CN104761596A - 一种制备花青素苷标准品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备花青素苷标准品的方法，属于植物化学领域，本发明以山茶花的红色新鲜花瓣（或干花瓣）为原料，室温下用酸性乙醇水溶液浸提12-24h，浸提液过滤后减压浓缩，再用酸性食用酒精和水为流动相，经大孔树脂、凝胶、ODS等填料依次进行柱层析，最终可以分离获得19种花青素苷单体；本发明还可以从其它植物的花瓣中提取和分离更多的花青素苷单体，结合结晶技术，从叶片或花瓣中分离非水溶性多酚单体的效果更佳。本发明制备的花青素苷单体纯度高，稳定性好，可作为标准品应用于医药、保健品、化妆品、食品、生物工程、化工等领域。

Description

一种制备花青素苷标准品的方法

技术领域

本发明属于植物化学领域，具体涉及一种制备花青素苷标准品的方法。

背景技术

花青素苷(anthocyanin)是由花青素(anthocyanidin)和糖经糖苷键缩合而成的水溶性色素，存在于植物表皮细胞的液泡中，呈现橙色、红色至蓝色，是决定被子植物花、果实、种子、叶等器官颜色的重要色素之一。在花瓣中，花青素苷伴随着花的发育进程逐渐积累，在花瓣发育的晚期，花青素苷大量生成。营养缺乏、紫外辐射、低温、霜冻、干旱等环境因子都会诱导花青素苷的合成和积累。花青素苷易吸收可见光和紫外光、有效消除光合电子传递***产生的活性氧自由基、调节细胞渗透势、保护细胞膜，减缓可见光和紫外光引起的光抑制、光损害，在植物光破坏等逆境防御中起到重要作用。国内外许多研究表明，花青素苷不仅可呈现出红、黑、兰、紫、橙等多种艳丽的颜色，还具有抗氧化、抗突变、抗癌、抗炎、降血糖、降血脂、减肥、改善视力等多种活性功能，在食品、保健品、医药、生物工程及化工领域有广阔的应用前景。随着人们生活水平的提高和对天然植物性来源的无毒无害的有利于保护人们身体健康、防病治病的天然有机物质的追求，以及人工合成色素对人体有较大的毒副作用，高效无毒的天然阳离子花青素活性苷元及其提取方法已成为21世纪新兴前沿研究课题。

红山茶组(Section camellia)物种多，已发表的名称有72种、1亚种、7变种和1变型，是山茶属(Genus Camellia)中种类最多的类群。滇山茶(Camellia reticulata)、怒江山茶(C.saluenensis)和山茶(C.japonica)是红山茶组植物中分布面积和被人类作为观赏植物开发利用最早最多的物种。开红花的茶梅(C.sasanqua)也是山茶属中较早得到利用的物种。目前，世界各国以上述4个物种为育种材料，已选育出上万个山茶花园艺品种。这些山茶花的花色艳丽多彩，花朵优雅多姿，冬春开放，花期长，是世界闻名的观赏花卉，目前为止仅供观赏绿化利用。

山茶花的寿命长达数百年，耐贫瘠土壤，可在山区、半山区种植。花瓣大、数量多，红色花瓣中含有种类丰富的花青素苷色素，是制备花青素苷标准品的理想材料。但是现有利用红花山茶提取分离花青素苷的技术一般只是得到含花青素的原液产物或粗提取物，无法对不同种类的花青素苷进行区别化分离纯化，提取物中，非花青素苷杂质太多，总花青素苷含量低，各种花青素苷组分的构成不清楚，虽然可以作为食品天然色素食用，但很难充分发挥花青素苷固有的生理功能，无法直接应用于医药、生物工程、化工等领域。

发明内容

本发明提供一种制备花青素苷标准品的方法，本发明采用红花山茶的花瓣为主要原料，可针对不同种类的山茶花对应的提取分离不同类型的花青素苷，获得花青素苷单体种类丰富，同时，本发明制备的花青素苷单体纯度高，稳定性好，可作为标准品直接应用于食品、医药、生物工程、化工等领域。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种制备花青素苷标准品的方法，制备花青素苷标准品的方法按照以下步骤进行：

1)红花山茶的花瓣采集

在山茶花的开花期间，采集红色、颜色鲜艳的花朵，剔除雌雄蕊和花瓣以外的杂质，待提取花青素苷用，在花瓣采集精选的过程中，尽量防止花瓣受到损伤、褐化；

2)制备花青素苷原液

①将采集到的花瓣放入带盖的玻璃或塑料容器中，稍微用手压实后，再继续加入花瓣，加到容器口下方2-3cm处；

②用纯度为98％以上的醋酸和乙醇，以1:1的比例混合均匀获得50％醋酸乙醇溶液；向盛有花瓣的容器中加入50％醋酸乙醇溶液，加入到容器高度的四分之三位置处；溶液加好后用竹棒搅动花瓣，使花瓣充分浸泡在溶液中，将盖子盖好后在室温下浸泡12-24h，滤出提取液；

③再在容器中加入50％醋酸乙醇溶液，按步骤②的方法对容器内的山茶花的花瓣再进行浸提2次,并收集每次的滤液；

④将3次浸提收集的滤液充分混合，在40℃下减压浓缩，蒸发提取液中的水、乙醇和醋酸，在蒸馏瓶中残留的物质即为花青素苷原液，作为柱层析分离花青素苷单体使用；

3)花青素苷的分离和纯化

根据所提取标准物质的需要，选择不同的山茶花野生种或或园艺品种为提取原料，对不同化学结构花青素苷类型进行分离和纯化。

作为优选，所采用的山茶花的提取原料为滇山茶、怒江山茶、山茶和茶梅及其园艺品种中的任一种。

作为优选，所采用的山茶花种类为滇山茶、山茶、或茶梅的野生种或园艺品种中的任一种，在第3)步中花青素苷的分离和纯化的过程中，其对应的Cy3G型或Dp3G型或Cy3GX型花青素苷的提取步骤如下：

①配制流动相 

流动相以A液和B液按比例配制成线性关系的混合溶液：A液为5％醋酸水溶液(5mL食用醋酸溶解于95mL纯净水中)，B液为5％醋酸乙醇溶液(5mL食用醋酸溶解于95mL食用酒精中)；

②进行柱层析 

以MCI gel CHP-20P(三菱化学)为填料，酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱层析法，将花青素苷原液进行分离，获得5-6组份花青素苷粗精制馏分物；

