CN104749385A - 定量检测25-羟基维生素d的免疫层析试剂条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试纸条及其制备方法。本发明所述定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试纸条包括依次设置的加样区、结合物释放区、反应区和吸水区；所述结合物释放区为包被胶体金或量子点或上转换发光材料UCP标记的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体的玻璃纤维素膜；所述反应区为测试区和控制区，测试区包被25羟基维生素D-偶联蛋白，控制区包被羊抗鼠IgG 抗体的硝酸纤维素膜。本发明可准确、定量、快速、灵敏的检测人全血、血清、血浆中的25羟基维生素D，并且所需仪器不同于以往检验科的大型昂贵仪器，只需一台小型的相应免疫分析仪即可，实现了实时检测。

Description

定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试剂条及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试剂条及其制备方法。

背景技术

维生素D为类固醇衍生物，属脂溶性维生素。人体中的维生素D仅有小部分来源于食物，体内所需的维生素D的95%来源于阳光中紫外线照射皮肤产生。维生素D经血液循环进入肝脏，在25-羟化酶作用下转化为25-羟基维生素D，然后在肾近端小管上皮细胞线粒体内α羟化酶***的作用下转变为1,25-二羟基维生素D，它是维生素D 最大的生物作用形式，可以促进肠道钙结合蛋白的合成。而25-羟维生素D是代谢中的主要循环形式，能反映机体的维生素D 储存水平并与维生素D 缺乏的临床症状相关联，因此25-羟基维生素D是衡量维生素D体内水平的最可靠的临床指标。

维生素 D 的主要作是调节钙、磷代谢，靠促进钙和磷在肠道内的吸收，以及肾小管重吸收钙磷的方式，来提高血液中的钙磷水平，并用钙化的方法，与甲状旁腺激素和降钙素以及其他激素共同作用，使骨质变得坚硬。除了具有传统意义上的骨骼效应，还具有影响自身免疫疾病、心血管病、糖尿病、肿瘤等非骨骼效应。研究发现，维生素D 缺乏会直接影响人类基因的表达，这些基因与风湿性关节炎和糖尿病等众多疾病有关。维生素D 缺乏会导致少儿佝偻病和成年人的软骨病。研究还表明维生素D缺乏可能使某些癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病的发病风险升高。

临床上对维生素D 的定量检测已成为常规检测项目和体检项目。建立一种快速，简便，灵敏，准确可靠的检测维生素D 水平的方法尤为重要。目前25-羟维生素D 的测定方法主要有酶联免疫法、放射免疫法、液相色谱- 质谱检测法以及化学发光法。酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大。放射免疫法存在着环境污染问题；液相色谱质谱操作复杂，用时较长；而化学发光法灵敏度虽高，但检测成本较高，需要特定化学发光仪，这些原因导致其应用范围较小。

发明内容

本发明为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试剂条及其制备方法，具有采样容易、操作简便、敏感度高、特异性强、稳定性好等优点，适合在基层医院、诊所以及体检中心等单位使用，对于降低维生素D 检测成本、普及人体维生素D检测、减少临床盲目用药具有重要意义。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试纸条，包括依次设置的加样区、结合物释放区、反应区和吸水区；所述结合物释放区为包被胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体的玻璃纤维素膜；所述反应区为测试区和控制区，测试区包被25羟基维生素D-偶联蛋白，控制区包被羊抗鼠IgG 抗体的硝酸纤维素膜。

所述胶体金、量子点、上转换发光材料都是作为免疫层析技术中的标记物，间接读出待测物的浓度。

胶体金已发展成为免疫层析技术中最常用到的标记物。但是其主要进行定性或半定量检测，限制了它的应用范围。

胶体金的定量免疫层析技术的原理：胶体金颗粒在特定波长下，对光的吸收和散射与胶体金颗粒的量相关，通过光电感应器检测胶体金颗粒对光的吸收和散射，从而获得待测抗原的量。

量子点是一种半导体纳米晶，它激发光谱宽，呈连续分布，而发射光谱窄，单色性好且颜色可调，发光强度是传统有机荧光素的20~50倍，并且具有持久的光化学稳定性，其独特的光学性质使其作为一种新型的荧光探针而得到广泛关注。量子点作为标记物较之胶体金具有更高的灵敏度。

