CN104755628B - 生物样品的稳定化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于使含细胞的生物样品中的细胞外核酸群体稳定和用于使所包含的细胞的转录组稳定的方法、组合物和装置。

Description

生物样品的稳定化
产生本发明的工作接受了来自于欧盟第七框架计划(European Community'sSeventh Framework Programme)(FP7/2007-2013)在拨款协议号222916下的资助。
技术领域
本文公开的技术尤其涉及适合于使含细胞的样品、特别是血液样品稳定的方法和组合物，并涉及从相应稳定化的生物样品分离核酸的方法。
背景技术
在诊断学领域中，核酸是重要的生物标志物。例如，基因组的转录本(特别是mRNA和miRNA)的情况在分子体外诊断学中被广泛用作生物标志物，为正常的生物和病理过程提供见解，并有望预测疾病结果和指示个体化的治疗过程。因此，核酸、尤其是RNA的情况分析，在疾病诊断、预后和用于生物标志物发现的临床试验中是重要的。从转录情况获得定量信息的能力，是探索基础生物学、诊断疾病、促进药物开发、为特定病理和遗传情况定制疗法以及产生与生物或治疗过程和途径相关的数据库的强有力工具。近年中，已对下游测定法和数据分析(分析过程)做出显著改进。然而，已发现预分析步骤例如特别是用于新的生物分子靶的样品操作和样品稳定化，对表达情况具有严重影响，并且可能损害后续分析(参见例如等，2001；Pahl和Brune，2002)。如果在待分析的样品的稳定化中不采取预防措施，样品将在运输和储存期间经历可能严重改变被靶向分子的表达情况的变化(参见例如Rainen等，2002；Baechler等，2004)。因此，基因表达、尤其是血液细胞的基因表达，对样品的离体操作敏感。如果由于样品的操作造成表达情况改变，后续分析不反映出样品以及因此患者的原始情况，而是测量在样品操作、运输和储存期间产生的人为情况。因此，需要使表达情况稳定从而允许进行可靠分析的优化的稳定化方法。尤其是，对于使血液样品稳定以便允许分析血液细胞的基因表达情况，存在着需求。
样品例如尤其是血液样品的较长期稳定化，在正式情况下通过添加有机溶剂例如苯酚和/或氯仿或通过在液氮中或使用干冰直接冷冻来进行。这些方法对于医院、医生手术或常规诊断实验室来说是完全不实用的技术。为了克服这些问题，PreAnalytiX开发了使用含有用于在收集样品的时间点立即使RNA基因表达情况稳定的试剂的真空血液收集管(PAXgene血液RNA管)来收集人类血液的第一种研究产品。相应的稳定化组合物允许在室温下运输和储存而没有由基因诱导和转录本降解引起RNA情况变化的风险(参见例如US 6,617,170，US 7,270,953，Kruhoffer等，2007)。实现样品、在这里是血液的立即裂解的其他稳定化试剂，由ABI/Life Technologies在名称Tempus血液RNA管产品下销售。另一种产品是Biomatrica Vacuette RNAgard血液管。使用这种管时裂解也在收集期间立即发生，并且RNA酶被失活，正如RNA随着血液温育时间保持完整所示出的。相应的方法的缺点在于稳定化引起细胞的完全裂解。细胞的破坏导致细胞内核酸变得与细胞外核酸混合，这阻止了这两种核酸群体的单独分析。此外，不仅分离的核酸的质量和数量以及它们相应的表达情况在分析上是重要的，而且样品例如血液样品中包含的特定细胞的存在、不存在或数目，在分析上也是重要的。由于任何细胞分拣或细胞富集以及相应的细胞分析变得不可能，因此细胞的破坏是极为不利的。
因此，通常提供具体地旨在用于细胞稳定化的特定稳定化试剂和相应的血液收集管。相应的产品允许调查样品在储存后的细胞含量，以例如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析检测肿瘤细胞的存在，或通过流式细胞术(FC)或FACS分析检测不同白血细胞彼此的比率。例如，许多工作流程将标准的EDTA血液收集管用于流式细胞术或FACS分析，尽管血液细胞在储存时间内显示出少量裂解。来自于Streck Inc.的另一种产品是直接抽取式真空血液收集管，其用于保存全血样品用于通过流式细胞术进行免疫表型分型。其保存了白细胞抗原，使得白细胞的子集可以通过流式细胞术分析区分开来。维持白细胞分化抗原簇(CD)标志物的完整性的技术被例如US 5,460,797和US 5,459,073覆盖。
然而，将不同稳定化试剂和相应的稳定化管用于收集样品以进行核酸分析和细胞分析是繁琐的。对于减少在患者地点处每次抽血时用于不同下游测定法(例如细胞的检测和RNA的分析)的不同样品收集管例如血液收集管的数目，存在着需求。因此，需要保护细胞的形态并在同时使核酸稳定的样品收集和稳定化***。
为应对同时进行细胞稳定化和核酸稳定化的需求，开发了基于甲醛释放剂的使用的稳定化***。代表性的稳定化试剂可以从Streck Inc.在商品名无细胞RNA BCT(血液收集管)下商购。这种10ml的血液收集管旨在用于将血浆中的无细胞RNA在室温下保存并稳定化长达3天。所述防腐剂使血浆中的无细胞RNA稳定，并防止在样品处理和储存期间非靶的背景RNA从血细胞释放。US 2011/0111410描述了使用释放甲醛的组分在同一血液样品中实现细胞和RNA的稳定化。因此，这份文件描述了一种技术，在所述技术中稳定化试剂使抽取的血液中的血细胞稳定，从而防止细胞内RNA被无细胞RNA或球蛋白RNA污染，将RNA合成抑制至少2小时，并保护血细胞内的细胞内RNA，以保持血细胞的蛋白表达模式与抽血时相比基本上不变。可以从相应的稳定化的样品分离白细胞，然后从白细胞提取细胞RNA。然而，由于所使用的甲醛释放剂干扰后续的核酸分离过程，因此从相应的稳定化的样品分离核酸非常困难。因此，与使用具体来说旨在用于核酸例如RNA的稳定化和分离的稳定化方法(例如PAXgene血液RNA管)稳定化的核酸的分离相比，核酸得率和/或纯度严重降低。
此外，在现有技术中已知用于稳定化含细胞的样品例如血液或组织样品的方法，所述方法使细胞、转录组、基因组和蛋白质组稳定。这样的方法公开在例如WO 2008/145710中。所述方法是基于特异性稳定化化合物的使用。与包含甲醛释放剂的稳定化方法相反，核酸的分离不受稳定化试剂的损害。
含细胞的生物样品中存在的另一类临床上重要的核酸物质是细胞外核酸。已在血液、血浆、血清和其他体液中鉴定到细胞外核酸。在相应样品中发现的细胞外核酸，由于它们受到保护而免受核酸酶影响(例如因为它们以蛋白脂质复合物的形式分泌、与蛋白质结合或被包含在囊泡内)这一事实，因此具有一定程度的抗降解性。在许多医学病症、恶性肿瘤和感染过程中存在水平升高的细胞外核酸例如DNA和/或RNA，对于疾病进展的筛选、诊断、预后、监测，对于鉴定潜在的治疗靶点以及对于监测治疗反应来说，是尤其重要的。此外，母体血液中升高的胎儿DNA/RNA被用于确定例如性别鉴定、评估染色体异常和监测妊娠相关的并发症。因此，细胞外核酸在非侵入性诊断和预后中特别有用，并且可以在许多应用领域例如非侵入性产前遗传检测、肿瘤学、移植医学或许多其他疾病中用作例如诊断标志物，并因此具有诊断相关性(例如胎儿来源的核酸或肿瘤来源的核酸)。然而，在健康人类中也发现了细胞外核酸。细胞外核酸的常见应用和分析方法被描述在例如下述文献中：WO97/035589，WO97/34015，Swarup等，FEBS Letters 581(2007)795-799，FleischhackerAnn.N.Y.Acad.Sci.1075:40-49(2006)，Fleischhacker和Schmidt，Biochmica etBiophysica Acta 1775(2007)191-232，Hromadnikova等，(2006)DNA and Cell biology,Volume 25,Number 11 pp 635-640；Fan等，(2010)Clinical Chemistry 56:8。
传统上，从含细胞的生物样品例如血液分离细胞外核酸的第一步骤是获得所述样品的基本上无细胞的级分，例如在血液的情况下为血清或血浆。然后从所述无细胞的级分分离细胞外核酸，在处理血液样品时，所述无细胞的级分通常为血浆。然而，获得样品的基本上无细胞的级分可能是有困难的，并且分离常常是繁琐和耗时的多步骤过程，因为重要的是使用仔细控制的条件来防止离心期间细胞破裂，所述细胞破裂可能使细胞外核酸被破裂期间释放的细胞内核酸污染。此外，通常难以去除所有细胞。因此，许多往往且通常被分类为“无细胞”的处理后的样品例如血浆或血清，事实上仍含有在分离过程中未被去除的残留量的细胞。另一个重要的考虑因素是：由于离体温育期间的细胞破裂，通常在从抽血事件起相对短的时间段内，细胞内核酸从样品中包含的细胞中释放出来。一旦开始细胞裂解，裂解的细胞就释放出另外的核酸，其与细胞外核酸混合，并且回收用于测试的细胞外核酸变得越来越困难。现有技术中讨论了这些问题(参见例如Chiu等(2001)，Clinical Chemistry47:91607-1613；Fan等(2010)和US2010/0184069)。此外，由于降解，可用的细胞外核酸的量和可回收性可能随时间而显著降低。
具体地旨在使全血中包含的循环核酸稳定的方法在现有技术中是已知的。一种方法使用甲醛使细胞膜稳定，从而减少细胞裂解，此外甲醛抑制核酸酶。相应的方法被描述在例如US 7,332,277和US 7,442,506中。然而，甲醛或释放甲醛的物质的使用具有缺点，因为它们可能通过诱导核酸分子之间或蛋白质与核酸之间的交联而损害细胞外核酸的分离效率。使血液样品稳定的可替选方法被描述在例如US 2010/0184069和US 2010/0209930中。这证实了对提供用于使含细胞的生物样品稳定以允许有效回收例如这样的样品中包含的细胞外核酸的手段的极大需求。
对开发引起含细胞的生物样品例如全血样品中包含的基因表达情况和细胞外核酸群体的稳定化、从而使得这些被稳定了的样品的操作和分别处理更容易的样品处理技术，仍存在持续不断的需求。
本发明的目的是克服现有技术的样品稳定化方法的至少一种缺点。具体来说，目的是提供一种能够使含细胞的样品、尤其是全血样品稳定的方法。具体来说，目的是提供一种允许使含细胞的样品中包含的核酸稳定的样品稳定化方法。此外，目的是提供一种不基于细胞裂解，并且使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体以及所包含的细胞的基因表达情况稳定的样品稳定化方法。
发明概述
本发明是基于以下发现：在使包含细胞外核酸的含细胞的生物样品、尤其是全血样品或源自于全血的样品例如血浆稳定方面，某些添加剂令人吃惊地有效。已发现，这些添加剂在使细胞外核酸群体稳定方面高度有效，尤其是能够避免或至少显著减少基因组DNA、尤其是片段化基因组DNA的污染。此外，已发现，这些添加剂还能够使所包含的细胞的基因表达情况稳定，从而允许进行可靠的基因表达情况分析。与现有技术方法相反，所述稳定化效应不基于细胞裂解。因此，本文中描述的稳定化技术还允许在需要时分开地分析细胞外和细胞内核酸群体。此外，本文中描述的稳定化允许分析稳定化的样品中包含的细胞，例如细胞形态和/或细胞表面特征。
根据本发明的第一方面，提供了一种用于使含细胞的样品稳定的方法，在所述方法中将样品与至少一种式1的化合物相接触：
其中R1是氢基团或烷基基团，R2和R3是以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的相同或不同的烃基团，R4是氧、硫或硒基团，并且其中所述式1的化合物是N,N-二烷基丙酰胺。
N,N-二烷基丙酰胺例如N,N-二甲基丙酰胺是用于含细胞的样品、尤其是血液样品的非常有效的稳定剂。已发现，添加相应的化合物对细胞外核酸群体具有有利的稳定化效果。正如实施例所示，根据式1的化合物的N,N-二烷基丙酰胺适用于使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定。此外，正如实施例所示，这些化合物适合于稳定化并因此保留所包含的细胞的基因转录情况。正如实施例所示，在稳定化后，稳定化期间基因表达情况的变化被减少或甚至被阻止。因此，在用N,N-二烷基丙酰胺稳定化后，基因表达情况基本上被“冻结”，并因此保留在样品收集和相应的样品稳定化的状态下。所述含细胞的样品优选地选自全血、血浆或血清。此外，获得的使细胞稳定的性质允许分析并且也分离稳定化的样品中包含的特定细胞，例如血液样品中包含的血细胞或循环的肿瘤细胞。
为了提高稳定化效果，本发明的目的还包括提供稳定剂的其他组合，以便例如使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体和/或所包含的细胞的基因转录情况稳定。相应的组合可以包含至少一种如上定义的式1的化合物和至少一种细胞凋亡抑制剂，所述式1的化合物是N,N-二烷基丙酰胺。令人吃惊的是，已发现细胞凋亡抑制剂例如尤其是半胱天冬酶抑制剂，减少了细胞外核酸群体被源自于样品中包含的细胞例如损坏或垂死的细胞的细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA的污染。因此，包含细胞凋亡抑制剂的稳定化组合，非常有效地使样品中包含的细胞外核酸群体基本上保持其在获得以及相应地收集所述生物样品时所显示的状态。
相应的组合还可以包含提高稳定化效果的其他添加剂，例如螯合剂。在样品是血液或源自于血液的样品的情形中，通常也添加抗凝剂。螯合剂例如EDTA适用于此目的。相应的稳定化组合可以被有利地用在所述第一方面的使含细胞的样品稳定的方法中。
根据第二方面，提供了一种用于从生物样品分离核酸的方法，其中所述方法包括下列步骤：
a)按照本发明的第一方面中限定的方法使含细胞的样品稳定；
b)从被稳定了的样品分离核酸。