将此粗制馏分物经Sephadex LH-20(GE Healthcare Biosciences AB)反相柱层析分离纯化，可获得5-6组分花青素苷含量达80％左右的粗精制馏分物；

将上述粗精制馏分物经Chromatorex ODS(Fuji Silysia Chemical LTD)反相柱层析纯化，可获得纯度为90％以上的各种花青素苷精制产品；

最后再用Sephadex和ODS为填料的层析柱经过反复层析纯化，即可获得纯度为98％以上的Cy3G型或Dp3G型或Cy3GX型的各种花青素苷标准物质；

在柱层析中，流动相的母液A、B液以100：0比例混合的缓冲溶液作为起始浓度；根据层析柱的大小，加入300-500mL的混合缓冲溶液，然后等梯度逐步增加流动相中B液的比例达到100％进行洗脱，直到花青素苷全部得到洗脱为止。

作为优选，所采用的山茶花种类为怒江山茶野生种或园艺品种，在第3)步中花青素苷的分离和纯化的过程中，其对应的Cy3G5G型花青素苷的提取步骤如下：

①配制流动相 

流动相以A液和B液按比例配制成线性关系的混合溶液：A液为5％醋酸水溶液(5mL食用醋酸解于95mL纯净水中)，B液为5％醋酸乙醇溶液(5mL食用醋酸溶解于95mL食用酒精中)；

②进行柱层析 

先后以MCI和Sephadex为填料，酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱层析法，将花青素苷原液进行分离，可获得5-6组份花青素苷粗精制馏分物；

再将此粗精制物经ODS反相柱层析分离，可获得纯度为90％以上的各种花青素苷精制产物；

最后再用Sephadex和ODS为填料的层析柱把上述花青素苷精制产物反复层析纯化，即可获得纯度为98％以上的Cy3G5G型各种花青素苷标准物质。

本发明的有益效果：

1、应用本发明可以从红花山茶的花瓣中制备19种以上的花青素苷标准物质；本发明可 以从各种红花山茶花的野生种和园艺品种的新鲜或干燥花瓣中，用醋酸水溶液或醋酸乙醇溶液提取出花青素苷原液、花青素苷粗精制物、花青素苷精制物和19种花青素苷单体化合物，即矢车菊素-3,5-O-β-二葡萄糖苷(Cy3G5G)(1)、飞燕草色素-3-O-β-葡萄糖苷(Dp3G)(2)、矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基)-β-半乳糖苷(Cy3GaX)(3)、矢车菊素-3-O-β-半乳糖苷(Cy3Ga)(4)、矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基)-β-葡萄糖苷(Cy3GX)(5)、矢车菊素-3-O-β-葡萄糖苷(Cy3G)(6)、矢车菊素-3-O-(2-β-葡萄糖基6-(Z)-p-香豆酰)-5-O-β-葡萄糖苷(Cy3GZpC5G)(7)、矢车菊素-3-O-(6-O-(Z)-p-香豆酰)-β-半乳糖苷(Cy3GaZpC)(8)、矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基-6-O-(Z)-p-香豆酰)-β-半乳糖苷(Cy3GaZpCX)(9)、矢车菊素-3-O-(2-β-葡萄糖基-6-(E)-p-香豆酰)-5-O-β-葡萄糖苷(Cy3GEpC5G)(10)、矢车菊素-3-O-(6-O-(E)-咖啡酰)-β-葡萄糖苷(Cy3GECaf)(11)、矢车菊素-3-O-(6-O-(Z)-p-香豆酰)-β-葡萄糖苷(Cy3GZpC)(12)、矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基-6-O-(E)-咖啡酰)-β-葡萄糖苷(Cy3GECafX)(13)、矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基-6-O-(Z)-p-香豆酰)-β-葡萄糖苷(Cy3GZpCX)(14)、矢车菊素-3-O-(6-O-(E)-p-香豆酰)-β-半乳糖苷(Cy3GaEpC)(15)、矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基-6-O-(E)-p-香豆酰)-β-半乳糖苷(Cy3GaEpCX)(16)、飞燕草色素-3-O-(6-(E)-p-香豆酰)-β-葡萄糖苷(Dp3GEpC)(17)、矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基-6-O-(E)-p-香豆酰)-β-葡萄糖苷(Cy3GEpCX)(18)和矢车菊素-3-O-(6-(E)-p-香豆酰)-β-葡萄糖苷(Cy3GEpC)(19)，其化学结构式如图1和图2所示。

2、本方法可制备含8种以上花青素苷的粗提取物、含1-2种花青素苷的粗精制物，而且可以制备纯度达98％以上的花青素苷单体化合物。制备的花青素苷单体纯度高，水溶性强，可作为标准品用于科研，也可直接作为针剂注射药品使用，还可应用于食品、保健品、化妆品、生物工程和化工等领域。

附图说明

图1为来源于山茶花的Cy3GX型和Cy3G5G型花青素苷的化学结构；

图2为来源于山茶花的Cy3G型和Dp3G型花青素苷的化学结构；

图3为滇山茶花青素苷原液MCI柱层析馏分液的TLC图谱；

图4为滇山茶花青素苷粗制馏分MIV经Sephadex柱层析馏分液的TLC图谱；

图5为滇山茶花青素苷粗制馏分SII经ODS柱层析馏分液的TLC图谱；

图6为部分花青素苷单体TLC图谱；

图7为部分花青素苷单体的HPLC图谱。

图7a为Cy3G5G单体HPLC图谱；

图7b为Cy3GaEpCX单体HPLC图谱；

图7c为Cy3GX单体HPLC图谱；

图7d为Cy3GEpCX单体HPLC图谱；

图7e为Cy3G单体HPLC图谱；

图7f为Cy3GEpC单体HPLC图谱。

具体实施方式

实施例1Cy3GX型花青素苷的分离和纯化

一种制备花青素苷标准品的方法，制备该型花青素苷标准品的方法按照以下步骤进行：

1)红花山茶的花瓣采集

采用滇山茶野生种、园艺品种或含滇山茶血缘的杂交品种为制备原料，在山茶花的开花期间，采集红色、颜色鲜艳的花朵，剔除雌雄蕊和花瓣以外的杂质，待提取花青素苷用，在花瓣采集精选的过程中，尽量防止花瓣受到损伤、褐化；