量子点缺点：制备条件苛刻、反应步骤比较复杂、试剂成本高、毒性较大等。

上转换发光技术是免疫层析原理与光电转换原理相结合的免疫检测技术，以上转换发光颗粒作为示踪物，经过红外光激发后上传发光颗粒发射可见光，实现能量的上转，通过对光学信号的转换，能够快速对待测物进行定量检测。

上转换发光材料的优点：可以有效降低光致电离作用引起基质材料的衰退；不需要严格的相位匹配，对激发波长的稳定性要求不高；输出波长具有一定的可调协性。

上转换发光材料的缺点：反应时间较长；标准曲线范围相对较窄；发光效率较低，稳定性较差。

本发明所述定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试纸条将包被有胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体的结合物释放区与包被有25-羟基维生素D-偶联蛋白的测试区连在一起，利用胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）免疫层析法竞争性结合单抗原理，即被检测者血清的25-羟基维生素与包被在硝酸纤维素膜上的25-羟基维生素D-偶联蛋白竞争性结合25-羟基维生素D单克隆抗体的原理，通过检测测试区的颜色深浅（或被激发的量子点的荧光强度或被激发的UCP颗粒的发光强度），定量检测人血清中的25-羟基维生素D。

当血清中不存在25-羟基维生素D时，胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体由于毛细管作用沿着结合物释放区移动至测试区，与该测试区包被在硝酸纤维素膜上的25-羟基维生素D结合，从而在测试区出现一条***条带（或经激发后产生强的荧光信号或经激发后产生强的发射光）；当血清中存在25-羟基维生素D时，胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体首先与血清中的25-羟基维生素D结合形成复合物，然后受毛细管作用沿着结合物释放区移动至测试区，但没有或仅有少量的胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体与测试区的25-羟基维生素D-偶联蛋白结合，测试区线颜色消失或变浅（或经激发后只能产生弱的荧光信号或经激发后只能产生弱的发射光），在一定条件下，测试区线颜色的深浅（或荧光的强度或发射光的强度）和样品中的浓度呈负相关，采用相应的免疫层析仪可定量判断人血清中的25-羟基维生素D浓度。

而控制区包被羊抗鼠IgG抗体，胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体与包被的羊抗鼠IgG抗体结合，从而在控制区出现一条***条带（或经激发后产生强的荧光信号或经激发后产生强的发射光），可判断试纸条及检测结果是否有效，也作为测定试剂的内控标准。如果控制区没有产生***条带（或经激发后没有产生强的荧光信号或经激发后没有产生强的发射光），则说明试纸条失效。

进一步的，本发明所述25-羟基维生素D检测试纸条还包括PVC背衬板，所述加样区、结合物释放区、反应区、吸水区依次相互搭接的粘贴在PVC背衬板上。

由于25-羟基维生素D的浓度最终由胶体金的颜色深浅（或量子点经激发后产生的荧光强度或上转换发光材料UCP经激发后产生的发射光强度）来决定，因此25-羟基维生素D单克隆抗体扮演了连接胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）和25-羟基维生素D这两种物质的重要角色，既能与胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）结合，又能与25-羟基维生素D结合，其中25-羟基维生素D单克隆抗体与25-羟基维生素D结合是一个自发的过程，而25-羟基维生素D单克隆抗体与胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）的结合需要人为的促进。生产的一个重要步骤就是胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）25-羟基维生素D单克隆抗体。

其中，作为优选，本发明所述胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）的25-羟基维生素D单克隆抗体的制备方法为向1mL pH7.4，50mM 的磷酸盐缓冲液中加入2μmol 胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）和1mg鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体，室温下温和振荡2 小时，然后12000r/min 离心30min，取沉淀即得。

所述25羟基维生素D-偶联蛋白的制备方法包括以下步骤：

将10mg维生素D 溶解于100μL有机溶剂中，然后在搅拌条件下向10mL，浓度为5mg/mL 的偶联蛋白溶液中逐滴加入溶解后的维生素D，再逐滴加入体积百分比浓度为50％的戊二醛水溶液至溶液中戊二醛的体积百分比浓度为1％～ 3％，搅拌5min ～ 20min 后移至4℃下搅拌反应16h ～ 18h，反应后的反应液用PBS 缓冲溶液在4℃下透析8h，透析过程中换液2 ～ 3 次，透析物离心后取上清液，最后将上清液用0.45μm 滤膜过滤，得到维生素D 与偶联蛋白的偶联物，即25羟基维生素D-偶联蛋白，-20℃保存备用。