步骤a)中的稳定化可以按照如上所述的本发明的第一方面来实现。正如上面讨论的，本发明的稳定化尤其具有使样品中包含的细胞外核酸群体基本上保持其在获得或相应地收集所述生物样品时所显示出的状态的效果。因此，从相应稳定化的样品获得的细胞外核酸与从未稳定化的样品获得的细胞外核酸相比，包含的由例如样品内包含的衰退细胞产生的细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA的污染更少。细胞外核酸群体的显著保护是一个重要的优点，因为这种稳定化/保护提高了任何后续试验的准确性。这允许使细胞外核酸群体的分离和后续分析标准化，从而使基于细胞外核酸级分的诊断或预后应用更加可靠并更加不依赖于所使用的储存/操作条件。因此，提高了相应分离的细胞外核酸的诊断和预后适用性。具体来说，本发明的教导具有下述优点，即，某些细胞外核酸分子的比率与样品被收集时的比率相比，可以保持基本上恒定。稳定化使得细胞内核酸基本上被保持在细胞内并且使细胞外核酸基本上被稳定化。此外，本文中描述的稳定化方法还适用于使细胞内核酸稳定。在样品稳定化后，细胞内RNA受到保护以免于降解，此外，所包含的细胞的基因转录情况的变化受到抑制。因此，本文中描述的稳定化具体地减少体外降解并使基因诱导降至最低。因此，从相应稳定化的样品分离的细胞内核酸良好地适用于例如基因表达情况分析和需要准确地代表稳定化的样品中的体内转录本水平的其他分析方法。此外，有利的是，本文中描述的稳定化方法在需要时允许从同一稳定化的样品中分开地分离稳定化的细胞外核酸和稳定化的细胞内核酸。
根据第三方面，提供了适用于使含细胞的生物样品稳定的组合物，所述组合物包含：
a)至少一种如上定义的式1的化合物；以及
b)至少一种抗凝剂，优选为螯合剂。
通过使含细胞的生物样品、尤其是全血、血浆和/或血清中包含的细胞和细胞外核酸群体稳定，相应的稳定化组合物在使所述样品稳定方面特别有效。此外，相应的稳定化组合物在使所包含的细胞的基因转录情况稳定方面有效。此外，正如实施例所示，所包含的细胞的重要细胞特征例如细胞形态和/或细胞表面特征，可以被保留。相应的稳定化组合物允许样品例如全血在室温下储存和/或操作例如运输至少两天，或优选地至少三天，而基本上不损害所述样品和相应地其中包含的细胞外核酸群体的质量。因此，当使用本发明的稳定化组合物时，样品收集例如血液收集与核酸提取之间的时间可以变化，而对样品中包含的细胞外核酸群体或所包含的细胞的基因表达情况没有显著影响。这是一个重要的优点，因为它降低了由不同操作程序造成的细胞外核酸群体和细胞内核酸群体、尤其是转录本水平的可变性。根据一种实施方式，所述组合物另外地包含至少一种细胞凋亡抑制剂，优选为半胱天冬酶抑制剂。
根据第四方面，提供了用于收集含细胞的生物样品、优选为血液样品的容器，其中所述容器包含本发明的第三方面的组合物。提供包含所述稳定化组合物的相应容器例如样品收集管，具有一旦将样品收集在相应容器中后就立即使样品稳定的优点。此外，相应的样品收集容器、尤其是血液收集管，能够使血细胞和它们的基因转录情况稳定，并且能够使血液样品或源自于血液的样品中包含的细胞外核酸以及任选地病毒和相应的病毒核酸稳定。因此，又一问题得以克服。
根据第五方面，提供了一种方法，所述方法包括将生物样品、优选为血液从患者直接收集、优选地抽取到本发明的第四方面的容器的腔室中的步骤。
根据第六方面，提供了生产本发明的第三方面的组合物的方法，其中将所述组合物的组分混合，优选地在溶液中混合。当在本文中使用时，术语“溶液”具体是指液体组合物，优选为水性组合物。它可以是仅仅一种相的均匀混合物，但是包含固体组分例如沉淀物的溶液也落在本发明的范围之内。
对于本领域技术人员来说，从下面的描述和随附的权利要求书，本发明的其他目的、特征、优点和方面将变得明显。然而，应该理解，下面的描述、随附的权利要求书和具体实施例，尽管指出了本申请的优选实施方式，但是仅仅是为了说明而给出的。
附图简述
图1至4：来自于实施例1的样品的FOS、IL1B、IL8和TP53的相对转录本水平。转录本使用实时单重RT-PCR测定法来分析。作为各个样品的循环阈值(CT)给出的转录本水平被示出为白色条，平均值被示出为带有标准偏差的实心黑色条，并且被用作基因表达变化的阳性对照的不同实验的其他献血者的对照样品和每次PCR运行内的RT-PCR(板对照)被示出为阴影条。
图5：来自于从一位献血者收集到EDTA管中的血液的等分试样的荧光激活细胞分选(αCD3FACS)分析。对来自于在血液收集后未温育的(0小时)样品和在室温下温育1天和3天后的(24小时，72小时)样品的血液等分试样，使用PE-偶联的抗CD3抗体进行FACS。对荧光标记的细胞数目进行计数，并对每个事件的荧光信号强度进行定量。荧光信号的强度(x-轴)和数目(y-轴)被示出为直方图。定义了阈值以将弱的非特异性荧光信号(-)与由特异性结合到细胞的抗CD3抗体引起的较强的特异性荧光信号(+)区分开。阈值在每张图片中被示出为竖直虚线。
FACS(-)对照(EDTA)＝收集在EDTA管中、保持未用稳定剂处理并且不与抗体温育的血液的等分试样(未染色的样品)，其用作FACS分析的阴性对照。检测到的弱的信号由自体荧光和非特异性结合的抗体(背景染色)引起。
FACS(+)对照(EDTA)＝收集在EDTA管中、保持未用稳定剂处理并且与抗体温育的血液的等分试样(染色的样品)，其用作FACS分析的阳性对照。除了也在FACS(-)对照中出现的弱的信号之外，检测到了专有地由特异性结合到细胞的抗体引起的强信号。
试验溶液5％v/v DMPA＝收集在EDTA管中并与稳定剂(终浓度为5％v/v的N,N-二甲基丙酰胺，5x MOPS缓冲液，pH5.5)混合，然后与抗体温育的血液的等分试样(染色的样品)。
FACS(+)对照/试验溶液＝FACS(+)对照(EDTA)[灰色区域]和试验样品[黑色线]的合并的直方图。
图6-7：没有半胱天冬酶抑制剂的情况下N,N-二甲基丙酰胺对18S rDNA增加的影响(实施例2)。
图8-16：与半胱天冬酶抑制剂组合的不同浓度的N,N-二甲基丙酰胺对18S rDNA增加的影响(实施例3-5)。
发明详述
本发明涉及适用于使含细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体和/或所包含的细胞的基因转录情况稳定的方法、组合物和装置以及因此适用于其的技术。本文公开的稳定化技术例如降低了细胞外核酸群体被源自于、例如释放自样品中包含的损坏和/或垂死细胞的细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA的污染的风险。此外，本文中公开的稳定化技术基本上保留所包含的细胞的基因转录情况，从而允许可靠地分析基因表达情况。此外，本文中描述的稳定化防止细胞外核酸被细胞内核酸污染以及细胞内核酸被细胞外核酸污染，这允许从同一稳定化的含细胞的样品分开地分析细胞外核酸群体和细胞内核酸。因此，本发明实现了样品的稳定化并因此实现了其中包含的细胞外核酸群体的稳定化而没有所包含的细胞的裂解。相反，样品中包含的细胞被稳定化，从而基本上阻止或减少了细胞内核酸的释放。此外，正如实施例所示，通过抑制转录本水平的改变和因此的变化，基本上保留了所包含的细胞的基因转录情况。此外，可以从稳定化的样品回收细胞，并且所述细胞适用于不同分析。例如，如果需要，可以分析所包含的细胞的细胞形态和/或细胞表面特征。此外，可以对稳定化的样品进行分析以确定特定细胞例如肿瘤细胞、例如全血样品中存在的循环肿瘤细胞的存在或不存在。使用本发明的方法和组合物实现的显著的核酸稳定作用，允许在室温下长期储存和/或操作稳定化的样品，而不损害样品以及相应地其中包含的细胞外核酸的质量。由于在通过使用本发明的教示获得样品时细胞外核酸群体和细胞内转录组的组成被稳定化并因此受到显著保护，因此样品收集与核酸提取之间的时间可以变化，而不显著影响细胞外核酸群体的组成。由于样品操作/储存中的变化性对细胞外核酸群体的质量和相应地组成具有较小影响，这允许对例如诊断或预后性细胞外核酸分析进行标准化，从而提供了超过现有技术方法的重要优点。因此，样品和相应地从相应稳定化的样品获得的细胞外核酸变得更加可比。此外，获得的所包含的细胞的基因转录情况的稳定化，即使在稳定化的样品长期储存后也允许可靠的基因表达分析。此外，有利的是，本发明的教示排除了为了避免以及相应地减少细胞外核酸被否则将从衰退细胞释放的细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA的污染而将样品中包含的细胞与样品的无细胞部分直接分离的必要性。这一优点相当大地简化了样品操作，尤其是全血样品的操作。例如，在诊所中获得并按照本发明的教示稳定化的全血样品可以在室温下运输，并且可以在接收的临床实验室中方便地将含有细胞外核酸的血浆与所包含的细胞分离开。然而，当处理剥除细胞的生物样品或通常被称为“无细胞的”样品例如血浆或血清时，本发明的教示也是有利的。相应的剥除细胞或“无细胞的”生物样品可能仍然(也取决于所使用的分离方法)包含残留的细胞、尤其是包含基因组DNA的白细胞，这因此造成了下述风险，即如果(潜在)残留的细胞在运输或储存过程中破坏或死亡，细胞外核酸群体将变得被细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA越来越多地污染。当使用本发明教示的稳定化方法时，这种风险被相当大地降低。由于本发明的技术允许在样品被收集并与稳定剂相接触时有效地保护样品的细胞外核酸群体和所包含的细胞的基因表达情况，因此所述样品可以在接收机构中正确发挥作用，以便从所述样品分离细胞外核酸，同时基本上避免并相应地减少细胞外核酸群体被细胞内核酸的污染。可以从稳定化的细胞分离细胞内核酸并且可以将其用于例如基因表达情况分析。接收样品的机构例如实验室通常也具有必需的设备例如高速离心机(或其他手段，也参见下文)，以有效地除去样品中包含的细胞，包括可能存在于细胞剥除样品例如血浆中的残留细胞。这样的设备在获得样品的机构中通常不存在。因此，当稳定化包含大量细胞的生物样品例如全血样品时本发明具有许多优点，但是当稳定化仅包含少量细胞或可能仅仅是怀疑含有细胞的生物样品例如血浆、血清、尿液、唾液、滑液、羊水、泪液、脓液、淋巴液、溶液、脑脊液等时，也具有重要优点。
根据第一方面，提供了一种用于使含细胞的样品、优选为血液样品稳定的方法，所述方法包括将样品与至少一种式1的化合物相接触：
其中R1是氢基团或烷基基团，R2和R3是以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的相同或不同的烃基团，R4是氧、硫或硒基团，并且其中所述式1的化合物是N,N-二烷基丙酰胺。
因此，在第一方面中，提供了通过将含细胞的生物样品与至少一种N,N-二烷基丙酰胺相接触而使所述样品稳定的方法。N,N-二烷基丙酰胺是一种式1的化合物，其中R1是C2烷基基团，R2和R3是相同或不同的烷基基团，并且R4是氧。
正如由提供的实施例所示，这样的化合物在实现对含细胞的样品的显著稳定化效应方面，例如在基本上保留稳定化的样品中细胞外核酸群体的组成方面，是尤其有效的。由此，细胞外核酸群体被源自于所包含的细胞、例如源自于破坏或垂死细胞的细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA污染的风险被降低，和/或样品中存在的核酸的降解被减少或相应地抑制。这具有使所述样品中包含的细胞外核酸群体的组成基本上保持并相应地稳定的效果。此外，一种或多种式1的化合物的混合物，也可用于稳定化。
当在本文中使用时，术语“细胞外核酸”具体是指未包含在细胞中的核酸。相应的细胞外核酸通常也被称为无细胞核酸。这些术语在本文中作为同义词使用。因此，细胞外核酸通常存在于样品内细胞的外部或多个细胞的外部。术语“细胞外核酸”是指例如细胞外RNA以及细胞外DNA。在生物样品例如体液如血浆的无细胞级份(相应地部分)中存在的典型的细胞外核酸的实例，包括但不限于哺乳动物细胞外核酸例如肿瘤相关或肿瘤衍生的细胞外DNA和/或RNA、其他疾病相关的细胞外DNA和/或RNA、表观遗传上修饰的DNA、胎儿DNA和/或RNA、小干扰RNA例如miRNA和siRNA，以及非哺乳动物细胞外核酸例如从原核生物(例如细菌)、病毒、真核寄生虫或真菌释放到细胞外核酸群体中的病毒核酸、病原体核酸。细胞外核酸群体通常包含一定量的从损坏或垂死细胞释放的细胞内核酸。例如，血液中存在的细胞外核酸群体通常包含从损坏或垂死细胞释放的细胞内球蛋白mRNA。这是在体内发生的天然过程。细胞外核酸群体中存在的这类细胞内核酸甚至可以在后续核酸检测方法中用于对照的目的。本文中描述的稳定化方法具体来说降低了在收集含细胞样品后，由于所述样品的离体操作造成的细胞外核酸群体中包含的细胞内核酸例如基因组DNA的量显著增加的风险。因此，由于离体操作造成的细胞外核酸群体的变化被减少，并且甚至可以被阻止。根据一种实施方式，细胞外核酸获自并相应地包含在作为含细胞的生物样品的体液中，例如血液、血浆、血清、唾液、尿液、溶液、脑脊液、痰液、泪液、汗液、羊水或淋巴液。在本文中，我们将从循环体液获得的细胞外核酸称为循环细胞外或循环无细胞核酸。根据一种实施方式，术语细胞外核酸尤其是指哺乳动物细胞外核酸。实例包括但不限于疾病相关或疾病来源的细胞外核酸，例如肿瘤相关或肿瘤衍生的细胞外核酸、由于炎症或损伤、尤其是创伤而释放的细胞外核酸、与其他疾病相关和/或由于其他疾病而释放的细胞外核酸、或源自于胎儿的细胞外核酸。本文中描述的术语“细胞外核酸”还指从其他样品、尤其是体液之外的生物样品获得的细胞外核酸。通常，样品中包含超过一个的细胞外核酸。通常，样品包含超过一种类型或种类的细胞外核酸。当在本文中使用时，术语“细胞外核酸群体”具体是指包含在含细胞样品中的不同细胞外核酸的集合。含细胞样品通常包含特征性并因此独特的细胞外核酸群体。因此，特定样品的细胞外核酸群体中包含的一种或多种细胞外核酸的类型、种类和/或量，是重要的样品特征。因此，正如上面讨论的，使所述细胞外核酸群体稳定并因此基本上保护所述细胞外核酸群体是重要的，因为样品的细胞外核酸群体中包含的一种或多种细胞外核酸的组成和/或量，可以在医学、预后或诊断领域中提供有价值的信息。因此，如果有效地使细胞外核酸群体的情况稳定，将是有利的。具体来说，在样品收集后，减少细胞外核酸群体被细胞内核酸、尤其是基因组DNA的污染和因此的稀释是重要的。可以使用本发明的稳定化技术实现的细胞外核酸群体的显著保护，允许在稳定化时期后样品内的细胞外核酸群体与样品稳定化的时刻的细胞外核酸的群体相比维持基本上不变。至少，与未稳定化的样品或在血液样品或源自于血液的样品的情形中用例如EDTA稳定化的相应样品相比，在所包含的细胞外核酸的数量、质量和/或组成方面，在稳定化时期后细胞外核酸群体的变化、尤其是可归因于释放的基因组DNA的增加的变化相当大地降低(优选地降低至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％)。