2)制备花青素苷原液

①将采集到的花瓣放入容器中，稍微用手压实后，再继续加入花瓣，加到容器口下方2-3cm处；

②用纯度为98％以上的醋酸和乙醇，以1:1的比例混合均匀获得50％醋酸乙醇溶液，向盛有花瓣的容器中加入50％醋酸乙醇溶液，加入到容器高度的四分之三位置处，溶液加好后用竹棒搅动花瓣，使花瓣充分浸泡在溶液中，将盖子盖好后在室温下浸泡12-24h，滤出提取液；

③再在容器中加入50％醋酸乙醇溶液，按步骤b的方法对容器内的山茶花的花瓣再进行浸提2次,并收集每次的滤液；

④.将3次过滤收集的滤液充分混合，在40℃下减压浓缩，蒸发提取液中的水、乙醇和醋酸，在蒸馏瓶中残留的物质即为作为柱层析分离花青素苷单体使用的花青素苷原液；

3)花青素苷的分离和纯化

①配制流动相 

流动相以A液和B液按比例配制成线性关系的混合溶液：A液为5％醋酸水溶液(5mL醋酸溶解于95mL纯净水中)，B液为5％醋酸乙醇溶液(5mL醋酸溶解于95mL食用酒精中)；

②进行柱层析 

以MCI gel CHP-20P(三菱化学)为填料，酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱层析法，把花青素苷原液中的花青素苷分离。用17个三角瓶收集馏分液，然后在铝制薄层层析板上点样，在展开剂中展开，再根据各个样点展开情况(图3)形成MI、MII、MIII、MIV、MV、MVI等6组份花青素苷粗制馏分物。

图3中看出，1与2与其它馏分液的TLC图谱差异较大，可鉴定为独立的两个馏分，即MI和MII，但3和4的TLC图谱比较相似，可以合并确定为另一个花青素苷粗制馏分MIII；同样，6、7、8、9、10、11、12和13的TLC图谱比较相似，合并后确定为馏分MIV，15、16和17合并后确定为馏分MV，而5和14处于两馏分组分间，且无明显的斑点，可合并确定为混合馏分MVI。

将此粗制物经Sephadex LH-20(GE Healthcare Biosciences AB)反相柱层析分离纯化，可获得5-6组分花青素苷含量达80％左右的粗精制馏分组分；

如以Sephadex为填料，前述酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱层析法，把MIV花青素苷粗制馏分物中的花青素苷分离，收集到13瓶馏分液，经TLC层析后，获得图4所示TLC图谱。由图4看出，经Sephadex填料层析后，获得的馏分液的TLC图谱中的斑点较图3清晰，且数量减少，说明各馏分中的化合物种类减少，主成分的含量提高。根据主成分的不同，可划分为5个粗精制馏分组分，1单独确定为馏分SI，但2、3和4的TLC图谱比较相似，合并后确定为馏分SII，5、6和7的TLC图谱比较相似，合并确定为馏分SIII，同样，8、9、10和11合并后确定为馏分SIV，12和13合并确定为馏分SV。

将粗精制物经Chromatorex ODS(Fuji Silysia Chemical LTD)反相柱层析纯化，可获得纯度为90％以上的各种花青素苷精制物；

将粗精制馏分SII经ODS开口柱反相层析后，收集到13瓶馏分液，其TLC层析图谱见图5。由图5看出，经ODS反相层析后，馏分液的TLC图谱中的斑点比图4中更加少且清晰，说明各馏分液中化合物的纯度更高。根据TLC图谱，可把馏分液划分为6个精制馏分组分，即，2和3合并后确定为馏分CI，4和5合并确定为馏分CII，6和7合并确定为馏分CIII，8和9，10、11和12分别合并并依次确定为馏分CIV、CV，13单独为馏分CVI。

最后再用Sephadex和ODS为填料的层析柱经过反复层析纯化，即可获得纯度为98％以上的各种花青素苷标准物质；

在柱层析中，流动相为A、B液以100：0比例混合的溶液开始，根据层析柱的大小，加入300-500mL的流动相，然后等梯度逐步增加流动相中B液的比例进行洗脱，直到花青素苷全部得到洗脱为止。

用此法分离和纯化获得的Cy3GX型花青素苷主要有：Cy3GX(5)、Cy3GZpCX(14)、Cy3GEpCX(18)、Cy3GaX(3)和Cy3GaEpCX(16)；以滇山茶的花瓣作为原料，同时还可以分离获得Cy3G5G(1)、Cy3Ga(4)、Cy3G(6)、Cy3GEpC5G(10)、Cy3GECaf(11)、Cy3GZpC(12)、Cy3GaEpC(15)、Cy3GEpC(19)等花青素苷单体。

实施例2Cy3G5G型花青素苷的分离和纯化

一种制备花青素苷标准品的方法，制备该型花青素苷标准品的方法按照以下步骤进行：

1)红花山茶的花瓣采集

采用怒江山茶或含怒江山茶血缘背景的山茶花园艺品种为制备原料，在山茶花的开花期间，采集红色、颜色鲜艳的花朵，剔除雌雄蕊和花瓣以外的杂质，待提取花青素苷用，在花 瓣采集精选的过程中，尽量防止花瓣受到损伤、褐化；

2)制备花青素苷原液

①将采集到的花瓣放入容器中，稍微用手压实后，再继续加入花瓣，加到容器口下方2-3cm处；

②用纯度为98％以上的醋酸和乙醇，以1:1的比例混合均匀获得50％醋酸乙醇溶液，向盛有花瓣的容器中加入50％醋酸乙醇溶液，加入到容器高度的四分之三位置处，溶液加好后用竹棒搅动花瓣，使花瓣充分浸泡在溶液中，将盖子盖好后在室温下浸泡12-24h，滤出提取液；

③再在容器中加入50％醋酸乙醇溶液，按步骤b的方法对容器内的山茶花的花瓣再进行浸提2次,并收集每次的滤液；

④.将3次过滤收集的滤液充分混合，在40℃下减压浓缩，蒸发提取液中的水、乙醇和醋酸，在蒸馏瓶中残留的物质即为作为柱层析分离花青素苷单体使用的花青素苷原液；

3)花青素苷的分离和纯化

①配制流动相 

流动相以A液和B液按比例配制成线性关系的混合溶液：A液为5％醋酸水溶液(5mL醋酸溶解于95mL纯净水中)，B液为5％醋酸乙醇溶液(5mL醋酸溶解于95mL食用酒精中)；

②进行柱层析 

先后以MCI和Sephadex为填料，酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱层析法，将花青素苷原液进行分离，可获得5-6组份花青素苷粗精制馏分物；

