了癌细胞的小鼠模型用抗c-Met抗体处理后，对小鼠血清bIG-H3水平的变化进行监控。
简言之，从每组的多个小鼠模型中采集血清样品并混合，用bIG-H3ELISA试剂盒(R&D)定量分析bIG-H3水平，并与对照(仅注射载剂(PBS))相比较。更具体地，将来自小鼠模型的血清收集到BD vacutainer SSTTM试管中。然后将试管温和颠倒5分钟进行混合，再于室温凝结30分钟，接着将试管在1000xg离心15分钟，得到血清。在每一次ELISA测定中，用MIF(R&D,DMF00B)和IG-H3(R&D,DY2935)ELISA试剂盒按以下的说明书操作进行测定。简言之，将100ul实验稀释剂RD1-53加到每孔中。在包被过的平板的每孔中加入50ul血清样品，室温保温2小时。洗涤后，每孔加入200ul抗体偶联物，保温2小时，加入底物溶液后，再保温30分钟。用微滴板读数仪读取450nm处的波长。
结果显示于图12中。如从图12的数据中所理解的，无反应者组用L3-1Y/IgG2处理之后，与未处理组(仅注射载剂PBS)相比，bIG-H3表达水平无显著性差异或bIG-H3表达水平增高，而反应者组bIG-H3表达水平比未处理组显著降低或表达很少的bIG-H3。这些数据暗示，在用L3-1Y/IgG2处理的患者中，通过测量bIG-H3的表达水平，可监控患者对L3-1Y/IgG2的反应性，即，监控L3-1Y/IgG2的效力。
2.3.利用bIG-H3在移植患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中评估抗c-Met抗体的效力
2.3.1.移植患者来源的肿瘤组织的小鼠模型的构建
参照实施例1.2.1，构建移植了患者来源的肺癌细胞的小鼠模型LXFA297、LXFA526、LXFA623、LXFA983、LXFA1041和LXFA1647。其中，观察到LXFA526、LXFA623和LXFA1647对于抗c-Met抗体为反应性的，如表4中所示。
2.3.2.利用bIG-H3在移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中评估抗c-Met抗体的效力
为检查bIG-H3水平与抗c-Met抗体反应性之间的关联，移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型用抗c-Met抗体处理后，对小鼠血清bIG-H3水平的变化进行监控。
简言之，从每组的多个小鼠模型中采集血清样品并混合，以与实施例2.2.2相同的方式(参照实施例1.1.2)，用bIG-H3ELISA试剂盒(R&D)定量分析bIG-H3水平，并与对照(仅注射载剂(PBS))相比较。
结果显示于图13中。如从图13的数据中所理解的，无反应者组用L3-1Y/IgG2处理之后，与未处理组(仅注射载剂PBS)相比，bIG-H3表达水平无显著性差异或bIG-H3表达水平增高，而反应者组bIG-H3表达水平比未处理组显著降低或表达很少的bIG-H3。这些数据暗示，在用L3-1Y/IgG2处理的患者中，通过测量bIG-H3的表达水平，可监控患者对L3-1Y/IgG2的反应性，即，监控L3-1Y/IgG2的效力。
从L3-1Y/IgG2处理组或未处理组的动物模型中分离癌组织，匀浆后，在500μl的裂解缓冲液(Roche)中裂解。离心之后，收获细胞液(cell soup)(细胞裂解物)并进行定量。以对应于1μg细胞总蛋白的量将细胞液装载于bIG-H3ELISA试剂盒(R&D)的试验板中。所述板先前已用bIG-H3捕捉抗体包被。将HRP偶联的检测抗体添加到板上，然后读取O.D 450值。
结果显示于图14中。如在图14中可见的，从细胞液中还观察到，反应者的抗体处理组与未处理组相比，1μg细胞总蛋白中的bIG-H3含量显著降低了。
实施例3：用MIF评估抗c-Met抗体的效力
3.1.选择MIF作为抗c-Met抗体的药效标志物