此外，如上所述，本发明的方法还适用于使细胞内核酸、尤其是细胞内RNA稳定。将含细胞的样品与式1的N,N-二烷基丙酰胺相接触，导致所包含的细胞的基因转录本水平被稳定化。因此，与未稳定化的样品相比，稳定化的样品中新转录本的产生和已有转录本的降解受到抑制，从而在稳定化后基本上“冻结”了所包含的细胞的基因转录情况。因此，稳定化还适合于通过将转录本水平维持在它们在样品收集和稳定化时所显示的状态，使转录组稳定。术语转录组具体是指在一个或一群细胞中产生的整套所有RNA分子，包括mRNA、rRNA、tRNA和其他非编码RNA例如miRNA。正如通过实施例证实的，含细胞的生物样品例如血液样品可以被稳定化至少三天和甚至更长时间，而没有转录本水平的显著改变。具体来说，通过减少RNA降解和最小化基因表达的变化例如特别是基因诱导或下调，使基因转录情况稳定。不受理论限制，据信本文中用于稳定化的式1的化合物抑制细胞内过程，由此抑制转录本的新的合成以及现有转录本的降解。据信，为了实现这些效果，它们进入细胞并因此是可透过细胞的。因此，在含细胞的样品的收集和稳定化后，在收集以及相应的稳定化时存在的体内基因表达情况受到保护。此外，RNA的质量和完整性得以维持，从而提供了在样品收集和相应的样品稳定化时体内转录本水平的准确代表，并允许获得真实和准确的转录本水平。在稳定化后体内基因转录情况的保护，允许使用相应稳定化的样品进行例如需要转录本水平的准确代表的基因表达情况分析或其他分析方法。然而，尽管合乎需要，但通常不需使所有转录本水平稳定或同样好地稳定。对于特定或新的靶转录本来说，稳定化以及因此性能特征应该被验证，这在使用使基因表达情况稳定的现有技术时也是常见的。基因转录情况或特定转录本水平的稳定化的实现，可以在例如为分析基因转录情况的稳定化而建立的标志物基因的基础上确定。根据一种实施方式，通过所述方法实现的所包含的细胞的基因转录情况或转录本水平的稳定化，导致在稳定化后选自c-fos、IL-1β、IL-8和p53的一个或多个，优选为两个或更多标志物基因被稳定化至少48小时。这些标志物基因被鉴定为在储存期间提供非常不稳定的转录本，并且因此在样品收集后不存在被上调或下调的适当的稳定化。因此，这些基因的转录本水平适合作为标记物来分析基因转录水平的稳定化是否实现。稳定化效果可以使用实施例中描述的实时RT-PCR测定法来分析。根据一种实施方式，在T0(稳定化时间点)与稳定化时间段终点之间，一个或多个这些标志物基因的转录本水平的改变不超过1.5CT值，优选地1.25CT值，更优选地1CT值。优选地，相应的稳定化效果实现至少48小时、至少72小时或至少96小时。优选地，至少使用标志物基因c-fos、IL8和IL-1β，并且优选地使用所有上述标志物基因时，实现相应的稳定化特征。正如实施例所示，N,N-二甲基丙酰胺实现相应的稳定化性能，并因此是优选的稳定剂。
此外，由于本发明的方法不基于细胞裂解，因此可以在稳定化时期后从稳定化的样品分离细胞，并且从稳定化的样品分离的细胞适用于分析。例如，如上所述，可以从所包含的细胞分离细胞内核酸例如RNA，并可以对其进行分析。此外，稳定化的样品中细胞的保护，为分选或捕获细胞以及甚至富集随后可以进行特定分析的特定细胞例如肿瘤细胞，开辟了可能性。例如，可以分离循环肿瘤细胞，并且可以分析它们的基因表达情况。此外，可以分析细胞形态和/或细胞标志物、尤其是细胞表面标志物，以便表征获得的细胞。此外，可以从所述富集的特定细胞分离细胞内核酸。例如，可以从所述细胞分离RNA。本文中描述的稳定化方法的使转录本水平稳定的性质，有利地允许将分离的RNA用于基因表达情况分析和其他重要分析。因此，本文中描述的稳定化方法在例如癌症或其他疾病的分子诊断中是有利的，因为它允许在富集细胞后从所述富集的细胞提取核酸，从而提高了例如检测含细胞的样品例如血液样品中稀有的循环肿瘤细胞事件的机会。这也提高了在样品中鉴定到特定生物标志物、尤其是稀有的生物标志物的机会。
根据一种实施方式，所述含细胞的样品是血液样品，并且其中白细胞被稳定化。这允许从稳定化的样品分离白细胞。如果在优选为至少48小时的稳定化时期中至少一种类型的被包含的白细胞被稳定化，则白细胞被稳定化。根据一种实施方式，血液样品中包含的淋巴细胞和/或单核细胞被稳定化。本文中描述的稳定化不诱导或促进含细胞样品中包含的有核细胞的裂解。因此，稳定化不基于细胞裂解。优选地，当含细胞样品是血液并且目标核酸是细胞外核酸、尤其是细胞外RNA时，本文中使用的稳定化防止溶血。体外溶血的大多数原因与样本收集有关。然而，如果使用不恰当的稳定化方法，体外溶血通常也在离体储存期间发生在血液样品中。取决于目标细胞外核酸，溶血可能是相当大的问题。如果目标细胞外核酸是DNA，则溶血造成的问题较小，因为红细胞不含细胞核并因此不含基因组DNA。因此，在溶血期间没有细胞内DNA从红细胞释放。当目标细胞外核酸是DNA时，尤其是白细胞的裂解或衰退造成问题，因为在这种情况下除了细胞内RNA之外还释放出基因组DNA。因此，当目标细胞外核酸是细胞外DNA时，必须防止尤其是白细胞的裂解。白细胞彼此之间在它们的稳定性特征方面可能有差异。因此，某些类型的白细胞比其他类型更稳定。然而，一般来说，白细胞明显比红细胞更稳定。因此，红细胞的裂解不必然表明白细胞被裂解。白细胞与红细胞对裂解的不同易感性，在本领域中也被用于例如在保护白细胞的同时特异性裂解红细胞，以便允许例如收集白细胞。然而，如果目标细胞外核酸是RNA，溶血以及因此红细胞的裂解则不构成问题。成熟的红细胞也不含RNA，然而，它们的前体(网织红细胞)含有RNA。网织红细胞占红细胞的约0.5％至1％，并含有大量球蛋白RNA。因此，尤其是当目标细胞外核酸是RNA时，应该防止/减少红细胞以及因此网织红细胞在储存期间的裂解，以减少细胞外核酸群体、尤其是细胞外RNA群体被球蛋白mRNA的稀释。此外，如上所述，重要的是维持细胞外核酸群体的组成以及因此分布情况，这使用本文中描述的稳定化方法来实现，因为这对于许多诊断应用来说是重要的。当使用本发明的稳定化方法时，溶血可以被有效地阻止/减少。由此，细胞外核酸群体被基本上保护，并且此外，稳定化的血液样品、尤其是从稳定化的血液样品获得的血浆或血清，由于防止了溶血和细胞裂解，一般来说也适用于其他标准实验室分析。
根据一种实施方式，在优选为至少48小时的稳定化时期中，细胞的形态受到保护。这允许基于形态进行分析和任选地表征所包含的细胞。根据一种实施方式，有核细胞的形态受到保护。根据一种实施方式，在稳定化期间血液样品中包含的淋巴细胞的形态受到保护。
根据一种实施方式，细胞表面表位受到保护。根据一种实施方式，细胞表面蛋白例如CD蛋白受到保护。正如实施例所示，使用式1的N,N-二烷基丙酰胺的稳定化保护了细胞表面表位和细胞表面蛋白。这是有利的，因为它允许在所包含的细胞的表面特征的基础上表征和/或分离这些细胞。尤其是，它允许分析细胞表面上存在的肿瘤标志物。
根据一种实施方式，稳定化方法包括将血液样品与N,N-二烷基丙酰胺和抗凝剂相接触，其中所包含的细胞中的转录本水平被稳定化。此外，如实施例中所示，另外地使细胞外核酸群体稳定。这是有利的，因为它允许从同一稳定化的样品分开地分析细胞外核酸群体和细胞内核酸群体。
烃基团R2和/或R3可以彼此独立地选自烷基，包括短链烷基和长链烷基。优选地，使用在本发明的范围内总体描述的基团内的下列基团：
烷基：优选为短链烷基，尤其是直链和支链C1-C5烷基或长链烷基：直链和支链C5-C20烷基。
R2和/或R3的链长n具体来说具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的值。R2和R3可能具有1-10的碳链长度。在这种情况下，链长n具体来说可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的值。优选地，R2和R3具有1-5的碳链长度，并且在这种情况下，链长具体可以具有1、2、3、4和5的值。对于R2和R3来说，特别优选的是1或2的链长。如上所述，在本发明中使用的式1的化合物是N,N-二烷基丙酰胺。
如实施例中所示，N,N-二烷基丙酰胺例如N,N-二甲基丙酰胺可用于使含细胞的样品例如血液样品稳定。
当将含细胞的生物样品与式1的化合物以及因此N,N-二烷基丙酰胺或与相应的化合物的混合物相接触时获得的混合物，可以包含终浓度为至少0.1％、至少0.25％、至少0.5％、至少0.75％、至少1％、至少1.25％或至少1.5％的所述化合物或化合物的混合物。适合的浓度范围包括但不限于0.1％直至50％。优选的浓度范围可以选自0.1％至30％、0.1％至20％、0.1％至15％、0.1％至10％、0.1％至7.5％、0.1％至5％；1％至30％、0.75％至10％、1％至20％、1％至15％、1％至10％、1％至7.5％、1％至5％；1.25％至30％、1.25％至20％、1.25％至15％、1.25％至10％、1.25％至7.5％、1.25％至5％；1.5％至30％、1.5％至20％、1.5％至15％、1.5％至10％、1.5％至7.5％和1.5％至5％。当使用N,N-二甲基丙酰胺作为稳定剂时，相应的浓度是特别适合的。为了使转录本水平稳定，优选地在混合物中使用处于2.5％至10％、优选地3％至8％、更优选地4％至7.5％范围内的浓度。正如实施例所示，为了使细胞外核酸群体稳定，也可以使用较低浓度。上面提到的浓度非常适合于例如使全血或血液制品例如血浆稳定。适用于式1的其他化合物和/或其他含细胞的生物样品的浓度范围，也可以由专业技术人员使用常规实验来确定，例如通过在实施例中描述的试验测定法中测试所述化合物及其相应不同的浓度。用于稳定化的其他添加剂的使用，允许例如使用较低浓度。
优选地，将式1的化合物以及因此N,N-二烷基丙酰胺与用于稳定化含细胞样品的螯合剂组合使用。具体来说，当稳定化血液样品或源自于血液的样品例如血浆或血清时，可以将螯合剂用作抗凝剂。适合的螯合剂和浓度范围在下面提供。
根据一种实施方式，使用稳定剂的组合，其包含如上定义的至少一种式1的化合物、即N,N-二烷基丙酰胺以及细胞凋亡抑制剂。单独的细胞凋亡抑制剂已经能够有效使含细胞样品稳定并基本上保护细胞外核酸群体，免于尤其是由片段化基因组DNA的污染引起的组成变化。因此，当另外地使用细胞凋亡抑制剂时获得的稳定化效果被增强。可以将样品与细胞凋亡抑制剂相接触，例如向样品加入细胞凋亡抑制剂或与之相反。优选地，使用包含N,N-二烷基丙酰胺、优选为N,N-二甲基丙酰胺和细胞凋亡抑制剂的稳定化组合物。在得到的混合物中存在的至少一种细胞凋亡抑制剂支持样品中包含的细胞的稳定化并抑制样品中包含的核酸的降解，从而有助于基本上保护细胞外核酸群体。
当在本文中使用时，术语“细胞凋亡抑制剂”具体是指其在含细胞生物样品中的存在提供了细胞内细胞凋亡过程的减少、阻止和/或抑制，和/或使细胞对细胞凋亡刺激更有抗性的化合物。细胞凋亡抑制剂包括但不限于蛋白质、肽或蛋白样或肽样的分子、有机和无机分子。细胞凋亡抑制剂包括起到代谢抑制剂、核酸降解和相应地核酸通路的抑制剂、酶抑制剂尤其是半胱天冬酶抑制剂、依钙蛋白酶抑制剂和参与细胞凋亡过程的其他酶的抑制剂的作用的化合物。相应的细胞凋亡抑制剂列于表1中。优选地，用于使含细胞生物样品稳定的至少一种细胞凋亡抑制剂选自代谢抑制剂、半胱天冬酶抑制剂和钙蛋白酶抑制剂。每种类型的适合的实例在表1中列于相应的类目中。优选地，细胞凋亡抑制剂是可透过细胞的。
使用来自于相同或不同细胞凋亡抑制剂类型的不同细胞凋亡抑制剂的组合，以及相应地使用通过相同或不同作用机制抑制细胞凋亡的不同细胞凋亡抑制剂的组合，也在本发明的范围之内。
在有利的实施方式中，细胞凋亡抑制剂是半胱天冬酶抑制剂。半胱天冬酶基因家族的成员在细胞凋亡中发挥重要作用。为了开发成功地竞争半胱天冬酶结合的肽，已调查了各个半胱天冬酶的底物偏好性或特异性。通过将半胱天冬酶特异性肽偶联于例如醛、腈或酮化合物，可以产生半胱天冬酶激活的可逆或不可逆抑制剂。例如，氟甲基酮(FMK)衍生的肽例如Z-VAD-FMK起到有效的不可逆抑制剂的作用，并且没有附加的细胞毒性效应。合成的在N-端和O-甲基侧链处具有苯甲酰氧基羰基(BOC)的抑制剂表现出高的细胞渗透性。此外，还合成了在C-端处具有苯氧基的其他适合的半胱天冬酶抑制剂。一个实例是Q-VD-OPh，其是可透过细胞的不可逆广谱半胱天冬酶抑制剂，在阻止细胞凋亡方面甚至比半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK更有效。
根据一种实施方式，除了N,N-二烷基丙酰胺、优选为N,N-二甲基丙酰胺之外使用的半胱天冬酶抑制剂是泛半胱天冬酶抑制剂(pancaspase inhibitor)，因此是广谱半胱天冬酶抑制剂。根据一种实施方式，半胱天冬酶抑制剂包含修饰的半胱天冬酶特异性肽。优选地，所述半胱天冬酶特异性肽用醛、腈或酮化合物修饰。根据优选实施方式，半胱天冬酶特异性肽优选地在羧基端用O-苯氧基或氟甲基酮(FMK)基团修饰。根据一种实施方式，半胱天冬酶抑制剂选自Q-VD-OPh和Z-VAD(OMe)-FMK。在一种实施方式中，使用泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD(OMe)-FMK，其是不可逆的竞争性肽抑制剂并阻断半胱天冬酶-1家族和半胱天冬酶-3家族的酶。在优选实施方式中，使用Q-VD-OPh，其是半胱天冬酶的广谱抑制剂。Q-VD-OPh是可透过细胞的，并抑制通过细胞凋亡的细胞死亡。Q-VD-OPh即使在极高浓度下也对细胞无毒，并由偶联到氨基酸缬氨酸和天冬氨酸的羧基端苯氧基构成。它在阻止由三种主要细胞凋亡途径即半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10、以及半胱天冬酶-12介导的细胞凋亡中同等地有效(Caserta等，2003)。其他的半胱天冬酶抑制剂列于表1中。根据一种实施方式，作为细胞凋亡抑制剂用于使含细胞样品稳定的半胱天冬酶抑制剂，是作用于位于细胞的细胞内细胞死亡途径下游的一种或多种半胱天冬酶例如半胱天冬酶-3的抑制剂。在一种实施方式中，半胱天冬酶抑制剂是选自半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10和半胱天冬酶-12的一种或多种半胱天冬酶的抑制剂。使用半胱天冬酶抑制剂的组合也在本发明的范围之内。