再将此粗精制物经ODS反相柱层析分离，可获得纯度为90％以上的各种花青素苷精制物；

最后再用Sephadex和ODS为填料的层析柱经过反复层析纯化，即可获得纯度为98％以上的各种花青素苷标准物质。

用此法分离和纯化获得的Cy3G5G型花青素苷单体主要有Cy3G5G(1)、Cy3GEpC5G(10)、Cy3G(6)、Cy3GZpC(12)和Cy3GEpC(19)，同时还可以分离获得Cy3Ga(4)、Cy3GECaf(11)、Cy3GaEpC(15)等花青素苷单体。

实施例3Cy3G型花青素苷的分离和纯化

采用山茶，或山茶的园艺品种为制备原料，其具体离和纯化方法与实施例1中Cy3GX型花青素苷的分离纯化方法和步骤一致。

此制备法主要可获得Cy3G(6)、Cy3Ga(4)、Cy3GZpC(12)、Cy3GaEpC(15)、Cy3GECaf(11)和Cy3GEpC(19)等花青素苷标准品。

实施例4Dp3G型花青素苷的分离和纯化

采用茶梅，或茶梅园艺品种的花瓣为原料，也可用香港红山茶(C.hongkongensis)的花瓣为制备原料，其具体分离和纯化方法与实施例1中Cy3GX型花青素苷的分离纯化方法和步骤一致。

用此制备法主要获得Dp3G(2)、Dp3GEpC(17)、Cy3G(6)、Cy3Ga(4)、Cy3GECaf(11)、Cy3GZpC(12)、Cy3GaEpC(15)和Cy3GEpC(19)等花青素苷标准品。

实施例5实验分析(以从滇山茶的花瓣中提取花青素苷标准品为例)

一、鉴定馏分组分

经柱层析获得的洗脱液，可用TLC和高效液相色谱法(HPLC，High Performance Liquid Chromatography)进行鉴定，确定馏分组分。

TLC鉴定：层析板以铝制层析板(如25TLC aluminium sheets 20×20Silica gel 60F254)为优，展开剂用C、D液配制。C液为苯：甲酸乙酯：甲酸＝1：7：1(V/V)，D液为甲酸乙酯：甲酸：蒸馏水＝3：1：1(V/V)。C、D比例在2：1-3：2间，洗脱液样点经展开剂展开后，用20％硫酸甲醇溶液喷洒层析板，加热显色。

Cy3G5G、Cy3GX、Cy3G、Cy3GaEpCX、Cy3GEpCX和Cy3GEpC等标准品的TLC鉴定结果见图6。

HPLC分析用E液和F液进行可变梯度分析。E液为1.5％的磷酸水溶液，F液为磷酸：甲酸：乙腈：三氟乙酸：水＝1.4：19：23.8：5：50.8。分析条件为，以ODS-80Ts QA column(4.5mm i.d.×150mm,TOSOH)为分析柱，柱温40℃，流速1.0mL/min，检测波长525nm，分析时间35min。在分析时间0-35min间，流动相以E：F＝78：22(V/V)开始，然后线性增加F液的浓度，两者比例达35：65时，分析结束。

Cy3G5G、Cy3GX、Cy3G、Cy3GaEpCX、Cy3GEpCX和Cy3GEpC等标准品的HPLC分析鉴定结果见图7。

二、花青素苷的化学结构鉴定

用¹H-、¹³C-核磁共振(NMR,Nuclear Magnetic Resonance)和ESI-MS/MS(Electrospray Ionization-Mass Spectrometry/MS)鉴定花青素苷单体的分子结构。比如，用JNM-ECA600(JEOL JNM-ECA600KS,LEOL DATIM LTD.Japan)核磁共振装置测定花青素苷单体，其氢谱和碳谱分析结果如表1和表2所示。

1、矢车菊素-3，5-O-β-二葡萄糖苷(Cy3G5G)(1)鉴定

黑红色粉末，溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现***圆斑，推测为花青素苷化合物。¹H-NMR(600MHz,DMSO-d6)质子图谱中(结果见表1)，在低磁场区 化学位移δ7.05(1H,d,J＝2.2Hz)和δ7.07(1H,d,J＝2.2Hz)分别为5,7-二氧取代黄酮A环6、8位的质子信号；化学位移δ7.02(1H,d,J＝8.7Hz)、δ8.27(1H,dd,J＝8.7,2.4Hz)、δ8.03(1H,d,J＝2.4Hz)表明结构中有ABX自旋***，依次为B环5'、6'、2'位的质子信号。¹³C-NMR(125MHz,DMSO-d6)图谱中(结果见表2)，化学位移δ164.6(C-2)、δ146.6(C-3)、δ135.8(C-4)、δ156.7(C-5)、δ105.7(C-6)、δ169.6(C-7)、δ97.5(C-8)、δ157.1(C-9)、δ113.3(C-10)、δ121.0(C-1')、δ118.6(C-2')、δ147.4(C-3')、δ156.5(C-4')、δ117.7(C-5')、δ129.0(C-6')为矢车菊素的碳信号峰。高磁场区的两个化学位移δ5.35(1H,d,J＝7.9Hz)、δ5.20(1H,d,J＝7.7Hz)，以及δ3.46-5.35有12个质子信号，说明结构中有2个糖片段；化学位移δ3.73(1H,dd,J＝8.9,7.9Hz)、δ3.69(1H,dd,J＝9.1,8.9Hz)、δ3.51(1H,dd,J＝9.4,9.1Hz)、δ3.60(1H,ddd,J＝9.4,6.8,2.0Hz)、δ3.99(1H,dd,J＝12.0,2.0Hz)、δ3.78(1H,dd,J＝12.0,6.8Hz)等为葡萄糖的质子信号峰(表1)。表1还可看到另一个葡萄糖的6个质子信号。¹³C-NMR高磁场区的化学位移δ74.4、δ78.5、δ71.0、δ78.2、δ62.2，以及δ102.5糖端基碳信号，表明该糖为β-葡萄糖。此外，化学位移δ103.8、δ74.4、δ78.8、δ71.2、δ77.5、δ62.5等信号表明另一个糖也为β-葡萄糖。2D-HMQC图谱分析进一步证实了上述分析结果。2D-HMBC图谱中，葡萄糖1位质子δ5.35(1H,d,J＝7.9Hz)与矢车菊素3位碳δ146.6(C-3)有强的互作信号，说明此葡萄糖1位碳与矢车菊素3位碳通过氧原子连接。另一葡萄糖的1位质子δ5.20(1H,d,J＝7.7Hz)与矢车菊素5位碳δ156.7(C-5)有强的互作信号，证明其作为糖基连接在矢车菊素的7位碳上形成了糖苷。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)611.4[M-H]⁺、449.4[(M-H)-162(葡萄糖分子量)]⁺、287.2[(M-H)-324.2(2个葡萄糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₂₇H₃₁O₁₆的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物1鉴定为矢车菊素-3,5-O-β-二葡萄糖苷。

