CN104745636B - 栀子蓝色素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了栀子蓝色素的制备方法。具体工艺步骤如下：（1）栀子叶培养基的制备，包括固体培养基制备和液体培养基制备；（2）曲霉液体种子制备，包括制备一级、二级和三级种子；（3）接种发酵，包括液固双向发酵和液体发酵；（4）栀子苷酶解，包括液固双向发酵物酶解和液体发酵物酶解；（5）栀子蓝色素生成及纯化。采用加氨基酸加热使栀子苷苷元与氨基酸缩合生成栀子蓝色素，用树脂柱进行色素纯化，最后得到蓝黑色粉末，此即色价大于190(E1%1cm 590nm)的栀子蓝色素。本发明利用栀子叶生产栀子蓝色素，极大地降低了生产成本；本发明工艺简便、稳定、生产设备投资可大可小，生产灵活，适合多种规模的企业投资。
Description
技术领域
本发明属于生物制品的提取制备技术领域，具体涉及栀子蓝色素的制备方法。
背景技术
栀子蓝色素最初是由栀子果实中京尼平苷水解后与氨基酸反应制得。栀子蓝色素溶解于水和低醇等亲水溶剂，具有耐光热、耐酸碱等优良的理化性质及独特的染色效果。栀子蓝色素不仅自身能代替合成色素使用，也可与其它品系的红、黄色素调和使用，可调配成绿、紫、棕色等一系列蓝绿变化的色调。栀子蓝色素自面世以来，由于来源自然，安全、无毒，人体相容性好，理化性能优良，染色效果显著，使其在食品、医药等诸多领域得到了广泛的应用，国内外市场需求日益增加，然而，传统的制备方法都是从栀子果中提取，而栀子果含有大量的干扰物质，导致提取工艺复杂，物耗过大、收得率低,同时原料成本也很高，产品极其昂贵，从而限制了该类成分的大量应用和我国近年相关产业的发展。
发明内容
为了开发栀子蓝色素新资源，降低生产成本，本发明提供一种利用栀子叶制备栀子蓝色素的方法。
制备栀子蓝色素的工艺操作步骤如下：
（1）分别制备栀子叶固体培养基和栀子叶液体培养基；
（2）用黑曲霉制备活化原种、一级种子、二级种子，最后制得三级种子；
（3）将三级种子接种至栀子叶固体培养基或栀子叶液体培养基，发酵培养，得到固体发酵物或发酵液；
（4）将固体发酵物或发酵液酶解，得到栀子苷酶解液；
（5）在栀子苷酶解液中加入氨基酸，加热使栀子苷苷元与氨基酸缩合生成栀子蓝色素，用树脂柱进行色素纯化，最后得到蓝黑色粉末，即为栀子蓝色素，所述栀子蓝色素在590nm，1cm比色皿，1%浓度时的色价大于190。
一种栀子蓝色素的具体制备操作步骤如下：（栀子叶固体培养基）
（1）栀子叶固体培养基的制备
将新鲜的栀子叶洗涤，控干，粉碎，100~120℃灭菌20~120分钟，冷却既得固体培养基；或将含水率1~20%的栀子叶，粉碎，按料液比1Kg:0.2~0.6L加水，混合搅拌5~30分钟，温度100~120℃灭菌20~100分钟，冷却既得固体培养基；
（2）曲霉液体种子制备
将黑曲霉（Aspergillus niger）接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，温度25～35℃、培养4～7天，得到活化原种；
将活化原种接种到液体种子培养基，接种量为每200～1000mL培养基中接斜面菌种1支；温度25～35℃、转速150～250 rpm条件下，震荡培养3～7天，得到一级种子；
将一级菌种按体积比3～15%的接种量，扩大培养，温度25～35℃、通气量按体积比1:1～1.5、压力0.1～0.15MP条件下，培养3～7天得到二级种子；
将二级菌种按体积比3～15%的接种量，扩大培养，温度25～35℃、通气量按体积比1:1～1.5、压力0.1～0.15MP条件下，培养3～7天得到三级种子；
其中一级菌种、二级菌种和三级菌种的培养基均为液体种子培养基；
（3）接种发酵
将所述三级种子接种至栀子叶固体培养基中，接种量为每100Kg接种5~20L，温度25～35℃发酵培养2～7天，得到固体发酵物；