当除了N,N-二烷基丙酰胺之外还使用半胱天冬酶抑制剂时，在将生物样品与至少一种细胞凋亡抑制剂接触后获得的混合物，可以包含浓度选自至少0.01μM、至少0.05μM、至少0.1μM、至少0.5μM、至少1μM、至少2.5μM或至少3.5μM的细胞凋亡抑制剂。当然，也可以使用更高的浓度。对于细胞凋亡抑制剂来说，当与含细胞的生物样品混合时，适合的浓度范围包括但不限于0.01μM至100μM、0.05μM至100μM、0.1μM至50μM、0.5μM至50μM、1μM至40μM、更优选地1μM至30μM或2.5μM至25μM。已发现浓度越高越有效，但是在较低浓度也也获得良好的稳定化结果。因此，在较低浓度下，例如在选自0.1μM至10μM、0.5μM至7.5μM或1μM至5μM的范围内，也获得有效的稳定化，尤其是如果将细胞凋亡抑制剂组合使用的话。上述浓度适用于使用单一细胞凋亡抑制剂以及使用半胱天冬酶抑制剂的组合。如果使用半胱天冬酶抑制剂的组合，在所述细胞凋亡抑制剂混合物中使用的各个细胞凋亡抑制剂的浓度也可以低于上述浓度，如果细胞凋亡抑制剂的组合的总浓度满足上述特点的话。使用仍然有效地稳定化细胞和/或减少样品中存在的核酸的降解的较低浓度，具有可以降低稳定化成本的优点。由于细胞凋亡抑制剂与本文中描述的一种或多种稳定剂组合使用，可以使用较低的浓度。当使用半胱天冬酶抑制剂、尤其是修饰的半胱天冬酶特异性肽例如Q-VD-OPh和/或Z-VAD(OMe)-FMK作为细胞凋亡抑制剂时，上述浓度是特别适合的。上述浓度非常适合于例如使全血、尤其是10ml血液稳定。用于其他细胞凋亡抑制剂和/或其他含细胞生物样品的适合的浓度范围，可以由专业技术人员使用常规实验来确定，例如通过在实施例中描述的试验测定法中试验细胞凋亡抑制剂和相应的不同浓度。
根据一种实施方式，有效量的细胞凋亡抑制剂将含细胞生物样品中的细胞凋亡与不含相应细胞凋亡抑制剂的对照样品相比，减少或降低至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、优选地至少75％、更优选地至少85％。
因此，根据一种实施方式，使用稳定剂的组合，其包含至少一种细胞凋亡抑制剂和如上定义的至少一种式1的化合物，所述式1的化合物是N,N-二烷基丙酰胺，优选为N,N-二甲基丙酰胺。相应的组合还可以包含增强稳定化效应的其他添加剂例如抗凝剂和螯合剂。根据一种实施方式，稳定剂的组合包含半胱天冬酶抑制剂和抗凝剂，优选为螯合剂例如EDTA。相应的组合可以有利地使用在第一方面的适用于使含细胞样品中包含的细胞外核酸群体稳定的方法中。使用稳定剂的组合观察到的稳定化效果强于任何单个稳定剂单独使用时观察到的效果，和/或允许使用较低浓度，从而使稳定剂的组合使用成为有吸引力的选择方案。细胞凋亡抑制剂和如上定义的式1的化合物、尤其是N,N-二甲基丙酰胺的适合和优选的实施方式，以及适合于实现样品的有效稳定化的相应试剂的适合和优选的浓度，在上面相结合进行了详细描述。
正如在发明背景中讨论的，细胞外核酸通常不“裸露地”存在于样品中，而是例如通过被释放保护在复合物中或通过被包含在囊泡中等，在一定程度上被稳定化。这具有使细胞外核酸已被天然稳定化至一定程度，并且通常不被含细胞样品例如全血、血浆或血清中的核酸酶快速降解的效果。因此，当打算使生物样品中包含的细胞外核酸稳定时，主要问题之一是细胞外核酸群体被源自于样品中包含的损坏和/或垂死细胞的细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA的稀释和相应地污染。这在处理剥除细胞的样品例如血浆或血清(其有时也被描述为“无细胞”，尽管它们可能包含少量细胞)时产生问题。就此而言，本发明的稳定化技术是特别有利的，因为它不仅基本上保护样品中存在的细胞外核酸并且例如抑制所包含的细胞外核酸的降解(在稳定化时期内与未稳定化的样品或EDTA稳定化的样品相比，优选地抑制至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或更优选地至少95％)，而且进一步有效地减少基因组DNA从样品中包含的细胞的释放和/或减少相应基因组DNA的片段化。根据一种实施方式，按照本发明的教示使用如上定义的式1的化合物和任选的细胞凋亡抑制剂以使含细胞样品稳定，具有与未稳定化的样品相比，减少由DNA从样品中包含的细胞的释放所引起的DNA增加的效果。根据一种实施方式，在稳定化期间，与未稳定化的样品或用EDTA稳定化的相应样品(尤其是在血液样品或源自于血液的样品例如血浆或血清的情况下)相比，所述基因组DNA的释放减少至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少17倍或至少20倍。根据一种实施方式，在稳定化期间，与未稳定化的样品或用EDTA稳定化的相应样品(尤其是在血液样品或源自于血液的样品例如血浆或血清的情况下)相比，所述基因组DNA的释放减少至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。DNA的释放可以通过如在本文实施例部分中所描述的核糖体18S DNA的定量来确定。因此，与在标准的EDTA管中稳定化的样品相比，样品中包含的细胞外核酸群体被相当大地稳定。因此，根据一种实施方式，使用本发明教示的可以与细胞凋亡抑制剂相组合使用的式1的化合物实现的稳定化效应，导致DNA从样品中包含的细胞的释放至少减少至10倍、优选地7倍、更优选地5倍的最大值，并且最优选地至少减少至4倍的最大值，正如可以在例如实施例中描述的18S DNA测定法中所测定的。正如实施例所示，细胞外核酸群体的有效稳定化可以实现至少长达6天的时间段。在样品的较短储存例如最长3天期间，DNA释放可以被至少减少至2倍的最大值，正如可以在例如实施例中描述的18S DNA测定法中所测定的。因此，当使用本发明的稳定化方法时，DNA释放可以在长达3天内减少到2倍或更少。与现有技术的方法相比，这在使细胞外核酸群体稳定方面是显著的改进。这显著提高了任何随后试验的准确性。在某些情况下，例如如果样品材料必须长距离运输或例如在室温下储存较长时间段(正如例如在某些国家中的情况)，本发明的方法能够第一次使这些试验在这样的时间段后进行。但是，如果需要，当然样品也可以更早地进一步处理。不必使用全部可获得的稳定化时间长度。使用本发明实现的稳定化，减少了可能由样品收集后样品的不同操作/处理(例如储存条件和时间长度)引起的细胞外核酸群体的变化。这极大改进了操作和分子分析的标准化。
为了使含细胞样品进一步稳定，除了上面定义的式1的化合物之外，可以使用其他添加剂。它们可以在细胞凋亡抑制剂之外或作为细胞凋亡抑制剂的可替代物使用。可能也有助于稳定化效果的适合的添加剂的选择，可能也取决于待稳定化的含细胞样品的类型。例如，当处理作为含细胞生物样品的全血时，包含抗凝剂是有利的也是常见的，所述抗凝剂选自例如肝素、乙二胺四乙酸、柠檬酸盐、草酸盐及其任何组合。在有利的实施方式中，抗凝剂是螯合剂。螯合剂是能够通过有机化合物的两个或更多原子与金属形成配位键的有机化合物。本发明的螯合剂包括但不限于二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚乙基二氮基四乙酸(EDTA),乙二醇四乙酸(EGTA)和N,N-双(羧甲基)甘氨酸(NTA)。根据优选实施方式，使用EDTA。当在本文中使用时，术语“EDTA”尤其是指EDTA化合物例如K2EDTA、K3EDTA或Na2EDTA的EDTA部分。使用诸如EDTA的螯合剂还具有抑制核酸酶例如DNase，从而例如防止细胞外DNA被DNase降解的有利效果。此外，已发现，以较高浓度使用/添加的EDTA能够减少细胞内核酸、尤其是基因组DNA从细胞的释放，从而支持由至少一种式1的化合物实现的稳定化效果。然而，单独的EDTA不能有效地抑制例如从样品中包含的细胞释放的基因组DNA的片段化。因此，EDTA不获得足够的稳定化效果。但是与本发明的教示组合，尤其是与细胞凋亡抑制剂、特别是半胱天冬酶抑制剂组合使用时，由于上面讨论的原因，它可以进一步提高稳定化。此外，它还似乎提高RNA的化学稳定性。根据一种实施方式，在与一种或多种上述稳定化合物混合的生物样品中的螯合剂、优选为EDTA的浓度，在接触步骤后在选自0.05mM至100mM、0.05mM至50mM、0.1mM至30mM、1mM至20mM和2mM至15mM的范围内。当稳定化血液、血浆和/或血清样品、尤其是10ml血液样品时，相应的浓度是特别有效的。
为了进一步支持含细胞样品的稳定化并相应地支持细胞外核酸群体的保存，也可以使用其他添加剂。相应添加剂的实例包括但不限于核酸酶抑制剂，尤其是RNase和DNase抑制性化合物。RNase抑制剂的实例包括但不限于抗核酸酶抗体或核糖核苷-氧钒-复合物。当选择相应的其他添加剂时，应该小心不损害和/或抵消作为式1的化合物的N,N-二烷基丙酰胺的稳定化效果。因此，使用的添加剂的浓度不应该引起或支持生物样品中包含的细胞的裂解和/或降解，和/或支持生物样品的无细胞级份中包含的核酸的降解。此外，使用的添加剂的浓度也不应该抵消和推翻用于稳定化的N,N-二烷基丙酰胺的转录组稳定化效果。
在本发明的有利实施方式中，将优选地是血液样品或源自于血液的样品例如血浆或血清的含细胞生物样品，与下列物质相接触：
a)至少一种上面定义的式1的化合物，其是N,N-二烷基丙酰胺，优选为N,N-二甲基丙酰胺(优选的浓度在上面描述)和
b)作为细胞凋亡抑制剂的至少一种半胱天冬酶抑制剂，优选Q-VD-OPh，优选地在1μM至30μM的浓度范围内；以及
c)其他添加剂，优选为螯合剂，优选地在4mM至50mM、优选地4mM至20mM的浓度范围内，最优选为EDTA。
可以将稳定化组合物的组分包含并相应地溶解在缓冲液，例如生物缓冲液如MOPS、TRIS、PBS等中。此外，可以将它们溶解在水或任何其他适合的溶剂中。根据一种实施方式，稳定化组合物包含非质子溶剂例如DMSO。
如上定义的式1的化合物、即N,N-二烷基丙酰胺，其优选为N,N-二甲基丙酰胺，以及任选地存在的其他添加剂，可以例如存在于用于收集样品的装置、优选为容器中，或者可以在即将收集生物样品之前添加到相应的收集装置，或者可以在将样品收集在收集装置中之后立即添加到收集装置中。将稳定剂和任选的其他添加剂分开地向含细胞生物样品添加，也在本发明的范围之内。然而，为了易于操纵，优选地将一种或多种稳定剂和任选地其他添加剂提供在一种组合物中。此外，在有利的实施方式中，如上定义的式1的化合物和任选地其他添加剂在加入样品之前存在于收集装置中。这确保含细胞生物样品在与稳定剂接触后立即被稳定化。稳定化试剂以有效地为待收集并相应地包含在容器中的量的含细胞样品提供稳定化作用的量存在于所述容器中。正如所述，可以在样品收集后和/或期间将样品直接与稳定化试剂混合，由此提供稳定化的样品。
优选地，在样品收集之后和/或期间将样品与稳定剂直接混合。因此，优选地，上述稳定剂和添加剂被提供成稳定化组合物的形式。优选地，所述稳定化组合物以液体形式提供。它可以被例如预装填在样品收集装置中，以便在收集期间将样品立即稳定化。根据一种实施方式，将稳定化组合物与含细胞的样品以选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5的体积比相接触。本发明的教示的特别优点在于可以使用小体积的稳定化组合物实现大样品体积的稳定化。因此，优选地，稳定化组合物与样品之比在1:2至1:7、更优选地1:3至1:5的范围内。
当在本文中使用时，术语“含细胞样品”尤其是指包含至少一个细胞的样品。含细胞样品可以包含至少2、至少10、至少50、至少100、至少250、至少500、至少1000、至少1500、至少2000或至少5000个细胞。此外，包含相当多细胞的含细胞样品也被该术语涵盖，并且可以使用本发明的教示来稳定化。然而，术语“含细胞样品”还指称并因此涵盖剥除细胞的样品，包括通常被称为“无细胞”的剥除细胞的样品例如血浆，因为相应的样品通常包括残留细胞。至少，通常不能完全排除即使是所谓的“无细胞”样品例如血浆包含残留量的细胞的情况，这因此造成细胞外核酸群体被从所述残留细胞释放的细胞内核酸污染的风险。因此，根据一种实施方式，相应的剥除细胞的和“无细胞”样品也被术语“含细胞样品”涵盖。因此，“含细胞样品”可以包含大量细胞，正如例如使用全血的情况，但是也可以仅含有少量细胞。因此，术语“含细胞样品”还涵盖仅被怀疑含有细胞或具有含细胞的风险的样品。正如上面讨论的，对于仅包含少量、相应地残留量的细胞的生物样品例如血浆(取决于制备方法，血浆通常含有少量残留量的细胞，尽管它通常被称为无细胞的)来说，本发明的方法也具有相当大的优点，因为这些残留细胞也可能引起所包含的细胞外核酸的不想要的污染。使用本发明的稳定化技术还确保仅包含残留量细胞或仅仅被怀疑或有风险包含残留量细胞的相应样品被有效地稳定化，正如也在上面详细描述的。根据一种实施方式，细胞部分占含细胞的生物样品的至少1％、至少2％、至少2.5％、至少5％，优选地至少10％、至少15％、至少20％，更优选地至少25％、至少30％、至少35％或至少40％。其中细胞级份占超过40％的含细胞样品也可以使用本文中描述的教示来稳定化。使用本发明的稳定化方法具有下列优点，即不论样品的组成和其中包含的细胞数量如何，其中包含的细胞外核酸群体被基本上保护并相应地稳定化，由此允许对所包含的细胞外核酸的后续分离和/或分析进行标准化。
根据一种实施方式，含细胞的生物样品选自全血、源自于血液的样品、血浆、血清、痰液、泪液、淋巴液、尿液、汗液、溶液、脑脊液、腹水、乳液、粪便、支气管灌洗液、唾液、羊水、鼻分泌物、***分泌物、***、伤口分泌物和细胞培养上清液以及从其他拭子样品获得的上清液。根据一种实施方式，含细胞生物样品是体液、身体分泌物或身体***物，优选为体液，最优选为全血、血浆或血清。含细胞生物样品包含细胞外核酸。根据另一种实施方式，含细胞生物样品是源自于人类或动物的非流体样品例如粪便、组织或活检样品。可以用本发明的方法稳定化的含细胞生物样品的其他实例包括但不限于包含细胞外核酸的生物样品细胞悬液、细胞培养物、细胞培养物上清液等。