2、飞燕草色素-3-O-β-葡萄糖苷(Dp3G)(2)鉴定

***粉末，溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现紫色圆斑，推测为花青素苷化合物。¹H-NMR质子图谱中(表1)，在低磁场区化学位移δ6.69(1H,s)和δ6.87(1H,s)分别为5,7-二氧取代黄酮A环6、8位的质子信号；化学位移δ7.74(1H,s)、δ7.74(1H,s)表明结构中有ABX自旋***，依次为B环6'和2'位的质子信号。¹³C-NMR图谱中(表2)，化学位移δ163.6(C-2)、δ145.4(C-3)、δ135.8(C-4)、δ159.2(C-5)、δ103.7(C-6)、δ170.5(C-7)、δ95.3(C-8)、δ157.7(C-9)、δ113.3(C-10)、δ120.2(C-1')、δ112.7(C-2')、δ147.5(C-3')、δ144.7(C-4')、δ147.5(C-5')、δ112.7(C-6')为飞燕草色素的碳信号峰。高磁场区的化学位移δ5.39(1H,d,J＝7.5Hz)、δ3.58(1H,dd,J＝8.9,7.5Hz)、δ3.41(1H,t,J＝8.9Hz)、δ3.26(1H,t,J＝8.9Hz)、δ3.53(1H,br.dd,J＝8.9,5.5Hz)、δ3.73(1H,dd,J＝12.2,2.2Hz)、δ3.51(1H,dd,J＝12.2, 5.58Hz)等为β-葡萄糖的质子信号峰(表1)。2D-HMQC图谱分析进一步证实了上述分析结果。2D-HMBC图谱中，葡萄糖1位质子δ5.39(1H,d,J＝7.5Hz)与飞燕草色素3位碳δ145.4(C-3)有强的互作信号，说明此葡萄糖1位碳与飞燕草素3位碳通过氧原子连接。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)465.0[M-H]⁺、303.0[(M-H)-162(葡萄糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₂₁H₂₁O₁₂的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物2鉴定为飞燕草色素-3-O-β-葡萄糖苷。

3、矢车菊素-3-O-β-半乳糖苷(Cy3Ga)(4)鉴定

深红色粉末，溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现***圆斑，推测为花青素苷化合物。¹H-NMR质子图谱(表1)看出，与化合物1相似，在低磁场区有矢车菊素的碳信号峰。高磁场区的化学位移δ5.26(1H,d,J＝7.7Hz)、δ4.02(1H,dd,J＝9.6,7.7Hz)、δ3.72(1H,dd,J＝9.6,3.4Hz)、δ3.98(1H,br.d,J＝3.2Hz)、δ3.83(1H,br.dd,J＝8.1,5.6Hz)、δ3.84(1H,dd,J＝11.5,8.0Hz)、δ3.80(1H,dd,J＝11.5,5.6Hz)等为β-半乳糖的质子信号峰。2D-HMQC图谱分析进一步证实了上述分析结果。2D-HMBC图谱中，半乳糖1位质子δ5.26(1H,d,J＝7.7Hz)与矢车菊素3位碳δ145.8(C-3)有强的互作信号，说明此半乳糖1位碳与矢车菊素3位碳通过氧连接。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)449.2[M-H]⁺、287.2[(M-H)-162(半乳糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₂₁H₂₁O₁₁的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物4鉴定为矢车菊素-3-O-β-半乳糖苷。

4、矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基)-β-半乳糖苷(Cy3GaX)(3)鉴定

深红色粉末，溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现***圆斑，推测为花青素苷化合物。¹H-NMR质子图谱(表1)看出，化合物3的质子决大多数与化合物4相似。不同点在于，在高磁场区多了5个质子的信号峰，化学位移依次为δ4.78(1H,d,J＝7.6Hz)、δ3.22(1H,dd,J＝8.5,7.6Hz)、δ3.37(1H,dd,J＝8.96,8.5Hz)、δ3.46(1H,ddd,J＝10.2,8.9,5.4Hz)、δ3.73(1H,dd,J＝11.5,5.4Hz)、δ3.10(1H,dd,J＝11.5,10.2Hz)等，表明其为β-木糖的质子信号峰。2D-HMQC图谱分析进一步证实了上述分析结果。2D-HMBC图谱中，木糖1位质子δ4.78(1H,d,J＝7.6Hz)与半乳糖2位碳δ118.6(C-2')有强的互作信号，说明木糖1位碳与半乳糖2位碳连接。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)581.2[M-H]⁺、449.2[(M-H)-132(木糖分子量)]⁺、287.2[(M-H)-294(香豌豆糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₂₆H₂₉O₁₅的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物3鉴定为矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基)-β-半乳糖苷。

5、矢车菊素-3-O-β-葡萄糖苷(Cy3G)(6)鉴定

深红色粉末，溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆斑，推测为花青素苷化合物。¹H-NMR质子图谱(表1)看出，与化合物1相似，在低磁场区有矢车菊素的碳信号峰，不同的是，在高磁场区只有一个β-葡萄糖的质子信号峰。2D-HMQC图谱分析进一步证实了上述分析结果。2D-HMBC图谱中，葡萄糖1位质子δ5.31(1H,d,J＝7.7Hz)与矢车菊素3位碳δ145.2(C-3)有强的互作信号，说明葡萄糖1位碳与矢车菊素3位碳有链接。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)449.2[M-H]⁺、287.2[(M-H)-162(葡萄糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₂₁H₂₁O₁₁的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物6鉴定为矢车菊素-3-O-β-葡萄糖苷。

6、矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基)-β-葡萄糖苷(Cy3GX)(5)鉴定

深红色粉末，溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆斑，推测为花青素苷化合物。¹H-NMR质子图谱(表1)看出，化合物5的质子数是在化合物6基础上，在高磁场区多了5个β-木糖的质子信号峰。2D-HMBC图谱中，木糖1位质子δ4.83(1H,d,J＝7.5Hz)与葡萄糖2位碳δ81.5(C-2')有强的互作信号，说明木糖1位碳与葡萄糖2位碳连接。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)581.2[M-H]⁺、449.2[(M-H)-132(木糖分子量)]⁺、287.2[(M-H)-294(芸香糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₂₆H₂₉O₁₅的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物5鉴定为矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基)-β-葡萄糖苷。7、矢车菊素-3-O-(2-β-葡萄糖基6-(Z)-p-香豆酰)-5-O-β-葡萄糖苷(Cy3GZpC5G)(7)鉴定