（4）栀子苷酶解
按料液比1Kg:0.5~5 L将固体发酵物加水打浆，温度50～70℃、酶解4～16小时，得到栀子苷酶解液；
（5）栀子蓝色素生成及纯化
在栀子苷酶解液中按每100L加入0.3~1.2Kg氨基酸，70～90℃保温3～10小时，粗滤或离心分离，对滤液或上清再进行微滤，接着将滤液泵入树脂柱中，吸附饱和，用20～100%乙醇洗脱或0.1～1mol/L的盐酸洗脱，收集蓝色洗脱液，脱去溶剂后得到蓝黑色粉末，即为栀子蓝色素，所述栀子蓝色素在590nm，1cm比色皿，1%浓度时的色价大于190。
一种栀子蓝色素的具体制备操作步骤如下：（栀子叶液体培养基）
（1）栀子叶液体培养基的制备
将新鲜的栀子叶按料液比1 Kg:0.5~3 L加水混合打浆，在100~120℃，灭菌20~100分钟，冷却既得液体培养基；或将含水率1~20%的栀子叶粉碎，按料液比1 Kg:1~6 L加水混合搅拌5~30分钟，温度100~120℃灭菌20~100分钟，冷却既得液体培养基；
（2）曲霉液体种子制备
将黑曲霉（Aspergillus niger）接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，温度25～35℃、培养4～7天，得到活化原种；
将活化原种接种到液体种子培养基，接种量为每200～1000mL培养基中接斜面菌种1支；温度25～35℃、转速150～250 rpm条件下，震荡培养3～7天，得到一级种子；
将一级菌种按体积比3～15%的接种量，扩大培养，温度25～35℃、通气量按体积比1:1～1.5、压力0.1～0.15MP条件下，培养3～7天得到二级种子；
将二级菌种按体积比3～15%的接种量，扩大培养，温度25～35℃、通气量按体积比1:1～1.5、压力0.1～0.15MP条件下，培养3～7天得到三级种子；
其中一级菌种、二级菌种和三级菌种的培养基均为液体种子培养基；
（3）接种发酵
将所述三级种子接种至栀子叶液体培养基中，接种量为每100Kg接种3~15L，温度25～35℃发酵培养2～7天，得到发酵液；
（4）栀子苷酶解
将发酵液升温至50～70℃、酶解4～16小时，得到栀子苷酶解液；
（5）栀子蓝色素生成及纯化
在栀子苷酶解液中按每100L加入0.3~1.2Kg氨基酸，70～90℃保温3～10小时，粗滤或离心分离，对滤液或上清再进行微滤，接着将滤液泵入树脂柱中，吸附饱和，用20～100%乙醇洗脱或0.1～1mol/L的盐酸洗脱，收集蓝色洗脱液，脱去溶剂后得到蓝黑色粉末，即为栀子蓝色素，所述栀子蓝色素在590nm，1cm比色皿，1%浓度时的色价大于190。
上述两种制备操作的步骤（1）中所述栀子叶粉过10-100目筛。
上述两种制备操作的步骤（2）中所述液体种子培养基，每升培养基由蛋白胨或酵母提取物5～30g、淀粉或蔗糖10～50g、硝酸钾或磷酸二氢钾1～3g、磷酸氢二钾1～3 g、硫酸镁1～3 g，加水定溶到1L制成。
上述两种制备操作的步骤（5）中所述粗滤为过20~60目筛；所述离心分离为转速2000~10000转/分钟、分离5~20分钟；微滤的微滤膜截留分子量为5000；所述氨基酸为谷氨酸钠。
本发明在前期研究中发现栀子植物的叶子中同果一样含有栀子苷等环烯醚萜类成分，并且含量与栀子果相近，并且同时叶中干扰物质较少，因此以栀子树叶制备栀子蓝色素更易分离纯化。本发明前期研究发现栀子苷水解后也可与氨基酸反应制得栀子蓝色素，更主要的是栀子叶的产量远远大于果的产量。
本发明的有益技术效果体现在下述几个方面：
1.本发明利用栀子叶生产栀子蓝色素，较传统的以栀子果为原料的生产方法，可极大地降低生产成本。传统的以果为原料加工时，果的成本目前每千克为25元左右，而叶的成本仅0.5元左右，因此本发明的原料成本仅是传统的1/50。
2.由于栀子叶的组成较栀子果简单，特别是没有栀子黄色素的干扰，因此其栀子蓝色素纯化工艺大大简化。