其中，所述有机溶剂为三氯甲烷、甲醇、乙醇、正己烷、乙腈、二甲基亚砜、1，4-二氧六环中的一种。

其中，所述偶联蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白（OVA）或血蓝蛋白（KLH）中的一种。

其中，所述鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体、25-羟基维生素D和羊抗鼠IgG抗体是本领域技术人员公知的，可以通过商业途径获得或通过现有技术中公开的方法制备得到。

作为信号读取的胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）是试纸条定量检测中的重点。胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）的大小、均一度、稳定性都会影响产品的最后读数。作为优选，本发明所述25-羟基维生素D检测试纸条中，所述胶体金粒径为20~40nm，吸收波长为530nm（或量子点粒径为5nm，激发波长为365nm，发射波长为605nm；或上转发光材料UCP 粒径为5nm）。

本发明的另一目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了所述定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）标记的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体，按1ml溶液铺20cm²的比例，用喷膜仪喷涂在玻璃纤维素膜上获得结合物释放区；

步骤2：以0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液将25-羟基维生素D配置成0.8~1.6mg/ml的溶液，在硝酸纤维素膜上用喷膜仪以1~1.5 ul/cm的量包被测试区；另将羊抗鼠IgG抗体配置成1~3mg/ml的溶液，用喷膜仪以1~1.5 ul/cm的量包被控制区；划线后的硝酸纤维素膜在36-38℃下干燥8-12小时，制成包被25-羟基维生素D的检测区和包被羊抗鼠IgG的控制区的硝酸纤维素膜；

步骤3：在相对湿度小于30%的条件下，取PVC背衬板，将已包被的硝酸纤维素膜粘贴在塑料基板的中部，在硝酸纤维素膜的检测区一侧粘贴结合物释放区，在结合物释放区另一侧粘贴加样区；在硝酸纤维素膜的控制区一侧粘贴吸水区；邻接接口相互叠压1~2mm，粘贴好的大板切成3~5mm宽的检测试纸条。

本发明所述的定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试纸条相比现有技术的有益效果为：

本发明使用时结合带有25-羟基维生素D内置标准曲线的免疫层析仪，实现对25-羟基维生素D浓度的快速定量检测，适合血清、血浆、全血，适合微量样品。具有采样容易、操作简便、敏感度高、特异性强、稳定性好等优点，适合在基层医院、诊所以及体检中心等单位使用，对于降低维生素D 检测成本、普及人体维生素D检测、减少临床盲目用药具有重要意义。

附图说明

图1示本发明所述定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试纸条的示意图；其中1：加样区，2：结合物释放区，3：反应区，4：吸水区；5：PVC背衬板；T：检测区；C：控制区；

图2为罗氏化学发光法25-羟基维生素D测定结果示意图；

图3为所述智能免疫定量分析仪的前侧视图（卡托伸出）；

图4为所述智能免疫定量分析仪的前侧视图（卡托收回）；

图5为所述智能免疫定量分析仪的后侧视图；

图6为所述智能免疫定量分析仪的仰视图；

图7为所述智能免疫定量分析仪的内部结构图。

具体实施方式

本发明公开了一种定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试纸条及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试纸条及其制备方法中所用生物材料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

一种25羟基维生素D定量检测试纸条，包括依次设置的加样区1、结合物释放区2、反应区3和吸水区4；所述结合物释放区为包被鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体的玻璃纤维素膜，所述鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体通过胶体金、量子点或上转换发光材料UCP包被；所述反应区分为测试区T和控制区C，所述测试区是包被有25羟基维生素D-偶联蛋白，所述控制区是包被有羊抗鼠IgG 抗体的硝酸纤维素膜。

进一步的，所述定量检测试纸条还包括PVC背衬板（5），所述加样区、结合物释放区、反应区、吸水区依次相互搭接的粘贴在PVC背衬板上。

进一步的，胶体金或量子点或上转换发光材料UCP的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体的制备方法为：向磷酸盐缓冲液中加入胶体金或量子点或上转换发光材料UCP和鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体，室温下温和振荡2 小时，然后离心，取沉淀即得到所述的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体。

进一步的，所述胶体金的制备方法为：将氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀，将氯金酸还原成由直径为20nm ～ 40nm的胶体金颗粒构成的胶体金。