利用能够检测46种细胞因子的抗体阵列膜(R&D，ARY005)，选出在对抗c-Met抗体有反应的LXFA623小鼠模型的抗c-Met抗体处理组和未处理组之间表达水平有差异的蛋白，作为评估抗c-Met抗体效力的标志物。
简言之，从LXFA623小鼠模型的抗体处理组(L3-1Y/IgG2，5mg/kg)和未处理组(注射PBS，对照)采集血清样品，每份样品取200μl与所述试剂盒中提供的缓冲液一起在4℃保温过夜，然后在化学发光免疫测定中使那些点显影。利用抗体阵列膜(R&D ARY005)进行该实验。
结果显示于图15中。在图15的膜上，与对照(注射PBS)相比较，L3-1Y/IgG2显著降低了MIF的水平，表明MIF可用作抗c-Met抗体的药效标志物。
3.2.用MIF在移植了癌细胞的小鼠模型中评估抗c-Met抗体的效力
以与实施例2.2.1中相同的方式，通过移植不同的癌细胞系构建了异种移植的小鼠模型：(无反应者：Lovo(编号CCL-229)、HT-29(编号HTB-38)、PC3(编号CRL-1435)、BxPC3(编号CRL-1687)、MDAMB231(编号HTB-26)；反应者：Hs746T(编号HTB-135)、MKN45(编号RCB1001)、EBC-1(编号JCRB0820)、U87MG(编号HTB-14)、MHCC97H(编号NB100-122))。
为检查MIF水平和对于抗c-Met抗体的反应性之间的关联，在移植了癌细胞的小鼠模型用抗c-Met抗体处理后，监控MIF水平的变化。
简言之，将从异种移植动物模型的每个组，例如，L3-1Y/IgG2处理组或未处理组(注射PBS，对照)的小鼠模型中采集的血清样品混合，用MIFELISA试剂盒(R&D)定量分析MIF水平。根据制造商的手册进行了实验。
结果显示于图16中。如从图16中的数据中所理解的，无反应者组经L3-1Y/IgG2处理后，与未处理组(仅注射载剂PBS)相比，MIF表达水平无显著差异或MIF表达水平增高，而反应者组相较于未处理组在MIF表达水平上显著降低了，或表达很少的MIF。这些数据暗示，在用L3-1Y/IgG2处理的患者中，通过测量MIF的表达水平，可监控患者对L3-1Y/IgG2的反应性，即，监控L3-1Y/IgG2的效力。
3.3.用MIF评估抗c-Met抗体在移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中的效力
参照实施例1.2.1，构建移植了患者来源的肺癌细胞的小鼠模型LXFA297、LXFA526、LXFA623、LXFA983、LXFA1041和LXFA1647。其中，观察到LXFA526、LXFA623和LXFA1647对于抗c-Met抗体有反应性，如表4中所示。
为检查MIF水平和对于抗c-Met抗体的反应性之间的关联，在移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型用抗c-Met抗体处理后，监控血清MIF水平的变化。
简言之，以与实施例3.2相同的方式用MIF ELISA试剂盒测量了MIF水平。
结果显示于图17中。如从图17中的数据所见，无反应者组在用L3-1Y/IgG2处理之后，与未处理组(仅注射载剂)相比，MIF表达水平无显著差异或MIF表达水平增高，而反应者组的MIF表达水平相较于未处理组显著降低，或仅表达很少的MIF。这些数据暗示，在用L3-1Y/IgG2处理的患者中，通过测量MIF的表达水平，可监控患者对L3-1Y/IgG2的反应性，即，监控L3-1Y/IgG2的效力。
实施例4：用RAS-RAF突变预测抗c-Met抗体的效力
4.1.用RAS-RAF突变在移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中预测抗c-Met抗体效力的试验
4.1.1.构建移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型
为用于预测抗c-Met抗体的效力，构建移植了患者来源的肿瘤组织的异种移植的小鼠模型。