正如上面描述的和由实施例所证实的，使用本发明的方法允许使含细胞样品不需冷藏或冷冻即可稳定长时间段。因此，可以将样品保持在室温或甚至高温例如高达30℃或高达40℃下。根据一种实施方式，在室温下获得至少2天、优选地至少3天、更优选地至少1天到至少6天、最优选地至少1天到至少7天的稳定化效果。正如实施例中所示，按照本发明的方法稳定化的样品，当在室温下储存3天时基本上不受损。即使在室温下长达6或甚至7天的更长储存期间，与未稳定化的样品或例如与使用标准方法例如EDTA处理稳定化的样品相比，细胞外核酸群体也明显更加稳定。尽管稳定化效果可能随时间降低，但仍足以保持细胞外核酸群体的组成以允许分析和/或进一步处理。因此，按照本发明的方法稳定化的样品，即使在室温下较长时间储存后，也仍适用于分离和任选地分析其中包含的细胞外核酸。此外，转录组被有效地稳定化。因此，由于尤其是在使用稳定剂的优选组合时样品不受损，因此可以设想甚至更长的储存/运输时间。然而更长的时间通常不是必需的，这是由于正常的储存和例如运输到进行核酸分离和任选地分析的实验室的时间通常不超过6或7天，而通常甚至在2或3天后完成。正如在实施例中所示，在该时间段内，稳定化效率是特别良好的。然而，使用本发明的方法可以获得的格外长的稳定化时间和稳定化效率，提供了重要的安全因素。
本发明的方法以及随后描述的组合物还允许使用小体积的添加物质稳定化大体积的生物样品，因为根据本发明的教示使用的添加剂具有高活性。这是重要的优点，因为样品的大小/体积对后续分离程序造成相当大的限制，尤其是在打算使用自动化过程来分离样品中包含的细胞外核酸时。此外，人们必须考虑到细胞外核酸通常仅仅以少量包含在所包含的样品中。因此，处理较大体积的含细胞样品例如血液样品，具有更多的循环核酸可以从样品中分离并因此可用于随后分析的优点。
生物样品的稳定化之后可以直接进行用于分析核酸的技术，或者可以从样品纯化核酸。因此，按照本发明的方法稳定化的样品可以在核酸分析和/或检测方法中进行分析，和/或可以被进一步处理。例如，可以从稳定化的样品分离细胞外核酸，然后可以将其在核酸分析和/或检测方法中进行分析，或者可以进一步处理。此外，可以从稳定化的样品移除细胞并对其进行分析，和/或可以从获得的细胞分离核酸。此外，可以对细胞进行分析以获得它们的形态或细胞表面特征。这允许例如鉴定肿瘤细胞。根据一种实施方式，对细胞内RNA进行分离和分析。根据一种实施方式，所述方法包括对一个或多个基因转录本进行定性或定量分析。
此外，根据第二方面，提供了用于从生物样品分离核酸的方法，所述方法包括下列步骤：
a)按照本发明的第一方面的方法使含细胞的样品稳定；
b)从被稳定了的样品分离核酸。
根据一种实施方式，所述方法包括：
a)按照第一方面的方法使含细胞的样品稳定；
b)从被稳定了的样品分离细胞内核酸。
根据一种实施方式，提供了用于从含细胞生物样品分离细胞外核酸的所述方法，其中所述方法包括下列步骤：
a)按照本发明的第一方面中定义的方法使含细胞样品中包含的细胞外核酸群体稳定；
b)分离细胞外核酸。
正如上面讨论的，本发明的稳定化具有使样品中包含的细胞外核酸群体基本上保持在其在获得或相应地抽取生物样品时所显示的状态的效果。具体来说，通常观察到的由从损坏或垂死细胞释放的细胞内核酸、尤其是基因组DNA、更具体为片段化基因组DNA造成的核酸大量增加，被有效地减少，正如在实施例中证实的。因此，与未稳定化的样品相比，从相应地稳定化的样品获得的细胞外核酸，包含源自于样品中包含的降解或垂死细胞的细胞内核酸的更少污染，尤其是包含更少量的片段化基因组DNA。此外，独特的稳定化步骤允许提高可回收的细胞外核酸的量。本发明的稳定化方法不用交联样品即可进行。与使用交联剂例如甲醛或甲醛释放剂相比这是重要的优点，因为这些试剂由于交联可能降低细胞外核酸的可回收量。因此，本发明的方法提高了细胞外核酸的诊断和预后能力。此外，所述稳定化允许在分离样品中包含的细胞之前和/或在步骤b)中分离其中包含的细胞外核酸之前，将样品甚至在室温下储存和/或操作例如运输长时间段。对于稳定化的详细情况，参考也适用于这里的上述公开内容。
根据一种实施方式，如上面详细描述的，使用如上所述的至少一种式1的化合物即N,N-二烷基丙酰胺和任选地其他添加剂，在步骤a)中将含细胞的生物样品例如全血样品稳定化。适合和优选的实施方式在上面描述。特别优选的是另外使用半胱天冬酶抑制剂与如上描述的抗凝结剂、优选为螯合剂的组合，用于稳定化全血样品。
如果正如在例如使用全血的情况下，样品包含大量细胞的话，则将细胞与其余样品分离开，以便获得样品的包含细胞外核酸的无细胞、相应地细胞减少或细胞剥除的级份。因此，根据一种实施方式，在步骤a)与步骤b)之间从含细胞样品中除去细胞。这一中间步骤仅仅是任选的，并且例如如果被处理的样品仅包含少量残留细胞，例如血浆或血清的话，所述步骤可以废弃。然而，为了改进结果，优选地也除去相应的残留细胞(或潜在的残留细胞)，因为它们在分离期间可能污染细胞外核酸群体。取决于样品类型，可以例如通过离心、优选为高速离心，或者如果希望避免离心步骤，通过使用离心之外的手段例如过滤、沉降或结合于(任选地磁性)粒子的表面，来分离并除去细胞、包括残留细胞。相应的细胞移除步骤也可以容易地包含在自动样品制备流程中。相应地被移除的细胞也可以被进一步处理。可以例如将细胞储存和/或可以从被去除的细胞分离生物分子例如核酸或蛋白质。
此外，在本发明的范围内还包括准备样品的其他中间步骤。
然后在步骤b)中，例如从无细胞或相应的细胞剥除级份，例如从上清液、血浆和/或血清分离细胞外核酸。为了分离细胞外核酸，可以使用适合于从相应的样品、相应地细胞剥除的样品分离核酸的任何已知的核酸分离方法。相应的纯化方法的实例包括但不限于提取、固相提取、基于二氧化硅的纯化、基于磁性粒子的纯化、酚-氯仿提取、层析、阴离子交换层析(使用阴离子交换表面)、电泳、过滤、沉淀、染色质免疫沉淀及其组合。通过例如使用能够序列特异性结合并偶联于固相支持物的适合的探针特异性地分离特异性目标细胞外核酸，也在本发明的范围之内。还可以使用专业技术人员已知的任何其他核酸分离技术。根据一种实施方式，使用离液剂和/或醇类来分离核酸。优选地，通过将核酸结合于固相、优选为包含二氧化硅或阴离子交换官能团的固相，来分离核酸。适合的方法和试剂盒也是可商购的，例如循环核酸试剂盒(QIAGEN)、Chemagic循环NA试剂盒(Chemagen)、NucleoSpin血浆XS试剂盒(Macherey-Nagel)、血浆/血清循环DNA纯化试剂盒(NorgenBiotek)、血浆/血清循环RNA纯化试剂盒(Norgen Biotek)、高纯病毒核酸大体积试剂盒(Roche)和适用于提取和纯化循环核酸的其他可商购试剂盒。
根据一种实施方式，将在步骤a)后获得的或任选地在中间步骤中移除细胞后获得的样品中包含的所有核酸分离，例如从无细胞或相应地剥除细胞的级份中分离。例如，可以从血浆或血清分离总核酸，并且细胞外核酸作为一部分包含在这些提取的核酸中。如果细胞被有效地移除，分离的总核酸将主要包含细胞外核酸或甚至由细胞外核酸构成。至少主要地分离特异性靶核酸，也在本发明的范围之内。靶核酸可以是例如某种类型的核酸例如RNA或DNA，包括mRNA、microRNA、其他非编码核酸、表观遗传上修饰的核酸和其他核酸。在分离后使用例如核酸酶消化非靶核酸，也在本发明的范围之内。术语靶核酸还指特定种类的核酸，例如已知是某些疾病标志物的特定细胞外核酸。
正如上面讨论的，细胞外核酸的分离也可以包含相应靶核酸的特异性分离，例如通过使用适合的捕获探针。术语靶核酸还指具有一定长度的核酸，例如长度为2000nt或更短、1000nt或更短或500nt或更短的核酸。分离相应的较小靶核酸可能是有利的，因为已知细胞外核酸通常具有小于2000nt、通常小于1000nt、甚至通常小于500nt的较小尺寸。本文中指明的尺寸和相应地尺寸范围是指链长。即在DNA的情况下，它是指bp。将分离和相应地纯化聚焦于相应的小核酸，能够提高在分离的核酸中获得的细胞外核酸的比例。尤其是由于细胞内基因组DNA的片段化的抑制，本发明的稳定化方法允许在例如核酸提取程序期间将这样的高分子量基因组DNA与片段化的细胞外核酸群体更有效地分离开。由于使用本发明的稳定化技术，基因组与循环核酸之间的显著尺寸差异基本上得以保持，因此与没有相应稳定化的情况相比，可以通过DNA的尺寸选择性回收更有效地除去基因组DNA。通过例如剥除高分子量基因组DNA来实现细胞外核酸群体的相应选择性分离的适合方法在现有技术中是公知的，因此在这里不需进一步描述。例如，使用剥除样品中大于1,000-10,000核苷酸或碱基对的任何核酸的尺寸选择性方法，将是足够的。由于本发明的稳定化的样品中基因组(通常>10,000bp)与细胞外核酸(通常<1000bp)之间的尺寸差异由于有效的稳定化而通常相对大(差异可以例如在1000-10,000bp的范围内)，因此可以使用用于从生物样品选择性分离细胞外核酸的已知方法。这也为减少分离的细胞外核酸群体中细胞内核酸的量提供了进一步的机会。例如，在核酸提取流程期间除去基因组DNA，也可以补充或甚至代替核酸提取开始之前血浆样品的分离性高离心力离心，以便移除残留细胞。由于本发明的稳定化，防止了从所述残留细胞释放的基因组DNA变得大量降解，并因此可以通过尺寸选择性分离流程来除去所述基因组DNA。这种选择方案是特别有利的，因为许多临床实验室不具有能够执行这样的高离心力离心的离心机或用于移除尤其是痕量残留细胞的其他手段。
此外，可以在例如从剩余的样品分离所包含的细胞后，从所述细胞分离细胞内核酸。例如，可以分离RNA并将其用于基因表达分析。
然后在步骤c)中使用适合的测定法和/或分析方法对分离的核酸进行分析和/或进一步处理。例如，可以将它们鉴定、修饰、与至少一种酶相接触、扩增、反转录、克隆、测序、与探针相接触、检测(它们的存在或不存在)和/或定量。相应的方法在现有技术中是公知的，并通常应用于医学、诊断和/或预后领域，以便分析细胞外核酸(也参见在本发明的背景中的详细描述)。因此，在将细胞外核酸任选地作为总核酸、总RNA和/或总DNA的部分分离(参见上文)后，可以对它们进行分析以鉴定疾病状态的存在、不存在或严重性，所述疾病状态包括但不限于多种肿瘤性疾病、尤其是恶性前和恶性疾病，例如不同形式的癌症。例如，可以对分离的细胞外核酸进行分析以便检测许多应用领域中的诊断和/或预后标志物(例如胎儿或肿瘤来源的细胞外核酸)，所述领域包括但不限于非侵入性产前遗传测试和相应地筛查、疾病筛查、病原体筛查、肿瘤学、癌症筛查、早期癌症筛查、癌症疗法监测、遗传试验(基因分型)、传染病试验、损伤诊断、创伤诊断、移植医学或许多其他疾病，因此是诊断和/或预后相关的。根据一种实施方式，对分离的细胞外核酸进行分析，以鉴定和/或表征疾病或胎儿的特征。因此，正如上面讨论的，本文描述的分离方法还可以包含核酸分析和/或处理的步骤c)。因此，根据一种实施方式，在步骤c)中对分离的细胞外核酸进行分析，以鉴定、检测、筛选、监测或排除疾病和/或至少一种胎儿特征。
核酸的分析/进一步处理可以使用任何核酸分析/处理方法来进行，包括但不限于扩增技术、聚合酶链反应(PCR)、等温扩增、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、定量实时聚合酶链反应(Q-PCR)、数字PCR、凝胶电泳、毛细管电泳、质谱术、荧光检测、紫外光谱术、杂交测定法、DNA或RNA测序、限制性分析、反转录、NASBA、等位基因特异性聚合酶链反应、聚合酶循环组装(PCA)、不对称聚合酶链反应、指数后线性聚合酶链反应(LATE-PCR)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、热启动聚合酶链反应、序列间特异性聚合酶链反应(ISSR)、反向聚合酶链反应、连接介导的聚合酶链反应、甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)、多重聚合酶链反应、巢式聚合酶链反应、固相聚合酶链反应或其任何组合。相应的技术对于专业技术人员来说是公知的，因此在这里不需进一步描述。
根据一种实施方式，分离或分析步骤b)和c)中的任一或两者，在样品被收集并按照本发明的教示相应地稳定化后至少一天直至7天进行。样品、尤其是血液样品以及相应地其中包含的细胞外核酸群体可以使用本发明的方法稳定化的适合时间长度，也在上面描述并且也适用于此处。根据一种实施方式，分离步骤在样品收集并按照本发明的方法稳定化后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天或至少6天进行。根据一种实施方式，分离或分析步骤中的任一或两者的发生，不冷冻样品和/或不使用甲醛来保护含细胞生物样品。生物样品在与如上定义的式1的化合物、优选地与其他添加剂例如抗凝结剂如EDTA组合相接触后，被稳定化。当稳定化血液或源自于血液的样品时，优选地使用抗凝结剂。相应地稳定化的样品可以在室温下操作，例如储存和/或运输。如上所述，根据一种实施方式，另外地将细胞凋亡抑制剂、优选为半胱天冬酶抑制剂用于稳定化。
此外，根据本发明的第三方面，提供了适用于使生物样品中的细胞外核酸群体稳定的组合物，所述组合物包含：
a)至少一种如上定义的式1的化合物；和
b)至少一种抗凝剂，优选为螯合剂。
正如上面讨论的，通过稳定化所包含的细胞、转录本水平和所包含的细胞外核酸，由此显著保护并相应地稳定化细胞外核酸群体，相应的稳定化组合物在稳定化含细胞生物样品、尤其是全血、血浆和/或血清方面特别有效。相应的稳定化组合物允许优选地为全血的样品在室温下储存和/或操作例如运输至少2天、优选地至少3天，而不显著损害样品和相应地其中包含的细胞外核酸群体的质量。此外，所包含的细胞的基因表达情况以及因此转录组得到保护。当然，不强制使用整个可能的稳定化时间段；如果需要，样品也可以更早地处理。将生物样品与稳定化组合物相接触，允许在分离和任选地分析和/或处理所包含的核酸之前，将样品甚至在室温下储存和/或操作例如运输。因此，样品的收集或稳定化与核酸提取之间的时间可以变化，而基本上不影响其中包含的细胞外核酸群体的总数和相应地组成。具体来说，减少了被细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA的稀释和相应地污染。此外，由于所包含的细胞的基因转录情况被稳定化，因此细胞内RNA可以被分离并例如用于分析基因表达的方法中，并可用于基因表达情况分析。优选地，在样品收集后立即或在样品收集期间将稳定化组合物与样品相接触。稳定化组合物也可以包含本文中描述的其他稳定剂例如细胞凋亡抑制剂，其优选为半胱天冬酶抑制剂。
式1的化合物和细胞凋亡抑制剂的适合和优选的实施方式以及相应化合物的适合和优选的浓度，在上面结合稳定化方法进行了详细描述。应该指出，上述公开内容也适用于稳定化组合物。根据一种实施方式，式1的化合物是N,N-二甲基丙酰胺。所述化合物也可以与细胞凋亡抑制剂、优选为半胱天冬酶抑制剂(优选实施方式在上面描述，参考上述公开内容)组合使用。