进一步的，所述量子点粒径为5nm，激发波长为365nm，发射波长为605nm；所述上转换发光材料即UCP 的粒径为5nm。

进一步的，所述偶联蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白中的一种。

进一步的，所述25羟基维生素D-偶联蛋白的制备方法包括以下步骤：将10mg维生素D 溶解于100μL有机溶剂中，然后在搅拌条件下向10mL，浓度为5mg/mL 的偶联蛋白溶液中逐滴加入溶解后的维生素D，再逐滴加入体积百分比浓度为50％的戊二醛水溶液至溶液中戊二醛的体积百分比浓度为1％～ 3％，搅拌5min ～ 20min 后移至4℃下搅拌反应16h ～ 18h，反应后的反应液用PBS 缓冲溶液在4℃下透析8h，透析过程中换液2 ～ 3 次，透析物离心后取上清液，最后将上清液用0.45μm 滤膜过滤，得到维生素D 与偶联蛋白的偶联物，即25羟基维生素D-偶联蛋白，-20℃保存备用。

其中，所述有机溶剂为三氯甲烷、甲醇、乙醇、正己烷、乙腈、二甲基亚砜、1，4-二氧六环中的一种

所述的25-羟基维生素D定量检测试纸条的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1：将标记有鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体的胶体金或量子点或上转换发光材料UCP，用喷膜仪喷涂在玻璃纤维素膜上，置于温度20-30℃，相对湿度30-35％下干燥，获得结合物释放区；

步骤2：以10mM、pH 7.4 PB缓冲液将25-羟基维生素D-偶联蛋白配置成1mg/ml的溶液，在硝酸纤维素膜上用喷膜仪以1 μl/cm的量包被测试区；另将羊抗鼠IgG抗体配置成1mg/ml的溶液，用喷膜仪以1 μl/cm的量包被控制区；包被了测试区和控制区后的硝酸纤维素膜在38℃下干燥8小时，制成包被25-羟基维生素D-偶联蛋白的检测区和包被羊抗鼠IgG的控制区，即得到反应区；

步骤3：将加样区、结合物释放区、反应区和吸水区相互搭接的粘贴在PVC背衬板上即得所述的25-羟基维生素D定量检测试纸条。

所述的25-羟基维生素D定量检测试纸条的使用方法为，将所述25-羟基维生素D定量检测试纸条置于智能免疫定量分析仪中，使所述智能免疫定量分析仪处于待机状态，将所述25-羟基维生素D定量检测试纸条置于智能免疫定量分析仪中，将待测样品加至试剂条加样区，在智能免疫定量分析仪界面点击测试，智能免疫定量分析仪自动计时15分钟后进行检测并显示测试结果。

实施例2：结合物释放区的制备

向1mL pH7.4，50mM 的磷酸盐缓冲液中加入2μmol 胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）和1mg鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体，室温下温和振荡2 小时，然后12000r/min 离心30min，取沉淀即得。

胶体金（或量子点或上转换发光材料UCP）标记的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体，按1ml溶液铺20cm²的比例，用喷膜仪喷涂在玻璃纤维素膜上，置于温度20-30℃，相对湿度30-35％干燥5 小时，获得结合物释放区。

实施例3：反应区的制备

以0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液将25-羟基维生素D-偶联蛋白配置成0.8~1.6mg/ml的溶液，在硝酸纤维素膜上用喷膜仪以1~1.5μl/cm的量包被测试区；另将羊抗鼠IgG抗体配置成1~3mg/ml的溶液，用喷膜仪以1~1.5μl/cm的量包被控制区；划线后的硝酸纤维素膜在36-38℃下干燥8-12小时，制成包被25-羟基维生素D-偶联蛋白的检测区和包被羊抗鼠IgG的控制区的硝酸纤维素膜。

实施例4：试纸条的制备

在相对湿度小于30%的条件下，取PVC背衬板，将已包被的硝酸纤维素膜粘贴在塑料基板的中部，在硝酸纤维素膜的检测区T一侧粘贴结合物释放区，在结合物释放区另一侧粘贴加样区；在硝酸纤维素膜的控制区一侧粘贴吸水区；邻接接口相互叠压1~2mm，粘贴好的大板切成3~5mm宽的检测试纸条。

对比例

基于本发明提供的试纸条的定量检测方法与罗氏化学发光法25-羟基维生素D检测试纸条相关性比较。

取浓度为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL 、80ng/mL和100ng/mL的25-羟基维生素D标准品各100μL，加入本发明实施例4制备的试纸条的加样区，室温放置15min。将试纸条***智能免疫定量分析仪读取25-羟基维生素D含量，每个浓度重复测定3次。根据25-羟基维生素D的浓度及相应的读数，绘制标准曲线。