深红色粉末，溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆斑，推测为花青素苷化合物。表1所示¹H-NMR结果看出，化合物7的质子比化合物1在低磁场区多了6个质子。化学位移δ7.24(1H,d,J＝8.76Hz)、δ6.39(1H,d,J＝8.7Hz)、δ6.39(1H,d,J＝8.75Hz)、δ7.24(1H,d,J＝8.7Hz)、δ5.76(1H,d,J＝13.0Hz)、δ6.58(1H,d,J＝13.0Hz)等结果表明具有Z型香豆酸。2D-HMQC图谱分析进一步证实了上述分析结果。2D-HMBC图谱中，葡萄糖1位质子δ5.45(1H,d,J＝7.9Hz)与矢车菊素3位碳δ146.1(C-3)有强的互作信号，说明葡萄糖1位碳与矢车菊素3位碳有链接，而此葡萄糖6位质子δ4.42(1H,dd,J＝11.8,2.0Hz)与香豆酸C＝O位碳δ168.9(C＝O)有强的互作信号，说明此葡萄糖6位碳上连有酰基化的Z-香豆酸。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)757.4[M-H]⁺、611.4[(M-H)-146(香豆酸分子量)]⁺、449.4[(M-H)-306(香豆酸+葡萄糖分子量)]⁺、287.2[(M-H)-470.2(香豆酸+2个葡萄糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₃₆H₃₇O₁₈的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物7鉴定为矢车菊素-3-O-(2-β-葡萄糖基6-(Z)-p-香豆酰)-5-O-β-葡萄糖苷。

8、矢车菊素-3-O-(6-O-(Z)-p-香豆酰)-β-半乳糖苷(Cy3GaZpC)(8)鉴定

浅红色粉末，溶于水、甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现浅红色圆斑，推测为花青素苷化合物。表1所示¹H-NMR结果看出，化合物8的质子数大多数与化合物4相似，但在低磁场区比4多了含有Z-香豆酸的6个质子。2D-HMQC图谱分析进一步证实了上述分析结果。2D-HMBC图谱中，半乳糖6位质子δ4.32(1H,dd,J＝11.6,3.5Hz)与香豆酸的C＝O位碳δ169.2(C＝O)有强的互作信号，说明此香豆酸C＝O碳与半乳糖6位碳连接。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)595.2[M-H]⁺、449.2[(M-H)-146(香豆酸分子量)]⁺、287.2[(M-H)-306(香豆酸+半乳糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₃₀H₂₇O₁₃的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物8鉴定为矢车菊素-3-O-(6-O-(Z)-p-香豆酰)-β-半乳糖苷。

9、矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基-6-O-(Z)-p-香豆酰)-β-半乳糖苷(Cy3GaZpCX)(9)鉴定

浅红色粉末，溶于水、甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现浅红色圆斑，推测为花青素苷化合物。表1所示¹H-NMR结果看出，化合物9的质子数是在化合物3的基础上，在低磁场区多了含有Z-香豆酸的6个质子。2D-HMQC图谱分析进一步证实了上述分析结果。2D-HMBC图谱表明，此香豆酸C＝O碳与半乳糖6位碳连接。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)727.4[M-H]⁺、581.4[(M-H)-146(香豆酸分子量)]⁺、451.4[(M-H)-276(香豆酸+木糖分子量)]⁺、287.2[(M-H)-440(香豆酸+香豌豆糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₃₅H₃₅O₁₇的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物9鉴定为矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基-6-O-(Z)-p-香豆酰)-β-半乳糖苷。

10、矢车菊素-3-O-(2-β-葡萄糖基-6-(E)-p-香豆酰)-5-O-β-葡萄糖苷(Cy3GEpC5G)(10)鉴定

深红色粉末，溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆斑，推测为花青素苷化合物。表1所示¹H-NMR结果看出，化合物10的质子数与化合物7完全相同，但葡萄糖6位碳上质子化学位移δ3.99(1H,dd,J＝12.2,2.2Hz)、δ3.78(1H,dd,J＝12.2,5.6Hz)与化合物7不同，此外，香豆酸a、b碳上质子化学位移δ6.22(1H,d,J＝15.8Hz)、δ7.32(1H,d,J＝15.8Hz)表明此香豆酸具有E型结构。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)757.4[M-H]⁺、611.4[(M-H)-146(香豆酸分子量)]⁺、449.4[(M-H)-306(香豆酸+葡萄糖分子量)]⁺、287.2[(M-H)-470.2(香豆酸+2个葡萄糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₃₆H₃₇O₁₈的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物10鉴定为矢车菊素-3-O-(2-β-葡萄糖基6-(E)-p-香豆酰)-5-O-β-葡萄糖苷。

11、矢车菊素-3-O-(6-O-(E)-咖啡酰)-β-葡萄糖苷(Cy3GECaf)(11)鉴定

深红色粉末，易溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆斑，推 测为花青素苷化合物。表1所示¹H-NMR结果看出，与化合物6相比，化合物11在低磁场区多了5个质子。化学位移δ6.82(1H,br.s)、δ6.67(1H,m)、δ6.67(1H,m)、δ6.14(1H,d,J＝15.8Hz)、δ7.31(1H,d,J＝15.8Hz)等结果表明其为E-咖啡酸。2D-HMBC图谱中，葡萄糖6位质子δ4.39(1H,dd,J＝12.5,7.0Hz)与咖啡酸C＝O位碳δ169.2(C＝O)有强的互作信号，说明葡萄糖6位碳与咖啡酸C＝O位碳有链接。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)611.2[M-H]⁺、449.2[(M-H)-162(咖啡酸分子量)]⁺、287.2[(M-H)-324(咖啡酸+葡萄糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₃₀H₂₇O₁₄的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物11鉴定为矢车菊素-3-O-(6-O-(E)-咖啡酰)-β-葡萄糖苷。