此外，优选地稳定化组合物包含其他添加剂例如抗凝结剂如螯合剂，尤其是如果组合物被用于稳定化全血、血浆或血清的话。
根据一种实施方式，稳定化组合物基本上由提到的稳定剂和任选的添加剂以及任选地缓冲剂构成。稳定化组合物使样品稳定，因此不促进样品中包含的细胞的裂解和/或破坏。稳定化组合物可以减少样品中包含的细胞的损伤，正如可以例如通过实施例部分中描述的测定方法所确定的。
组合物可以以固体形式提供。如果待稳定化的生物样品含有液体以溶解固体(例如含细胞体液、介质中的细胞、尿液)或者如果向其加入液体例如水以溶解固体的话，这是例如适合的选择方案。使用固体稳定化组合物的优点在于固体通常在化学上更稳定。然而，也可以使用液体组合物。液体组合物通常具有可以快速获得与待稳定样品的混合物，从而基本上在样品一旦与液体稳定化组合物发生接触后就提供即时稳定化效果的优点。优选地，液体稳定化组合物中存在的稳定剂在溶液中保持稳定，并且不需要由用户进行预处理，例如将溶解度有限的沉淀物溶解，因为这种类型的预处理引起稳定化效率变化的风险。
还提供了包含与生物样品混合的本发明的稳定化组合物的混合物。生物样品的适合和优选的实例以及稳定剂在与生物样品混合时的适合的浓度，在上面结合稳定化方法进行了描述。参考也适用于此处的上述公开内容。优选地，将稳定化组合物预装填在样品收集装置中，使得样品在收集期间立即被稳定化。根据一种实施方式，将稳定化组合物与生物样品以选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5的体积比相接触。本发明的稳定化组合物的特别优点是可以使用小体积的稳定化组合物获得大样品体积的稳定化。因此，优选地，稳定化组合物与样品之比在1:2至1:7、更优选地1:3至1:5的范围内。
本发明的第三方面的稳定化组合物可用于使含细胞样品中包含的细胞外核酸群体稳定。此外，本发明的第三方面的稳定化组合物也可用于使样品中包含的细胞稳定。正如上面描述的，稳定化组合物尤其减少由衰退的细胞引起的基因组DNA从细胞的释放。因此，相应的使用也是有利的，并由本发明的教示提供。此外，本发明的第三方面的稳定化组合物也可用于使所包含的细胞中的转录本水平稳定。
还提供了制造本发明的第三方面的组合物的方法，其中将组合物的组分优选地在水性溶液中混合。
本发明的组合物也可以掺入到样品收集装置、尤其是血液收集套件中，由此提供这样的装置的新的和有用的版本。这样的装置通常包括具有开放和封闭末端的容器。容器优选地是血液收集管。容器类型也取决于待收集的样品，其他适合的格式在下面描述。
此外，本发明提供了用于收集含细胞生物样品、优选为血液样品的容器，其中容器包含本发明的稳定化组合物。提供包含本发明的稳定化组合物的相应容器例如样品收集管，具有在样品被收集在相应容器中时样品被快速稳定化的优点。关于稳定化组合物的详细情况在上面描述，并参考也适用于此处的上述公开内容。
根据一种实施方式，提供了用于接收和收集生物样品的收集容器，其中所述容器包含：
a)至少一种如上定义的式1的化合物，使得在收集样品时，式1的化合物以至少0.1％、至少0.5％、至少0.75％、至少1％、至少1.25％或至少1.5％的浓度包含，或者其中所述化合物以选自0.1％直至50％、0.1至30％、1％至20％、1％至10％、1％至7.5％和1％至5％的浓度范围被包含；和/或
b)任选地至少一种其他添加剂，优选为抗凝结剂例如螯合剂，优选为EDTA，如果容器被用于收集血液或血液制品的话。适合的浓度在上面描述，并优选地在4mM至50mM、更优选地4mM至20mM的范围内。
适合的浓度也在上文中与方法相结合进行了描述，参考上述公开内容。根据一种实施方式，容器另外地包含至少一种细胞凋亡抑制剂，使得在收集样品时，得到的混合物中细胞凋亡抑制剂或两种或更多种细胞凋亡抑制剂的组合的浓度选自至少0.01μM、至少0.05μM、至少0.1μM、至少0.5μM、至少1μM、至少2.5μM或至少3.5μM，并优选地以选自0.01μM至100μM、0.05μM至100μM、0.1μM至50μM、1μM至40μM、1.0μM至30μM或2.5μM至25μM的浓度范围存在。
预装填组分可以以液体或干燥形式提供。优选地，稳定化组分作为稳定化组合物提供。如果待稳定的生物样品含有液体以溶解固体(例如含细胞体液、介质中的细胞、尿液)或者如果向其加入液体例如水以溶解固体的话，例如干燥形式是适合的选择方案。使用固体稳定化组合物的优点在于固体与液体相比通常在化学上更稳定。根据一种实施方式，容器的内壁用本发明的稳定化组合物处理/覆盖。所述组合物可以使用例如喷雾干燥方法施加到内壁。可以在稳定化组合物上进行液体移除技术，以便获得基本上固体状态的保护性组合物。液体移除条件可以使它们导致移除分配的液体稳定化组合物的原始量的至少约50重量％、至少约75重量％或至少约85重量％。液体移除条件可以使它们导致足够液体的移除，以便得到的组合物采取薄膜、凝胶或其他基本上固体或高度粘稠层的形式。例如，它可以产生基本上不动的涂层(优选地在与优选地作为血液制品样品的含细胞样品接触后，可以重新溶解或以其他方式分散的涂层)。冷冻干燥或其他技术可能可以用于获得保护剂的基本上固体的形式(例如采取一个或多个球粒的形式)。因此，液体移除条件可以使它们产生在与所考虑的样品(例如全血样品)接触后，保护剂将分散在样品中并显著保护样品中的组分(例如细胞外核酸)的材料。液体移除条件可以是这样的，即所述条件产生的剩余组合物基本上没有结晶性、具有高得足以使所述剩余组合物在环境温度下基本上固定的粘度，或两者。
然而，也可以使用液体组合物。液体组合物通常具有可以快速获得含待稳定化的样品的混合物、从而在样品一旦与液体稳定化组合物发生接触后就基本上提供即时稳定化效果的优点。优选地，液体稳定化组合物中存在的稳定剂在溶液中保持稳定，并且不需要由用户进行预处理，例如将溶解度有限的沉淀物溶解，因为这种类型的预处理引起稳定化效率变化的风险。
稳定化组合物以有效地为待收集在容器中的量的样品提供稳定化作用的量包含在所述容器中。根据一种实施方式，将液体稳定化组合物与生物样品以选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5的体积比相接触。本发明的稳定化组合物的特别优点在于，可以使用小体积的稳定化组合物获得大样品体积的稳定化。因此，优选地，稳定化组合物与样品之比在1:2至1:7、更优选地1:3至1:5的范围内。
根据一种实施方式，将容器排空。排空优选地对将特定体积的流体样品抽入内部有效。由此，确保了正确量的样品与容器中包含的预装量的稳定化组合物相接触，并因此确保了稳定化作用有效。根据一种实施方式，容器包含具有开口端并用隔膜密封的管。例如，容器预装填有确定量的采取固体或液体形式的稳定化组合物，并提供有确定的真空并用隔膜密封。隔膜被构造成使其与标准的取样附件(例如插管等)相容。当与例如插管接触时，由真空预先确定的样品量被收集在容器中。相应的实施方式对于收集血液来说是特别有利的。适合的容器公开在例如US 6,776,959中。
本发明的容器可以由玻璃、塑料或其他适合的材料制成。塑料材料可以是不透氧气的材料，或者可以含有不透氧气的层。或者，容器可以由可透过水和空气的塑料材料制成。本发明的容器优选地由透明材料制成。适合的透明热塑性材料的实例包括聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯和聚对苯二甲酸乙二酯。容器可以具有根据待收集的生物样品的所需体积选择的适合维度。如上所述，优选地，将容器排空至内部压力低于大气压。这样的实施方式对于收集体液例如全血来说特别适合。压力优选地被选择成将预定体积的生物样品抽取到容器中。除了这样的真空管之外，非真空管、机械分离管或凝胶屏蔽管也可以用作样品容器，尤其是用于血液样品的收集。适合的容器和顶盖装置公开在US 5,860,397和US 2004/0043505中。作为用于收集含细胞样品的容器，也可以使用其他收集装置，例如注射器、尿液收集装置或其他收集装置。容器的类型也可以取决于待收集的样品类型，并且适合的容器对于专业技术人员来说也是可获得的。
当容器或相应地装置装填或预装填有如上定义的至少一种式1的化合物作为稳定剂时，获得了有益的结果。优选地，除了式1的化合物之外还包含抗凝结剂。抗凝结剂优选地是螯合剂例如EDTA。此外，容器中包含的稳定化组合物还可以包含细胞凋亡抑制剂、优选为半胱天冬酶抑制剂，以及任选地其他添加剂。根据一种实施方式，容器中包含的稳定化组合物包含半胱天冬酶抑制剂和抗凝结剂。
根据一种实施方式，容器具有开放的顶部、底面和在其间延伸的侧壁，它们构成腔室，其中本发明的稳定化组合物被包含在所述腔室中。它可以以液体或固体形式包含在其中。根据一种实施方式，容器是管，底面是封闭底面，容器还在开放顶部包含封闭物，并且腔室处于低压下。腔室中低压的优点如上所述。优选地，封闭物能够用针或插管刺穿，并且低压被选择成将给定体积的液体样品抽取到腔室中。根据一种实施方式，腔室处于被选择成将给定体积的液体样品抽取到腔室中的低压下，稳定化组合物是液体并配置在腔室中，使得稳定化组合物与所述给定体积的含细胞样品的体积比选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5。相关的优点在上面描述。
优选地，容器用于从患者抽取血液。
根据第五方面，提供了一种方法，其包括将样品从患者直接收集到本发明的第四方面的容器的腔室中的步骤。关于容器和样品的详细情况在上面描述。参考相应的公开内容。根据一种实施方式，收集血液样品，优选地从患者抽取它。
本文中公开的方法和组合物允许有效地保护和分离细胞外核酸，同时减少与源自于生物样品中包含的细胞并可能由于细胞损伤以及相应地细胞裂解而进入生物样品的核酸、尤其是片段化基因组DNA的可能的混合。本发明的方法以及组合物和公开的装置(例如收集容器)减少细胞外核酸的降解并且也减少细胞裂解和/或基因组核酸、尤其是片段化基因组DNA的释放，使得样品中包含的细胞外核酸不被细胞内核酸污染，相应地，通过本发明的教示减少了相应的污染。正如上面讨论的，细胞外核酸与细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA的相互混合，可能降低生物样品中细胞外核酸量的任何测量的准确性。正如上面讨论的，本发明的重要优点是基本上同时稳定化样品中包含的细胞(在全血、血浆或血清的情况下尤其是白细胞或多种类型的白细胞)和细胞外核酸两者的可能性。这帮助防止细胞内核酸例如基因组DNA被释放到样品的无细胞部分中，进而稀释包含的目标细胞外核酸(和相关的生物标志物)，同时还维持细胞外核酸的结构完整性。正如本文中讨论的，将含细胞生物样品例如全血或血浆与稳定剂相接触，允许在分离细胞外核酸之前将样品储存一段时间。更优选地，可以在一个地点(例如卫生护理机构)抽取含细胞生物样品例如血液或血浆，与稳定剂相接触，并在晚些时候运输到不同的远处地点(例如实验室)，用于核酸分离和测试过程。
此外，本文中描述的稳定化技术允许使细胞内核酸和尤其是转录本水平稳定，正如在上面详细描述的。此外，可以从样品分离细胞，从而允许分析血液样品中的特定细胞群体，例如肿瘤细胞如循环肿瘤细胞。优点和技术效果在上文中详细描述，参考上述公开内容。
此外，在本文中公开的稳定化试剂与涉及使用交联试剂例如甲醛、甲醛释放剂等的已知现有技术稳定化试剂相比，提供了优势，因为本发明的样品稳定化不涉及使用这样的交联试剂。交联试剂在核酸分子之间或核酸与蛋白质之间产生分子间或分子内共价键。这种效应可以导致在从复杂生物样品纯化或提取后，这种稳定化和部分交联的核酸的回收率降低。由于例如全血样品中循环核酸的浓度已经相当低，进一步降低这种核酸的收率的任何措施都应该避免。当检测和分析源自于恶性肿瘤或妊娠前三个月的发育胎儿的非常稀少的核酸分子时，这可能是特别重要的。因此，根据一种实施方式，在稳定化组合物中不包含甲醛释放剂，相应地甲醛释放剂也不被另外地用于稳定化。
因此，根据一种实施方式，在稳定化组合物中不包含交联剂例如甲醛或甲醛释放剂，它相应地也不附加地用于稳定化。因此，在这里，稳定化组合物不包含诱导核酸-核酸、核酸-蛋白质尤其是蛋白质/DNA和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂。具体来说，稳定化组合物不包含甲醛、***、多聚甲醛或甲醛释放剂。此外，正如所述，稳定化组合物优选地不包含诱导细胞裂解的任何添加剂，例如离液序列高的盐。
在下文中再次描述特别优选的实施方式。
第一方面，本发明具体涉及一种通过将含细胞的生物样品与至少一种式1的化合物相接触来稳定所述样品的方法，
其中R1是氢基团或烷基基团，R2和R3是以直链或支链方式排列并具有1-20个原子的碳链长度的相同或不同的烃基团，R4是氧、硫或硒基团，并且其中所述式1的化合物是N,N-二烷基丙酰胺。
根据一种实施方式，所述式1的化合物是N,N-二甲基丙酰胺。根据一种实施方式，所述至少一种式1的化合物被包含在任选地包含其他添加剂的稳定化组合物中，并且其中将所述稳定化组合物与所述样品相接触。根据一种实施方式，所述含细胞的样品选自体液、血液、血沉棕黄层、白细胞、血浆、血清和尿液，并且其中所述样品优选为血液样品。根据一种实施方式，所述含细胞的样品是血液样品，并另外地与抗凝剂相接触。根据一种实施方式，所述样品中存在的核酸的降解由于所述稳定化而减少。
根据一种实施方式，细胞内RNA被稳定。根据一种实施方式，所包含的细胞中的转录组、尤其是mRNA表达情况和/或转录本水平被稳定。具体来说，在稳定化后，选自c-fos、IL-1β、IL-8和p53的一种或多种标志物基因的转录本水平被稳定至少48小时。
根据一种实施方式，所述方法适合于使包含在所述含细胞的样品中的细胞外核酸群体稳定。优选地，基因组DNA从所述样品中包含的细胞向所述样品的无细胞部分的释放得以减少。
根据一种实施方式，所述含细胞的生物样品中包含的细胞被稳定化。优选地，所述稳定化允许从被稳定了的样品分离细胞。优选地，所述含细胞的样品是血液样品，并且其中白细胞被稳定化。具体来说，所述方法具有一个或多个下列特征：
a)细胞的形态受到保护；
b)有核细胞的形态受到保护；
c)所述样品是血液样品，并且所包含的淋巴细胞和/或单核细胞被稳定化；
d)细胞表面表位受到保护；和/或
e)细胞表面蛋白质受到保护。
根据一种实施方式，所述方法被用于使血液样品稳定，并包括将所述血液样品与N,N-二烷基丙酰胺和抗凝剂相接触，其中所包含的细胞中的转录本水平被稳定化。
根据一种实施方式，所述方法具有一个或多个下列特征：