简言之，给NMRI雌性裸鼠(Charles River或Harlan，4-6周龄)皮下移植从患者提取的癌组织(LXFA：肺癌，GXF：胃癌，RXF：肾癌，GXA：胃癌，LXFL：肺大细胞癌，OVXF：卵巢癌，PAXF：胰腺癌，CXF：结肠癌)。当肿瘤生长到80至200mm3体积时，将小鼠随机分为多个具有10个成员的组。将L3-1Y/IgG2以5mg/kg的剂量进行静脉内注射，而将PBS用于对照组。在随机分组后第0天、第7天、第14天、第21天、第28天和第35天，施用了所述抗体。当肿瘤体积达到2000mm3时，处死小鼠并将其用于以下的实验中。
4.1.2.测量移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中的c-Met表达水平
利用Western印迹方法测量移植了患者来源的癌细胞的小鼠模型中的c-Met表达水平。
简言之，从这些动物模型中分离肿瘤组织，匀浆并在500μl的裂解缓冲液(Roche)中裂解。离心之后，收获细胞液(细胞裂解物)并进行定量。以对应于10μg细胞总蛋白的量在SDS-PAGE上装载细胞液，然后暴露于膜(CellSignal；包括所述抗体)。
结果显示于图18中。在图18中，显出c-Met条带的那些模型被分类为对L3-1Y/IgG2有反应的。然而，LXFA2201虽然也检测到了上述条带，但因RAF突变而并不对L3-1Y/IgG2发生反应。
4.1.3.确定移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中的RAS-RAF突变和对于抗c-Met抗体的反应性
检查移植了患者来源的肿瘤组织的小鼠模型中K-RAS和B-RAF的突变的存在，和对于抗c-Met抗体的反应性。
从癌细胞分离的DNA通过PCR来扩增，其用到包括区分野生型和突变体的引物的SequenomTM***。主要检测G12V、G12C、Q61H和G12C处的K-RAS突变，和G596R和D594A处的B-RAF突变。
参照实施例1.2.1进行了该实验。
结果总结于图19(LXFA 2201和LXFA 2158模型中的抗c-Met抗体的效力；其他小鼠模型见表4和表5)和表6(每种小鼠模型中的K-RAS和B-RAF突变)。每个小鼠模型中的c-Met通过Affymetrix array(Affymetrix GeneChip Human Genome U133Plus 2.0array；引物套为“203510_at”)按说明书来测量。
表6
Figure BDA0000652961910000621
如表6中可见，当K-RAS或B-RAF中存在一种或多种突变时，即使c-Met高水平表达，抗c-Met抗体也不足以表现其活性(例如，LXFA 2201)。这表明K-RAS或B-RAF中突变的存在与否是预测抗c-Met抗体效力的关键因素。
4.2.用RAS-RAF突变预测抗c-Met抗体在癌细胞系中效力的试验(体外)
4.2.1.癌细胞系的制备
将NCI-H441(HTB-114),NCI-H1993(CRL-5909)、NCI-H1373(CRL-5866)、A549(CCL-185)、HCC827(CRL-2868)和EBC-1(编号JCRB0820)细胞以1x104细胞/孔的密度接种于平板上，并与抗体L3-1Y/IgG2(1μg/ml)一起保温72小时。比较抗体处理组和未处理组之间的细胞生长。
4.2.2.检查移植癌细胞的小鼠模型的RAS-RAF突变的存在和对抗c-Met抗体的反应性
检查癌细胞系K-RAS和B-RAF中的突变的存在和对抗c-Met抗体的反应性。
简言之，从癌细胞分离的DNA用SequenomTM***扩增，所述***包括区分野生型和突变体的引物。主要检测G12V、G12C、和G12S处的K-RAS突变，和G596R和D594A处的B-RAF突变。
结果总结于表7中。
表7
细胞系 L3-1Y/IgG2效力 K-RAS突变 B-RAF突变
*NCI-H441 X 突变(G12V) 野生型
NCI-H1993 效力 野生型 野生型
NCI-H1373 X 突变(G12C) N.A.