12、矢车菊素-3-O-(6-O-(Z)-p-香豆酰)-β-葡萄糖苷(Cy3GZpC)(12)鉴定

深红色粉末，易溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆斑，推测为花青素苷化合物。表1所示¹H-NMR结果看出，与化合物11相比，化合物12在低磁场区有1个Z-香豆酸。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)595.2[M-H]⁺、449.2[(M-H)-146(香豆酸酸分子量)]⁺、287.2[(M-H)-308(香豆酸+葡萄糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₃₀H₂₇O₁₃的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物12鉴定为矢车菊素-3-O-(6-O-(Z)-p-香豆酰)-β-葡萄糖苷。

13、矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基-6-O-(E)-咖啡酰)-β-葡萄糖苷(Cy3GECafX)(13)鉴定

深红色粉末，易溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆斑，推测为花青素苷化合物。表1所示¹H-NMR结果看出，化合物13质子数是在化合物5质子基础上多了1个E-咖啡酸。2D-HMBC图谱中，葡萄糖6位质子δ4.39(1H,dd,J＝12.0,7.5Hz)与咖啡酸C＝O位碳δ169.1(C＝O)有强的互作信号，说明咖啡酸C＝O位碳与葡萄糖6位碳连接。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)743.4[M-H]⁺、581.4[(M-H)-162(咖啡酸分子量)]⁺、449.4[(M-H)-294(木糖分子量)]⁺、287.4[(M-H)-456(芸香糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₃₅H₃₅O₁₈的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物13鉴定为矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基-6-O-(E)-咖啡酰)-β-葡萄糖苷(Cy3GECafX)。

14、矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基-6-O-(Z)-p-香豆酰)-β-葡萄糖苷(Cy3GZpCX)(14)鉴定

深红色粉末，易溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆斑，推测为花青素苷化合物。表1所示¹H-NMR结果看出，化合物14质子数是在化合物5基础上多了1个Z型香豆酸的6个质子。2D-HMBC图谱中，葡萄糖6位质子δ4.41(1H,dd,J＝12.0,8.2Hz)与香豆酸C＝O位碳δ168.2(C＝O)有强的互作信号，说明香豆酸C＝O位碳与葡萄糖6位碳连接。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)727.4[M-H]⁺、581.1[(M-H)-146 (香豆酸分子量)]⁺、449.4[(M-H)-278(香豆酸+木糖分子量)]⁺、287.4[(M-H)-440(香豆酸+芸香糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₃₅H₃₅O₁₇的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物14鉴定为矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基-6-O-(Z)-香豆酰)-β-葡萄糖苷。

15、矢车菊素-3-O-(6-O-(E)-p-香豆酰)-β-半乳糖苷(Cy3GaEpC)(15)鉴定

红色粉末，溶于水、甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆斑，推测为花青素苷化合物。表1所示¹H-NMR结果看出，与化合物4相比，化合物15在低磁场区多了1个E型香豆酸。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)595.2[M-H]⁺、449.2[(M-H)-146(香豆酸酸分子量)]⁺、287.2[(M-H)-308(香豆酸+半乳糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₃₀H₂₇O₁₃的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物12鉴定为矢车菊素-3-O-(6-O-(E)-p-香豆酰)-β-半乳糖苷。

16、矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基-6-O-(E)-p-香豆酰)-β-半乳糖苷(Cy3GaEpCX)(16)鉴定

红色粉末，溶于水、甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆斑，推测为花青素苷化合物。表1所示¹H-NMR结果看出，与化合物15相比，化合物16在高磁场区多了5个β-木糖质子。2D-HMBC图谱表明，木糖1位质子δ4.66(1H,d,J＝7.5Hz)与半乳糖2位δ79.3(C-2″)有强的互作信号，说明木糖1位碳与半乳糖2位碳连接。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)727.3[M-H]⁺、581.3[(M-H)-146(香豆酸分子量)]⁺、449.3[(M-H)-278(香豆酸+木糖分子量)]⁺、287.3[(M-H)-440(香豆酸+香豌豆糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₃₅H₃₅O₁₇的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物16鉴定为矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基-6-O-(Z)-香豆酰)-β-半乳糖苷。

17、飞燕草色素-3-O-(6-(E)-p-香豆酰)-β-葡萄糖苷(Dp3GEpC)(17)鉴定

***粉末，溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现***圆斑，推测为花青素苷化合物。表1所示¹H-NMR结果看出，与化合物2相比，化合物17在低磁场区多了6个E型香豆酸的质子。2D-HMBC图谱中，葡萄糖6位质子δ4.39(1H,dd,J＝12.0,7.52Hz)与香豆酸C＝O位碳δ169.2(C＝O)有强的互作信号，说明香豆酸C＝O位碳与葡萄糖6位碳连接。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)611.2[M-H]⁺、465.2[(M-H)-146(香豆酸分子量)]⁺、303.2[(M-H)-162(香豆酸+葡萄糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₃₀H₂₇O₁₄的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物17鉴定为飞燕草色素-3-O-(6-(E)-p-香豆酰)-β-葡萄糖苷。

18、矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基-6-O-(E)-p-香豆酰)-β-葡萄糖苷(Cy3GEpCX)(18)鉴定

深红色粉末，易溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆斑，推 测为花青素苷化合物。表1和表2所示¹H-NMR和¹³C-NMR结果看出，化合物18与14的质子数和碳原子数完全相同，但化合物18的葡萄糖6位碳上两个质子和香豆酸a、b位碳上质子的化学位移与化合物14的有差异。化学位移δ6.20(1H,d,J＝15.9Hz)和δ7.39(1H,d,J＝15.9Hz)说明香豆酸为E型。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)727.4[M-H]⁺、581.1[(M-H)-146(香豆酸分子量)]⁺、449.4[(M-H)-278(香豆酸+木糖分子量)]⁺、287.4[(M-H)-440(香豆酸+芸香糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₃₅H₃₅O₁₇的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物18鉴定为矢车菊素-3-O-(2-O-β-木糖基-6-O-(E)-香豆酰)-β-葡萄糖苷。

19、矢车菊素-3-O-(6-(E)-p-香豆酰)-β-葡萄糖苷(Cy3GEpC)(19)鉴定

深红色粉末，易溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆斑，推测为花青素苷化合物。同样，表1和表2所示¹H-NMR和¹³C-NMR结果看出，化合物19与12的质子数和碳原子数完全相同，不同点在于化合物19的香豆酸为E型。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比(m/z)595.2[M-H]⁺、449.2[(M-H)-146(香豆酸酸分子量)]⁺、287.2[(M-H)-308(香豆酸+葡萄糖分子量)]⁺出现离子峰，与分子C₃₀H₂₇O₁₃的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物19鉴定为矢车菊素-3-O-(6-O-(E)-p-香豆酰)-β-葡萄糖苷。

表1花青素苷¹H-NMR分析结果

br.，broad；s，singlet； d，doublet；dd，double doublet；m，multiplet.