取100份血液样品，将其等分，一份采用本发明制备的试纸条及专用免疫层析检测仪进行测定，另一份采用罗氏化学发光法25-羟基维生素D检测进行测定。测定结果见图2，结果显示其相关性很好r=0.9905，P＞0.05，两种方法间无统计学差异。

所述智能免疫定量分析仪为中国实用新型专利《一种便携式的智能免疫定量分析仪》（申请号：2014208245854，申请日：2014年12月23日，申请人：普迈德（北京）科技有限公司）所公开。如图3、图4所示，所述定量分析仪包括上壳体100及与其扣合的下壳体200，优选地，上壳体100设计为平面且与水平面呈一定角度，符合人的视觉观察习惯，上壳体100和下壳体200均采用不发生磁性和荧光效应的材料制成，例如：丙烯腈-丁二烯-苯乙烯，可适用于免疫胶体金法、免疫磁珠法和免疫荧光法等多种免疫层析检测仪上。

       如图3、图4所示，上壳体100设有屏幕101和用于在纸条上打印检测报告的出纸模块，屏幕101位于上壳体100的中部，与上壳体100的表面平行，与下壳体200底面呈一定角度设置，方便让使用者可以直接查看分析检测情况报告；出纸模块包括可揭合的蓄纸槽103和用于裁断纸条的锯齿102，蓄纸槽103位于上壳100上端的中间部分，其下部设有打印机构，用于打印检测报告，打印好的检测报告从蓄纸槽103的下端出来，锯齿102位于蓄纸槽103出纸的一侧，用于裁断打印好的检测报告；下壳体200设有接口插座和用于盛放试纸条的卡托203，卡托203移出可以更换试纸条，接口插座用于该定量分析仪与外设设备的连接。

       上壳体100的表面蓄纸槽103与屏幕101之间的位置设有公司标识，上壳体100的蓄纸槽103左右两侧设有凹槽104，方便蓄纸槽的开启。

       如图5所示，下壳体200后端设有接口插座和电源开关205，前端设有卡托203和卡托开门204，具体到本实施例中，下壳体200的后端设有接口插座和电源开关205。其中，如图5所示，电源开关205位于下壳体200的后端，防止使用者在使用时无意触碰到电源开关导致误关机。

       如图5所示，接口插座包括电源插口202和一个或多个外设插口201，优选地，外设插口201和电源插口202呈一字型排列。具体到本实施例中，共有5个可连接不同外设设备的外设插口201，分别为一个PS2接口、一个网口、一个B型USB接口和一个miniUSB接口，5个外设插口201与电源插口202之间彼此隔离，方便使用者简单快捷地连接外设设备。

       如图6所示，下壳体200的底面设有一个锂电池槽206，具体到本实施例中，锂电池槽用于安装设备锂电池，可以使设备摆脱对电源的依赖，实现真正意义上的可移动化。

       使用时，将定量分析仪通过电源插口202接通电源后，通过外设插口201与临床检测设备连接，打开电源开关205，按下开机键105，可以开始进行检测分析；检测分析完毕后，屏幕101可以直接显示出检测分析情况报告，通过蓄纸槽103下的打印机构可以将检测分析报告打印到热敏纸上，通过锯齿楞102裁断；打开蓄纸槽103可以对打印机构进行维护和清理。试纸条检测完毕卡托伸出时，在卡托203位置可以更换试纸条。

       如图7所示，检测胶体金免疫层析试纸，运行设备，预热10min。将被检测样本如血清、血浆、全血或尿液等，按要求添加到试纸条加样孔中，一定时间后放入设备的卡托203，触摸测试按钮，仪器自动检测，并即时打印检测结果，或由接口插座发送或倒出测试结果。

综上所述，所述定量分析仪包括上壳体100及与其扣合的下壳体200，上壳体100设有开机键、可以查看分析情况的屏幕101和用于在纸条上打印检测报告的出纸模块，出纸模块包括蓄纸槽103和用于裁断纸条的锯齿102，蓄纸槽103位于上壳体100上端的中间部分，锯齿102位于蓄纸盖103出纸一侧，方便裁断检测报告，下壳体200设有接口插座和用于盛放试纸条的卡托203及卡托开门204。