a)所述稳定化不促进所述含细胞的样品中包含的有核细胞的裂解；
b)所述稳定化方法在不对所述样品进行交联的情况下进行；和/或
c)所述稳定化不涉及诱导核酸-核酸、蛋白质-核酸和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂的使用。
根据一种实施方式，将所述含细胞的样品另外地与细胞凋亡抑制剂相接触。所述细胞凋亡抑制剂优选为半胱天冬酶抑制剂，更优选为泛半胱天冬酶抑制剂。
根据一种实施方式，从被稳定了的样品分离核酸。具体来说，所述方法具有一个或多个下列特征：
a)N,N-二烷基丙酰胺和任选的其他添加剂被包含在稳定化组合物中，并且其中所述稳定化组合物与给定体积的含细胞的样品的体积比选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5；
b)使被稳定了的含细胞的样品经受核酸分析和/或检测方法；
c)从被稳定了的样品分离细胞内和/或细胞外核酸，并对分离的核酸进行分析和/或检测；
d)去除被稳定了的样品中包含的细胞；和/或
e)储存(i)被稳定了的含细胞的生物样品，(ii)已去除细胞的被稳定了的样品，和/或(iii)从所述样品中去除的细胞。
根据一种实施方式，从被稳定了的样品除去细胞。具体来说，对所述被去除的细胞进行分析，和/或其中从所述被去除的细胞分离生物分子例如核酸或蛋白质。根据一种实施方式，从被稳定了的样品中包含的细胞分离RNA。
在第二方面中，本发明具体涉及一种用于从生物样品分离核酸的方法，所述方法包括下列步骤：
a)按照本发明的第一方面的方法使含细胞的样品稳定；
b)从被稳定了的样品分离核酸。
根据一种实施方式，步骤b)包括分离细胞内核酸，优选为细胞内RNA。具体来说，所述方法包括从被稳定了的样品去除细胞，并从所述被去除的细胞分离核酸。根据一种实施方式，步骤b)包括分离细胞外核酸。
根据一种实施方式，从所述剩余的样品分离细胞并从所述剩余的样品分离细胞外核酸。
根据一种实施方式，所述样品是血液。
根据一种实施方式，对所述分离的核酸在另一个步骤c)中进行处理和/或分析，并且优选地进行：
i)修饰；
ii)与至少一种酶相接触；
iii)扩增；
iv)反转录；
v)克隆；
vi)测序；
vii)与探针相接触；
viii)检测；
ix)定量；
ix)鉴定；和/或
x)进行基因表达情况分析。
在第三方面，本发明具体涉及一种适用于使含细胞的生物样品稳定的组合物，其包含：
a)至少一种式1的化合物
其中R1是氢基团或烷基基团，R2和R3是以直链或支链方式排列并具有1-20个原子的碳链长度的相同或不同的烃基团，R4是氧、硫或硒基团，并且其中所述式1的化合物是N,N-二烷基丙酰胺；和
b)至少一种抗凝剂。
根据一种实施方式，所述N,N-二烷基丙酰胺是N,N-二甲基丙酰胺。
根据一种实施方式，所述抗凝剂是螯合剂。根据一种实施方式，所述含细胞的样品是血液样品。根据一种实施方式，所述组合物包含细胞凋亡抑制剂。根据一种实施方式，所述组合物能够使含细胞的样品中包含的细胞的基因转录情况稳定，和/或能够使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定。
根据一种实施方式，所述组合物具有一个或多个下列特征：
a)它能够使细胞稳定并减少基因组DNA从所述含细胞的生物样品中包含的细胞向所述样品的无细胞部分的释放；
b)它能够减少源自于被稳定了的样品中包含的细胞的基因组DNA对所述生物样品中包含的细胞外DNA群体的稀释；
c)它能够减少源自于被稳定了的样品中包含的细胞的细胞内核酸对所述生物样品中包含的细胞外核酸群体的稀释；
d)所述稳定化组合物没有以其中添加剂会诱导或促进细胞裂解的浓度来包含所述添加剂；
e)所述稳定化组合物不包含诱导蛋白质-DNA和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂；
f)所述稳定化组合物不包含甲醛、***、多聚甲醛或甲醛释放剂；
g)所述稳定化组合物不包含毒剂，和/或
h)所述稳定化组合物能够在不冷藏的情况下，优选地在室温下使所述含细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定选自至少两天、至少三天、至少两天至三天、至少两天至六天和/或至少两天至七天的时间段。
根据一种实施方式，在所述稳定化组合物与血液样品接触后，选自c-fos、IL-1β、IL-8和p53的一种或多种标志物基因的转录本水平在稳定化后被稳定至少48小时，并且优选地，所述稳定化组合物与含细胞的样品的体积比选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5。
根据一种实施方式，所述样品是血液样品，并且所述样品中包含的白细胞、优选为淋巴细胞或其他细胞的形态和/或其上的细胞表面表位受到保护。优选地，所述稳定化组合物被提供成与生物样品的混合物。
根据一种实施方式，所述稳定化组合物被提供成与生物样品的混合物，并且所述样品具有一个或多个下列特征：
a)它包含细胞外核酸；
b)它是全血。
本发明还涉及在本发明的第一方面的稳定化方法中，使用本发明的第三方面的组合物。
在第四方面中，本发明具体涉及一种适用于收集含细胞的生物样品，优选为血浆或血清样品的容器，所述容器包含稳定化组合物，所述组合物适用于使所述含细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定，其中所述稳定化组合物包含至少一种式1的化合物
其中R1是氢基团或烷基基团，R2和R3是以直链或支链方式排列并具有1-20个原子的碳链长度的相同或不同的烃基团，R4是氧、硫或硒基团，并且其中所述式1的化合物是N,N-二烷基丙酰胺。
根据一种实施方式，所述式1的化合物是N,N-二甲基丙酰胺。根据一种实施方式，所述稳定化组合物还包含抗凝剂，优选为螯合剂。根据一种实施方式，所述稳定化组合物还包含细胞凋亡抑制剂，优选为半胱天冬酶抑制剂，更优选为泛半胱天冬酶抑制剂。根据一种实施方式，所述稳定化组合物不包含诱导核酸/核酸、蛋白质-核酸和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂。
根据一种实施方式，所述稳定化组合物是本发明的第三方面的组合物。
根据一种实施方式，所述容器具有本文中为本发明的其他方面所定义的一个或多个特点。
在第五方面中，本发明涉及一种方法，所述方法包括从患者收集样品到本发明的第四方面的容器的腔室中。
本发明不受本文中公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文中描述的相似或等同的任何方法和材料，可以使用在本发明实施方式的实践或测试中。数值范围包括限定所述范围的数字。本文中提供的标题不是可以参考说明书总体理解的本发明的各个方面或实施方式的限制。
当在本文中使用时，术语“溶液”尤其是指液体组合物，优选地水性组合物。它可以是仅仅一个相的均质混合物，但是溶液包含固体添加剂例如所包含的化学试剂的沉淀物，也在本发明的范围之内。
本文中对于核苷酸所指明的尺寸和相应的尺寸范围nt是指链长，因此是为了描述单链以及双链分子的长度而使用。在双链分子中，所述核苷酸是配对的。
根据一种实施方式，本文描述的主题内容，当在方法的情况下包含某些步骤或在组合物、溶液和/或缓冲液的情况下包含某些成分时，是指主题内容由相应的步骤或成分构成。选择并组合本文描述的优选实施方式是优选的，并且由优选实施方式的相应组合产生的特定主题内容，也属于本发明的公开内容。
表1：细胞凋亡抑制剂的概述
实施例
在下面的实施例中，提供了本发明的材料和方法。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明。
I.N,N二烷基丙酰胺的使细胞和转录本水平稳定的性质
实施例1：使用N,N-二甲基丙酰胺来稳定化血液样品
建立了允许鉴定具有基因转录本稳定化能力的试剂组合物的试验***和研究设置，所述基因转录本稳定化能力由来自于所选基因(c-fos、IL-1β、IL-8、p53)的转录本的恒定水平所指示。在先前研究中，这些转录本被鉴定是在储存期间非常不稳定的转录本，其在血液收集后数分钟内被诱导或下调(转录本的增加和丧失)，并因此被选为用于筛选目的的“最坏情况”标志物。
此外，为了排除RNA制备流程对转录本水平分析的任何可能的影响，将与用于样品稳定化的[+]对照相同的RNA制备技术，也用于样品稳定化的[-]对照和试验样品。
从多个献血者收集血液到平行测定用的EDTA血液管(BD，样品稳定化的[-]对照)和用作样品稳定化的[+]对照的PAXgene血液RNA管(PreAnalytiX)中。PAXgene血液RNA管含有裂解细胞并由此“冻结”基因转录情况的组合物(也参见发明背景)。PAXgene血液RNA管被用于使血液稳定，以用于基因表达分析。一个目标是发现不基于细胞裂解，但在转录本水平稳定化中实现与PAXgene血液RNA管相同或相似性能的稳定化方法。因此，将收集在PAXgene血液管中并因此用其中包含的稳定化组合物处理的样品，在实验设置中用作阳性对照。在血液收集后，立即将一半的EDTA血液样品用细胞和转录本稳定化试验溶液处理，产生血液试验样品。向9ml EDTA血液加入1ml稳定化添加剂。通过将管颠倒8-10次，将血液与稳定剂溶液混合。将所有血液管在室温下温育0、24和72小时。将被定义为无温育(试验时间点0小时)的PAXgene血液RNA管温育2小时，因为这是从PAXgene血液RNA管分离RNA所需的最短细胞裂解和RNA沉淀时间。在温育后，将PAXgene血液RNA管样品在-20℃下冷冻，同时在试验时间点0小时或稳定化时间段后，将每种EDTA血液和与稳定剂混合的EDTA血液样品的2.5ml等分试样转移到PAXgene血液RNA管，通过所描述的管颠倒进行混合，并在PAXgene血液RNA管中温育6小时进行裂解，然后在-20℃下储存。
在将管在室温下融化和平衡后，使用PAXgene 96血液RNA试剂盒(QIAGEN)，按照手册中描述的流程，从最终在PAXgene血液RNA管中的所有血液样品进行RNA制备。
RNA的数量(RNA得率)和质量(RNA纯度、RNA完整性)通过UV光谱术和使用RIN计算的小型毛细管凝胶电泳(Agilent Bioanalyzer上的纳米芯片)来测量。
使用FOS、IL1B、IL8和TP53的单重测定法，通过实时RT-PCR分析所有RNA样品的转录本水平，并归一化至输入到反应中的模板量。将得到的反映出转录本量的CT值进行直接比较。来自于血液样品的室温温育的不受影响的相对转录本水平由恒定的CT值指示，而转录本增加(例如通过基因诱导)由更低的CT指示，转录本丧失(例如通过基因阻遏)由更高的CT值指示。
细胞和细胞表面表位的完整性，通过荧光激活细胞分选(FACS)，使用荧光偶联的抗CD3抗体来分析。
如材料和方法中所述，试验了作为式1的化合物的N,N-二烷基丙酰胺的实例的N,N-二甲基丙酰胺(DMPA)使转录本和白细胞稳定的潜力。将血液从8位献血者收集到不同管中，并保持不处理作为对照或通过向9ml EDTA血液加入1ml稳定化添加剂(50％v/v N,N-二甲基丙酰胺，5x MOPS缓冲液，pH5.5)进行处理。如上所述进行血液混合、温育、血液样品等分试样向PAXgene血液RNA管的转移、冷冻、储存和RNA制备。如上所述对RNA进行转录本水平分析。
此外，在稳定化的样品中通过荧光激活细胞分选(FACS)来分析细胞和细胞表面表位的完整性。详细来说，通过针对淋巴细胞特异性的细胞表位CD3的荧光偶联的抗体(PE标记的抗CD3抗体)的结合，来分析细胞表面蛋白的存在和可接近性，而其他白细胞亚型(单核细胞、嗜中性粒细胞)是CD3阴性的。在本实施例中获得的所有结果示出在图1至图5中。
正如预期，来自于四种所选基因的相对转录本水平，在PAXgene血液RNA管中保持稳定，并且在未接受稳定剂的EDTA管中改变(FOS、IL8的离体基因诱导/转录本增加，IL1B、TP53的基因阻遏/转录本丧失)。与稳定剂DMPA混合的EDTA血液样品显示出被稳定化的表达水平，正如由CT值随血液样品储存的时间不变或仅仅少量极小变化所指示的(参见图1至4)。因此，与使用PAXgene RNA管所观察到的效果类似，在用DMPA稳定化后基因表达情况被“冻结”。然而，在DMPA处理的样品中，细胞受到保护，因此允许进行细胞的分开的分析。
在未处理的EDTA血液(FACS[+]对照[EDTA])中，直至该试验系列的最后温育试验时间点，仍检测到淋巴细胞，所述试验系列是将血液在室温下温育三天。在用稳定化添加剂(试验溶液5％v/v DMPA)处理的EDTA血液中，也可以检测到淋巴细胞直至三天(参见图5)。在FACS(-)对照(EDTA)样品中没有检测到特异性荧光信号，而收集在保持不处理和用稳定剂DMPA处理的EDTA管中的新鲜和温育的血液的所有其他样品，均显示出淋巴细胞的具体存在。因此，使用DMPA的稳定化允许分析稳定化的样品中包含的细胞。
因此，实施例1示出了可以从用N,N-二甲基丙酰胺(DMPA)作为稳定剂处理的血液样品有效地分离RNA。提取的RNA适用于RT-PCR分析，并且在与DMPA混合的血液中，转录本水平在室温下被有效地稳定化长时间段。此外，在用N,N-二甲基丙酰胺(DMPA)处理的血液中，淋巴细胞完整，并且可以检测到细胞表面表位(细胞膜蛋白)。因此，式1的N,N-二烷基丙酰胺例如N,N-二甲基丙酰胺，是通过抑制转录本水平的变化使转录本水平以及因此基因转录情况稳定的有效的稳定剂，并且能够使细胞稳定以便可以从稳定化的样品分离细胞用于分析。
II.单独或与半胱天冬酶抑制剂组合地使用N,N-二烷基丙酰胺使血液样品中的细胞外核酸群体稳定
材料和方法
试验了单独或与半胱天冬酶抑制剂组合的N,N-二甲基丙酰胺(DMPA)使含细胞的生物样品、在这里是全血样品稳定的能力。正如可以从下面的实施例中看到的，DMPA有效地使血液样品稳定，并且具体来说，被发现抑制基因组DNA从稳定化的血液样品中包含的细胞的释放。因此，N,N-二烷基丙酰胺能够使细胞外核酸群体稳定。此外，已发现，与半胱天冬酶抑制剂组合的N,N-二烷基丙酰胺有利地提高了所获得的稳定化效果。相应的组合引起延长的稳定化效果，并且使用从不同献血者获得的血液样品时，还显示出获得的稳定化效果的较低的变化性。这是重要的优点，因为它为血液样品提供了保护细胞外核酸群体的均匀可靠的稳定化方法。