A549 X 突变(G12S) N.A.
HCC827 效力 野生型 野生型
EBC1 效力 野生型 野生型
(效力：相对于对照为30％或更高水平抑制，N.A.：未测出)
如表7中可见，仅当K-RAS和B-RAF都为野生型时，抗c-Met抗体能在癌症模型中发挥其抗癌活性。
实施例5：预测每种标志物的准确度
5.1.检验抗体的体内效力
给十四种(14)小鼠异种移植模型皮下移植患者来源的肿瘤组织(非小细胞肺癌：NSCLC)，再用Oncotest GmbH(Germany)进行检查。
向14种小鼠异种移植模型中分别施用L3-1Y/IgG2和空载剂(对照)，并测量肿瘤组织的尺寸以确定对抗体的反应性。
当小鼠异种移植模型中的肿瘤尺寸达到100mm3或更高时，给该小鼠异种移植模型静脉注射5mg/kg L3-1Y/IgG2(在对照的情况下为PBS缓冲液)，每周一次，共持续六周，肿瘤尺寸达到2000mm3或更高时，实验终止。
通过下式计算肿瘤尺寸(mm3)：
肿瘤尺寸(mm3)＝(长轴*短轴*短轴)*1/2
反应者(效力)组通过ANOVA分析来确定，其中排除了对应于0.05或更少的p-值的假设。即，先假设药物(抗体)处理组的肿瘤尺寸分布与未处理组相比无变化，再对该假设进行ANOVA检验，将p-值大于0.05的组定为无反应者(无效力)组，将p值为0.05或以下的组定为反应者(效力)组。
异种移植模型对L3-1Y/IgG2的反应性的结果总结于表8中：
表8
Figure BDA0000652961910000641
5.2.检验对抗体效力的预测准确度
对14种小鼠异种移植模型进行以下7种检验(参见实施例5.2.1至5.2.7)。在每个检验中，如下计算预测准确度、预测灵敏度和预测特异性：
预测准确度(％)＝[(TP+TN)/14]*100
预测灵敏度(％)＝(TP/抗体效力阳性(反应者)模型的数目)*100
预测特异性(％)＝(TN/抗体效力阴性(无反应者)模型的数目)*100
[TP(真阳性)：在抗体效力检验(实施例5.2)和每种检验(实施例5.2.1至5.2.7中之一)中被确定为效力阳性的模型的数目；和
TN(真阴性)：在抗体效力检验(实施例5.2)和每种检验(实施例5.2.1至5.2.7中之一)中被确定为效力阴性的模型的数目。
7种检验的结果显示于如下表9中，其中：
TP(真阳性)指在抗体效力检验(实施例5.2)和每种检验(实施例5.2.1至5.2.7中之一)中确定为效力阳性的情况；
TP(真阴性)指在抗体效力检验(实施例5.2)和每种检验(实施例5.2.1至5.2.7中之一)中确定为效力阴性的情况；
FP(假阳性)指在抗体效力检验(实施例5.2)中确定为效力阴性、但在每种检验(实施例5.2.1至5.2.7中之一)中确定为效力阳性的情况；和
FN(假阴性)指在抗体效力检验(实施例5.2)中确定为效力阳性、但在每种检验(实施例5.2.1至5.2.7中之一)中确定为效力阴性的情况。
5.2.1.c-Met IHC：Ventana(比较例)
对进行了实施例5.1所述实验的小鼠肿瘤组织进行提取，用一部分制备***固定的石蜡包埋(FFPE)块。所制得的FFPE块用Ventana MET IHC(免疫组化)按说明书来测量c-Met的表面表达水平，其用到了sp44(Ventana，目录编号790-4430)，该试验是用于metmab(Genentech)的III期临床试验的；参见US2013089541A1。
将Ventana MET IHC试验中IHC评分为2～3的情况确定为反应者(有效力或阳性)组。
5.2.2.利用修改的c-Met IHC进行的效力预测
进行了修改的Ventana MET IHC试验，该试验除了对Ventana抗体sp44进行了5/6稀释以外，与实施例5.2.1所述的Ventana MET IHC相同。将修改的Ventana MET IHC试验中IHC评分为2～3的情况确定为反应者(有效力或阳性)组。