续表1花青素苷¹H-NMR分析结果

br.，broad；s，singlet；d，doublet；dd，double doublet；m，multiplet；t，triplet.

续表1花青素苷¹H-NMR分析结果

表2花青素苷¹³C-NMR分析结果

C(Z)，Z-p-coumaroyl；C(E)，E-p-coumaroyl；Caf(E)，E-caffeoyl.

续表2花青素苷¹³C-NMR分析结果

三、花青素苷的提取效率分析

国外绝大多数研究者采用1％盐酸甲醇(或乙醇)溶液从植物组织中提花青素苷，用吸附剂(如不同型号的XAD)、凝胶(如Sephadex LH220、Sephadex G225等)为填料，盐酸甲醇(或乙醇)溶液为流动相分离纯化花青素苷，但因花青素苷水溶性强，稳定性受环境影响较大，酰基化花青素苷极易被盐酸水解等原因，纯化难度大，提取率极低，很难大量获得较高纯度的标准品。因此，目前花青素苷标准品的种类极少，纯度低，价格昂贵。仅有国外2-3 家试剂公司销***为90％的Cy3G、Cy3Ga、Cy3G5G、Dp3G、Dp3Ga等花青素苷标准品，价格为每毫克800元人民币以上。

本发明制备的花青素苷单体纯度高(达98％以上)，稳定性好，可作为标准品直接应用于医药、生物工程、化工、保健品、化妆品、食品等领域。

本发明采用红花山茶为主要原料，采用弱酸性的乙酸替代了盐酸，提高了花青素苷的稳定性。制备过程中，可针对不同种类的山茶花对应地提取分离和存货花青素苷，获得的花青素苷单体种类丰富。同时，本发明还适用于其它植物花瓣中花青素苷的提取、分离和纯化，用本发明从植物叶片和花瓣中提取其它多酚的效果更佳。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.一种制备花青素苷标准品的方法，其特征在于，制备花青素苷标准品的方法按照以下步骤进行：

1)红花山茶的花瓣采集

在山茶花的开花期间，采集红色、颜色鲜艳的花朵，剔除雌雄蕊和花瓣以外的杂质，待提取花青素苷用，在花瓣采集精选的过程中，尽量防止花瓣受到损伤、褐化；

2)制备花青素苷原液

①将采集到的花瓣放入带盖的玻璃或塑料容器中，稍微用手压实后，再继续加入花瓣，加到容器口下方2-3cm处；

②用纯度为98％以上的醋酸和乙醇，以1:1的比例混合均匀获得50％醋酸乙醇溶液；向盛有花瓣的容器中加入50％醋酸乙醇溶液，加入到容器高度的四分之三位置处；溶液加好后用竹棒搅动花瓣，使花瓣充分浸泡在溶液中，将盖子盖好后在室温下浸泡12-24h，滤出提取液；

③再在容器中加入50％醋酸乙醇溶液，按步骤②的方法对容器内的山茶花的花瓣再进行浸提2次,并收集每次的滤液；

④将3次浸提收集的滤液充分混合，在40℃下减压浓缩，蒸发提取液中的水、乙醇和醋酸，在蒸馏瓶中残留的物质即为花青素苷原液，作为柱层析分离花青素苷单体使用；

3)花青素苷的分离和纯化

根据所提取标准物质的需要，选择不同的山茶花野生种或园艺品种为提取原料，对不同花青素苷类型进行分离和纯化。

2.根据权利要求1所述的一种制备花青素苷标准品的方法，其特征在于，所采用的山茶花的提取原料为滇山茶、怒江山茶、山茶和茶梅及其园艺品种中的任一种。

3.根据权利要求2所述的一种制备花青素苷标准品的方法，其特征在于，所采用的山茶花种类为滇山茶、山茶、或茶梅的野生种或园艺品种中的任一种，在第3)步中花青素苷的分离和纯化的过程中，其对应的Cy3G型或Dp3G型或Cy3GX型花青素苷的提取步骤如下：

①配制流动相

流动相以A液和B液按比例配制成线性关系的混合溶液：A液为5％醋酸水溶液(5mL食用醋酸溶解于95mL纯净水中)，B液为5％醋酸乙醇溶液(5mL食用醋酸溶解于95mL食用酒精中)；

②进行柱层析

以MCI gel CHP-20P(三菱化学)为填料，酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱层析法，将花青素苷原液进行分离，获得5-6组份花青素苷粗精制馏分物；

将此粗制馏分物经Sephadex LH-20(GE Healthcare Biosciences AB)反相柱层析分离纯化，可获得5-6组分花青素苷含量达80％左右的粗精制馏分物；

将上述粗精制馏分物经Chromatorex ODS(Fuji Silysia Chemical LTD)反相柱层析纯化，可获得纯度为90％以上的各种花青素苷精制产品；

最后再用Sephadex和ODS为填料的层析柱经过反复层析纯化，即可获得纯度为98％以上的Cy3G型或Dp3G型或Cy3GX型的各种花青素苷标准物质；

在柱层析中，流动相的母液A、B液以100：0比例混合的缓冲溶液作为起始浓度；根据层析柱的大小，加入300-500mL的混合缓冲溶液，然后等梯度逐步增加流动相中B液的比例达到100％进行洗脱，直到花青素苷全部得到洗脱为止。

4.根据权利要求2所述的一种制备花青素苷标准品的方法，其特征在于，所采用的山茶花种类为怒江山茶野生种或园艺品种，在第3)步中花青素苷的分离和纯化的过程中，其对应的Cy3G5G型花青素苷的提取步骤如下：

①配制流动相

流动相以A液和B液按比例配制成线性关系的混合溶液：A液为5％醋酸水溶液(5mL食用醋酸解于95mL纯净水中)，B液为5％醋酸乙醇溶液(5mL食用醋酸溶解于95mL食用酒精中)；

②进行柱层析

先后以MCI和Sephadex为填料，酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱层析法，将花青素苷原液进行分离，可获得5-6组份花青素苷粗精制馏分物；

再将此粗精制物经ODS反相柱层析分离，可获得纯度为90％以上的各种花青素苷精制产物；

最后再用Sephadex和ODS为填料的层析柱把上述花青素苷精制产物反复层析纯化，即可获得纯度为98％以上的Cy3G5G型各种花青素苷标准物质。