血液收集和稳定化
将从献血者获得的血液收集在10ml K2 EDTA管(BD)中。将4.5ml相应收集的血液与0.9ml不同稳定化溶液混合(关于被测试的稳定化溶液的详细情况，参见下面的实施例)。
所有稳定化的血液样品在每种条件和试验时间点下设置三份平行样。在时间点0(参比)，在混合稳定化溶液和血液后，立即产生血浆并提取循环细胞外DNA。将剩余的稳定化血液样品在室温下储存三天和六天。
作为参比对照，将EDTA稳定化的血液样品(收集在不含其他添加剂的K2 EDTA管中)也储存3和6天。此外，当在实施例中指明时，将包含半胱天冬酶抑制剂和N,N-二甲基乙酰胺(DMAA)的稳定化溶液包括在比较中(当向血液样品添加所述稳定化溶液时，获得的混合物中的终浓度：7.2mg K2 EDTA/ml，1μM喹啉-Val-Asp-CH2-OPH(半胱天冬酶抑制剂)和5％DMAA)(参见未公开的PCT/EP2012/070211和PCT/EP2012/068850)。在这里试验的DMAA稳定化的样品总是另外包含半胱天冬酶抑制剂。在随后的实施例中试验了不含DMAA的无半胱天冬酶抑制剂的稳定化溶液。
细胞外核酸分离和分析
通过将含有血液的管颠倒四次，从稳定化和未稳定化的(EDTA)血液样品产生血浆。然后，将管在4℃下以1900xg离心10分钟。将2.5ml血浆级份转移到新的15ml falcon管中，并在4℃下以16.000xg离心10分钟。使用QIAamp循环核酸试剂盒(QIAGEN)，按照制造商的说明书，将2ml相应澄清的血浆用于细胞外核酸分离。
使用靶向18S核糖体DNA的不同片段长度的两种不同的qPCR测定法，来分析分离的细胞外DNA：
18S核糖体DNA：66bp扩增子
18S核糖体DNA：500bp扩增子
表2：概述所使用的通过qPCR检测的DNA靶序列的信息
按照gDNA标准曲线，将各个样品的循环阈值转换成洗出液中gDNA的量。将储存时间点的gDNA量与来自于同一献血者的零时gDNA水平进行比较，并在图中示出为倍数变化。特别是，储存后血液样品的血浆级份中500bp片段的增加，是白细胞的裂解/破坏的指示。因此，释放出的500bp DNA的量越低，稳定化方法的性能越好。
结果
显示了与随后描述的实施例相对应的结果的图，使用了不同扩增子长度的18SrRNA基因，示出了使用不同稳定化溶液时相对于0时间点的DNA的增加(倍数变化)。条标出了每种条件和试验时间点的三份平行样的平均值。
实施例2：使用N,N-二甲基丙酰胺且不使用半胱天冬酶抑制剂的稳定化
在实施例2中，将不同浓度的N,N-二甲基丙酰胺(DMPA)用于稳定化从不同献血者获得的血液样品。分析的焦点是通过分析18S rDNA的增加所确定的细胞外核酸群体的稳定化。样品的稳定化和处理按照II下的材料和方法中所述来进行。
不含半胱天冬酶抑制剂的稳定化溶液包含不同浓度的N,N-二甲基丙酰胺和EDTA。当向血液样品加入这些稳定化溶液时，在血液/稳定化溶液混合物中获得下列终浓度：7.2mg K2 EDTA/ml和不同浓度的N,N-二甲基丙酰胺(1.5％、2％或2.5％)。还包含DMAA稳定化的样品(5％)作为参比。
图6和7示出了当将血液用不同浓度的DMPA稳定时获得的稳定化结果。正如可以看到的，包含DMPA作为稳定剂的所测试的稳定化组合物，处于有效地稳定化细胞外核酸群体的不同浓度下，正如可以从在N-甲基甲酰胺稳定化的样品中18S rDNA增加的显著降低看出的。在试验的整个稳定化时期内(长达6天)观察到稳定化效果，即使DMPA是唯一的稳定剂并使用相当低的浓度。
实施例3：使用N,N-二甲基丙酰胺和半胱天冬酶抑制剂的稳定化
将来自于两个不同献血者的血液收集在10ml K2 EDTA管(BD)中。将4.5ml相应地收集的血液与包含N,N-二甲基丙酰胺、EDTA和半胱天冬酶抑制剂的0.9ml稳定化溶液混合。由此，在血液/稳定化混合物中获得了下列终浓度：
7.2mg K2 EDTA，1μM喹啉-Val-Asp-CH2-OPH(半胱天冬酶抑制剂)，以及分别2.5％、5％或7.5％(v/v)N,N-二甲基丙酰胺或5％(v/v)DMAA。
所有稳定化的血液样品在每种条件和试验时间点下设置三份平行样。在时间点0(参比)，在混合稳定化溶液和血液后，立即产生血浆并提取ccfDNA。将剩余的血液样品在室温下储存三天和六天。作为对照，将EDTA稳定化的血液样品也储存三天和六天。通过将含有血液的管颠倒四次，从稳定化和未稳定化的(EDTA)血液样品产生血浆。然后，将管以3.000rpm/1912xg离心15分钟。将2.5ml血浆级份转移到新的15ml falcon管中，并以16.000xg离心10分钟。使用QIAamp循环核酸试剂盒，将2ml相应澄清的血浆用于分离细胞外核酸。
结果示出在图8和9中。使用了不同扩增子长度的18S rRNA基因，示出了使用2.5％、5％和7.5％N,N-二甲基丙酰胺或5％DMAA时相对于0时间点的DNA的增加(倍数变化)。条标出了每种条件和试验时间点的三份平行样的平均值。与未稳定化的EDTA血液相比，本发明的所有溶液在室温下储存3和6天后显示出明显更低的释放的DNA的量，并显示出与DMAA可比的结果。
实施例4：使用N,N-二甲基丙酰胺和半胱天冬酶抑制剂的稳定化
将来自于两个不同献血者的血液收集在10ml K2 EDTA管(BD)中。将4.5ml相应地收集的血液与包含K2 EDTA、喹啉-Val-Asp-CH2-OPH(半胱天冬酶抑制剂，溶解在DMSO中)和不同浓度的N,N-二甲基丙酰胺(DMPA)或DMAA的0.9ml稳定化溶液混合。样品的稳定化和处理按照II下材料和方法中所述进行。
在血液/稳定化混合物中获得下列终浓度：
7.2mg K2 EDTA/ml，1μM喹啉-Val-Asp-CH2-OPH(半胱天冬酶抑制剂)和不同浓度的N,N-二甲基丙酰胺(2.5％、5％或7.5％)或5％DMAA。
结果示出在图10和11中。分析的焦点是通过分析18S rDNA的增加而确定的细胞外核酸群体的稳定化。使用不同扩增子长度的18S rRNA基因，示出了使用2.5％、5％和7.5％N,N-二甲基丙酰胺(DMPA)或5％DMAA以及半胱天冬酶抑制剂时相对于0时间点的DNA的增加(倍数变化)。条标出了每种条件和试验时间点的三份平行样的平均值。正如可以看到的，与未稳定化的EDTA血液相比，在室温下储存3和6天后，本发明的溶液显示出明显更低的释放的DNA的量，并显示出与DMAA+半胱天冬酶抑制剂的稳定化可比的结果。因此，实现了细胞外核酸群体的稳定化。此外，对获得的血浆进行检查，以便分析是否发生溶血。具体来说，从用2.5％和5％DMPA稳定化的血液样品获得的血浆样品，没有显示出溶血的迹象。
实施例5：使用N,N-二甲基丙酰胺和半胱天冬酶抑制剂的稳定化
在实施例5中，使用了不同浓度的DMPA与半胱天冬酶抑制剂的组合来稳定化血液样品。分析的焦点是通过分析18S rDNA的增加而确定的细胞外核酸群体的稳定化。样品的稳定化和处理按照II下材料和方法中所述进行。
稳定化溶液包含不同浓度的DMPA、半胱天冬酶抑制剂和EDTA。当向血液样品加入这些稳定化溶液时，在血液/稳定化溶液混合物中获得下列终浓度：
7.2mg K2 EDTA/ml，1μM喹啉-Val-Asp-CH2-OPH(半胱天冬酶抑制剂)和不同浓度的DMPA(详细情况参见图)。
图12至16示出了从来自于不同献血者的血液获得的稳定化结果，其中将血液样品用不同浓度(详细情况参见图)的DMPA和半胱天冬酶抑制剂稳定。正如可以看到的，包含不同浓度DMPA的所试验的稳定化组合物有效地使细胞外核酸群体稳定，正如可以从DMPA稳定化的样品中18S rDNA增加的显著降低所看出的。因此，与半胱天冬酶抑制剂组合时，不同浓度的DMPA对稳定化血液样品高度有效。

Claims (25)

1.一种通过将含细胞的生物样品与至少一种式1的化合物相接触来稳定所述样品的方法
其中R1是氢基团或烷基基团，R2和R3是以直链或支链方式排列并具有1-20个原子的碳链长度的相同或不同的烃基团，R4是氧、硫或硒基团，其中所述式1的化合物是N,N-二烷基丙酰胺，并且其中所述方法适合于使包含在所述含细胞的样品中的细胞外核酸群体稳定。
2.权利要求1的方法，其中所述式1的化合物是N,N-二甲基丙酰胺。
3.权利要求1或2的方法，其具有一个或多个下列特征：
a)由于所述稳定化，所述样品中存在的核酸的降解减少；
b)所包含的细胞中的转录组和/或转录本水平被稳定化；
c)在稳定化后，选自c-fos、IL-1β、IL-8和p53的一种或多种标志物基因的转录本水平被稳定至少48小时；
d)基因组DNA从所述样品中包含的细胞向所述样品的无细胞部分的释放减少，和/或
e)其中所述含细胞的生物样品中包含的细胞被稳定化。
4.权利要求1或2的方法，其用于使血液样品稳定，所述方法包括将所述血液样品与N,N-二烷基丙酰胺和抗凝剂相接触，其中在所包含的细胞中的转录本水平被稳定化。
5.权利要求1或2的方法，其中所述方法具有一个或多个下列特征：
a)所述稳定化不促进所述含细胞的样品中包含的有核细胞的裂解；
b)所述稳定化方法在不对所述样品进行交联的情况下进行；和/或
c)所述稳定化不涉及诱导核酸-核酸、蛋白质-核酸和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂的使用。
6.权利要求1或2的方法，其中将所述含细胞的样品另外地与半胱天冬酶抑制剂相接触。
7.权利要求1或2的方法，其中将所述含细胞的样品另外地与泛半胱天冬酶抑制剂相接触。
8.权利要求1或2的方法，其中所述方法具有一个或多个下列特征：
a)N,N-二烷基丙酰胺和任选的其他添加剂被包含在稳定化组合物中，并且其中所述稳定化组合物与给定体积的含细胞的样品的体积比选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5；
b)使被稳定了的含细胞的样品经受核酸分析和/或检测方法；
c)从被稳定了的样品分离细胞内和/或细胞外核酸，并对分离的核酸进行分析和/或检测；
d)去除被稳定了的样品中包含的细胞；和/或
e)储存(i)被稳定了的含细胞的生物样品，(ii)已去除细胞的被稳定了的样品，和/或(iii)从所述样品中去除的细胞；
f)从被稳定了的样品分离核酸。
9.权利要求8的方法，其中对所述被去除的细胞进行分析，和/或其中从所述被去除的细胞分离生物分子。
10.权利要求8的方法，其中对所述被去除的细胞进行分析，和/或其中从所述被去除的细胞分离核酸或蛋白质。
11.一种用于从生物样品分离核酸的方法，所述方法包括下列步骤：
a)按照权利要求1至10的任一项中限定的方法使含细胞的样品稳定；
b)从被稳定了的样品分离核酸。
12.权利要求11的方法，其中步骤b)包括分离细胞内核酸。
13.权利要求11的方法，其中步骤b)包括分离细胞内RNA。
14.权利要求11至13中任一项的方法，其中步骤b)包括分离细胞外核酸。
15.权利要求11至13中任一项的方法，其中所述样品是血液，并且其中从剩余的样品分离细胞并从所述剩余的样品分离细胞外核酸。
16.权利要求11至13中任一项的方法，其中对分离的核酸在另一个步骤c)中进行处理和/或分析。
17.权利要求11至13中任一项的方法，其中对分离的核酸在另一个步骤c)中进行：
i)修饰；
ii)与至少一种酶相接触；
iii)扩增；
iv)反转录；
v)克隆；
vi)测序；
vii)与探针相接触；
viii)检测；
ix)定量；
ix)鉴定；和/或
x)进行基因表达情况分析。
18.一种适用于使含细胞的生物样品稳定的组合物，其包含：
a)至少一种式1的化合物
其中R1是氢基团或烷基基团，R2和R3是以直链或支链方式排列并具有1-20个原子的碳链长度的相同或不同的烃基团，R4是氧、硫或硒基团，并且其中所述式1的化合物是N,N-二烷基丙酰胺；和
b)至少一种抗凝剂。
19.权利要求18的组合物，其中所述N,N-二烷基丙酰胺是N,N-二甲基丙酰胺，并且其中所述抗凝剂是螯合剂。
20.权利要求18或19的组合物，其中所述组合物包含细胞凋亡抑制剂。
21.权利要求18或19的组合物，其具有一个或多个下列特征：
a)它能够使细胞稳定并减少基因组DNA从所述含细胞的生物样品中包含的细胞向所述样品的无细胞部分的释放；
b)它能够减少源自于被稳定了的样品中包含的细胞的基因组DNA对所述生物样品中包含的细胞外DNA群体的稀释；
c)它能够减少源自于被稳定了的样品中包含的细胞的细胞内核酸对所述生物样品中包含的细胞外核酸群体的稀释；
d)所述稳定化组合物没有以其中添加剂会诱导或促进细胞裂解的浓度来包含所述添加剂；
e)所述稳定化组合物不包含诱导蛋白质-DNA和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂；
f)所述稳定化组合物不包含甲醛、***、多聚甲醛或甲醛释放剂；
g)所述稳定化组合物不包含毒剂，和/或
h)所述稳定化组合物能够在不冷藏的情况下，使所述含细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定至少两天；
i)所述组合物能够使含细胞的样品中包含的细胞的基因转录情况稳定和/或能够使含细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定；和/或
j)其中所述稳定化组合物作为与血液样品的混合物被提供。
22.权利要求21的组合物，其中所述稳定化组合物能够在不冷藏的情况下，使所述含细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定至少三天。
23.权利要求21的组合物，其中所述稳定化组合物能够在不冷藏的情况下，使所述含细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定两天至三天。
24.权利要求21的组合物，其中所述稳定化组合物能够在不冷藏的情况下，使所述含细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定两天至六天。
25.权利要求21的组合物，其中所述稳定化组合物能够在不冷藏的情况下，使所述含细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定两天至七天。
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