5.2.3.利用IL-8进行的效力预测
每个小鼠异种移植模型的血清IL-8水平按实施例1.1.2来定量。将血清IL-8水平为500pg/ml或更高的情况确定为反应者(有效力或阳性)组，将血清IL-8水平小于500pg/ml的情况确定为无反应者(无效力或阴性)组。
5.2.4.组合I(实施例5.2.2和5.2.3)
将实施例5.2.2(利用修改的Ventana MET IHC进行的效力预测)和实施例5.2.3(利用IL-8进行的效力预测)的结果组合，以预测抗c-Met抗体L3-1Y/IgG2的效力。具体地，将根据实施例5.2.2的修改的Ventana MET IHC试验中IHC评分为2～3、并根据实施例5.2.3的血清IL-8水平为500pg/ml或更高的情况确定为反应者(有效力或阳性)组，将其他情况确定为无反应者(无效力或阴性)组。
实施例5.2.1、5.2.2、5.2.3和5.2.4的结果总结于如下表9中：
表9
Figure BDA0000652961910000661
(*：相较于“1”改良的准确度；和**：相较于“2”改良的准确度)
5.2.5.根据RAS-RAF突变进行的效力预测
对14种小鼠异种移植模型进行实施例4.1.3的实验，以检查K-RAS和/或B-RAF突变的存在或不存在。将K-RAS和B-RAF均为野生型的情况确定为反应者(效力或阳性)组，并将K-RAS和B-RAF中至少一种有突变的情况确定为无反应者(无效力或阴性)组。
5.2.6.组合II(实施例5.2.3和5.2.5)
将实施例5.2.3(利用IL-8进行的效力预测)和实施例5.2.5(根据K-RAS和B-RAF突变进行的效力预测)组合，以预测抗c-Met抗体L3-1Y/IgG2的效力。具体地，将根据实施例5.2.3确定血清IL-8水平为500pg/ml或更高，且K-RAS和B-RAF均为野生型的情况确定为反应者(有效力或阳性)组，并将其他情况确定为无反应者(无效力或阴性)组。
5.2.7.组合III(实施例5.2.2，5.23和5.2.5)
将实施例5.2.2(利用修改的Ventana MET IHC进行的效力预测)、实施例5.2.3(利用IL-8进行的效力预测)和实施例5.2.5(根据K-RAS和B-RAF突变进行的效力预测)相组合，以预测抗c-Met抗体L3-1Y/IgG2的效力。具体地，当根据实施例5.2.2的修改的Ventana METIHC试验确定IHC评分为2～3，根据实施例5.2.3确定血清IL-8水平为500pg/ml或更高，且K-RAS和B-RAF均为野生型的情况，将该小鼠异种移植模型确定为反应者(有效力或阳性)组，并将其他情况确定为无反应者(无效力或阴性)组。
实施例5.2.5、5.2.6和5.2.7的结果总结于以下的表10中：
表10
Figure BDA0000652961910000671
Figure BDA0000652961910000681
如表9和10中所示，当分别使用修改的c-MET IHC试验、IL-8标志物和KRAS-BRAF突变标志物时，预测准确度分别为64.29％、71.43％和71.43％，都比对照(实施例5.2.1；28.57％)优秀。将修改的c-MET IHC试验、IL-8标志物和KRAS-BRAF突变标志物这三者中至少两者组合，则显示了更好的预测准确度。尤其，将修改的c-MET IHC试验、IL-8标志物和KRAS-BRAF突变标志物这三者组合，显示出优秀的预测准确度(100％)。
当参照附图描述本发明的一个或多个实施方案时，本领域技术人员将理解的是可在其中的形式和细节方面作出多种改变而不脱离后续权利要求所限定的本发明的精神和范围。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利公开和专利通过引用并入本文以达到相当于单独地且特定地指出每个参考文献通过引用并入并以其整体列出的程度。