Claims (10)

1.一种25羟基维生素D定量检测试纸条，其特征在于，包括依次设置的加样区（1）、结合物释放区（2）、反应区（3）和吸水区（4）；所述结合物释放区为包被鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体的玻璃纤维素膜，所述鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体通过胶体金、量子点或上转换发光材料UCP包被；所述反应区分为测试区（T）和控制区（C），所述测试区是包被有25羟基维生素D-偶联蛋白，所述控制区是包被有羊抗鼠IgG 抗体的硝酸纤维素膜。

2.根据权利要求1所述的25羟基维生素D定量检测试纸条，其特征在于，还包括PVC背衬板（5），所述加样区、结合物释放区、反应区、吸水区依次相互搭接的粘贴在PVC背衬板上。

3.根据权利要求1所述的25羟基维生素D定量检测试纸条，其特征在于，胶体金或量子点或上转换发光材料UCP的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体的制备方法为：向磷酸盐缓冲液中加入胶体金或量子点或上转换发光材料UCP和鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体，室温下温和振荡2 小时，然后离心，取沉淀即得到所述的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体。

4.根据权利要求1或3所述的25-羟基维生素D检测试纸条，其特征在于，所述胶体金的制备方法为：将氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀，将氯金酸还原成由直径为20nm ～ 40nm的胶体金颗粒构成的胶体金。

5.根据权利要求4所述的25-羟基维生素D检测试纸条，其特征在于，所述量子点粒径为5nm，激发波长为365nm，发射波长为605nm；所述上转换发光材料即UCP 的粒径为5nm。

6.根据权利要求1所述的定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试纸条，其特征在于，所述偶联蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白中的一种。

7.根据权利要求1所述的定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试纸条，其特征在于，所述25羟基维生素D-偶联蛋白的制备方法包括以下步骤：

将10mg维生素D 溶解于100μL有机溶剂中，然后在搅拌条件下向10mL，浓度为5mg/mL 的偶联蛋白溶液中逐滴加入溶解后的维生素D，再逐滴加入体积百分比浓度为50％的戊二醛水溶液至溶液中戊二醛的体积百分比浓度为1％～ 3％，搅拌5min ～ 20min 后移至4℃下搅拌反应16h ～ 18h，反应后的反应液用PBS 缓冲溶液在4℃下透析8h，透析过程中换液2 ～ 3 次，透析物离心后取上清液，最后将上清液用0.45μm 滤膜过滤，得到维生素D 与偶联蛋白的偶联物，即25羟基维生素D-偶联蛋白，-20℃保存备用。

8.根据权利要求7所述的定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试纸条，其特征在于，所述有机溶剂为三氯甲烷、甲醇、乙醇、正己烷、乙腈、二甲基亚砜、1，4-二氧六环中的一种。

9.一种如权利要求1-8任意一项所述的25-羟基维生素D定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1：将标记有鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体的胶体金或量子点或上转换发光材料UCP，用喷膜仪喷涂在玻璃纤维素膜上，置于温度20-30℃，相对湿度30-35％下干燥，获得结合物释放区；

步骤2：以10mM、pH 7.4 PB缓冲液将25-羟基维生素D-偶联蛋白配置成1mg/ml的溶液，在硝酸纤维素膜上用喷膜仪以1 μl/cm的量包被测试区；另将羊抗鼠IgG抗体配置成1mg/ml的溶液，用喷膜仪以1 μl/cm的量包被控制区；包被了测试区和控制区后的硝酸纤维素膜在38℃ 下干燥8小时，制成包被25-羟基维生素D-偶联蛋白的检测区和包被羊抗鼠IgG的控制区，即得到反应区；

步骤3：将加样区、结合物释放区、反应区和吸水区相互搭接的粘贴在PVC背衬板上即得所述的25-羟基维生素D定量检测试纸条。

10.一种如权利要求1-8任意一项所述的25-羟基维生素D定量检测试纸条的使用方法，其特征在于，将所述25-羟基维生素D定量检测试纸条置于智能免疫定量分析仪中，使所述智能免疫定量分析仪处于待机状态，将所述25-羟基维生素D定量检测试纸条置于智能免疫定量分析仪中，将待测样品加至试剂条加样区，在智能免疫定量分析仪界面点击测试，智能免疫定量分析仪自动计时15分钟后进行检测并显示测试结果。