除非本文另外指出或文中出现明显矛盾，在描述本发明的文中(尤其在以下权利要求的文种)使用的术语“一(a)”和“一个(an)”和“该(the)”和“至少一个”和相似的指代理解为包括单数和复数。除非本文另外指出或文中出现明显矛盾，在一系列的一种或多种词语之后术语“至少一种(个)”的使用理解为意为选自所列的词语的一个词语(A或B)或所列的词语的两个或更多个的任何组合(A和B)。除非另外指明，术语“包括(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“包含(containing)”理解为开放式术语(即，意为“包括，但不限于”)。除非本文另外指明，本文所述的值的范围仅意在用作单独提及落入范围中的每个单独的值的简述的方法，且每个单独的值并入本说明书，相当于其在本文中单独被记载。除非本文另外指明或文中出现明显的矛盾，本文所描述的所有方法可以任何顺序来进行。除非另外声称，本文所提供的任何和全部实施例或示例性的语言(例如，“诸如”)的使用，仅意在更好地示出本发明，而不会对本发明的范围产生限制。不应将说明书中的任何语言解释为指明任何非声称的元素为对于本发明的实践所必需的。
本文描述了本发明的优选的实施方案，包括发明人已知的最佳模式，以用于进行本发明。在阅读前述描述之后，那些优选的实施方案的变化形式对于本领域的那些技术人员将变得明显。发明人预期本领域技术人员视需要应用所述变化形式，且发明人意欲将本发明用除本文特别描述之外的方式来实践。因此，如适用法律所允许的，本发明包括所附权利要求中记载的主题的所有修改形式和等价形式。并且，除非本文另外指明或文中出现明显的矛盾，其所有可能的变化形式中的以上描述的元素的任何组合均包括在本发明中。
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Claims (6)

1.测量IL-8和编码IL-8的核酸的至少一种的水平的物质在制备用于预测c-Met抑制剂在受试者中的效力或选择适于应用c-Met抑制剂的受试者的组合物中的用途，其中所述c-Met抑制剂为抗c-Met抗体, 并且其中所述抗c-Met抗体为L3-1Y/IgG2抗体，其包含如下所示的6个CDRs:
(a) 由SEQ ID NO: 1组成的CDR-H1；
(b) 由SEQ ID NO: 2组成的CDR-H2；
(c) 由SEQ ID NO: 3组成的CDR-H3；
(a) 由SEQ ID NO: 10组成的CDR-L1；
(b) 由SEQ ID NO: 11组成的CDR-L2；
(c) 由SEQ ID NO: 13组成的CDR-L3。
2.如权利要求1所述的用途，特征在于，当获自受试者的生物样品中的IL-8和编码IL-8的核酸的至少一种的水平高于其中c-Met抑制剂无效的参照生物样品中的水平时，确定c-Met抑制剂在受试者中是有效的或维持其效力，或确定受试者适宜于应用c-Met抑制剂。
3.如权利要求1所述的用途，其中测量IL-8和编码IL-8的核酸的至少一种的水平的物质包括，与IL-8结合的抗体或适体；与编码IL-8的核酸结合的引物、探针或适体；或其组合。
4.如权利要求1所述的用途，其中测量IL-8和编码IL-8的核酸的至少一种的水平的物质包括，与IL-8结合的抗体或适体；与编码IL-8的核酸结合的多核苷酸；或其组合。
5.如权利要求1所述的用途，其中测量IL-8和编码IL-8的核酸的至少一种的水平的物质包括，与IL-8结合的化合物；与编码IL-8的核酸结合的引物、探针或适体；或其组合。
6.如权利要求1所述的用途，其中测量IL-8和编码IL-8的核酸的至少一种的水平的物质包括，与IL-8结合的化合物；与编码IL-8的核酸结合的多核苷酸；或其组合。
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