3.由于栀子叶来源丰富，一亩栀子产鲜果100～400千克，而可产鲜叶2000～10000千克，还可利用修剪下的废叶，可全年供货，从而可使栀子蓝色素可长年生产，大大提高设备利用率和***周期，降低生产风险，产生巨大经济效益。
4.因此按本发明工艺方法生产的产品成本低，工艺简便、工艺稳定、生产设备投资可大可小，生产灵活，适合多种规模的企业投资。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
以下实施例所用原料的来源：
黑曲霉（Aspergillus niger）：菌种来源于安徽农业大学微生物防治重点实验室
萨氏（SDAY）斜面培养基：青岛拓普生物工程有限公司生产。
蛋白胨或酵母提取物：蛋白胨和酵母提取物为微生物培养中常用试剂，购于广州市华粤行仪器有限生产。
淀粉：上海哈灵生物科技公司生产；
蔗糖：广西贵糖（集团）股份有限公司生产。
硝酸钾或磷酸二氢钾：为常见试剂，国药集团化学试剂有限公司生产。
磷酸氢二钾：为常见试剂，国药集团化学试剂有限公司生产。
硫酸镁：为常见试剂，国药集团化学试剂有限公司生产。
谷氨酸钠：即味精，上海味美思食品有限公司生产。
实施例1：
从栀子叶中制备栀子蓝色素的具体操作步骤如下：
1. 栀子叶培养基的制备
将200 Kg新鲜的山栀子（Gardenia jasminoides Ellis）树叶洗净，控干，粉碎过10目筛，100℃灭菌100分钟，冷却备用，共制得栀子叶固体培养基200 Kg。
．曲霉液体种子制备
（1）将黑曲霉（Aspergillus niger）接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于25℃恒温、培养4天，得到活化原种；
（2）将活化原种接种到液体种子培养基
每升液体种子培养基由蛋白胨5g、淀粉10g、磷酸二氢钾1 g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁1 g，加水定溶到1L制成。
三角瓶中装入20%容积量的液体种子培养基，接入活化原种，接种量为每200mL液体种子培养基中接斜面菌种1支；在全温振荡培养箱中温度25℃、转速150 rpm条件下震荡培养3天，得到一级种子，共制备200mL一级种子；
（3）在5L的液体发酵罐中裝入3L液体种子培养基，接入90mL一级种子，接种量为3L液体种子培养基体积的3%；温度25℃、通气量按体积比1:1（v/v）、压力0.1MP条件下，培养3天，得到3L二级种子；
（4）在50L的液体发酵罐中装入30L液体种子培养基，接入0.9L二级种子，接种量为30L液体种子培养基体积的3%；温度25℃、通气量按体积比1:1（v/v）、压力0.1MP条件下，培养3天，得到30.9L三级种子。
．接种发酵
在200Kg栀子叶固体培养基中接种10.0L三级种子（接种量为每100Kg接种5L菌种），温度25℃条件下液固双向发酵培养2天，得到200Kg固体培养物。
栀子苷酶解
在200Kg固体培养物中加水100L（料液比1Kg:0.5 L）混合打浆，温度50℃条件下酶解4小时，得到栀子苷酶解液300千克；
5.栀子蓝色素生成及纯化
在300Kg栀子苷酶解液中加入0.9Kg谷氨酸钠（谷氨酸钠0.3%），温度70℃保温3小时，然后过20目筛网粗滤，再进行微滤（膜截留分子量为5000），接着将滤液泵入树脂柱中，吸附饱和后用20%乙醇（v/v）洗脱，收集蓝色洗脱液，脱去溶剂后得到1262g蓝黑色粉末，此即栀子蓝色素，其色价=195(E1%1cm 590nm)，即在590nm，1cm比色皿，1%浓度时的色价为195。
实施例2：
从栀子叶中制备栀子蓝色素的具体操作步骤如下：
1. 栀子叶培养基的制备
将200千克含水率20%的干燥水栀子（Gardenia jasminoides var. radicans Makino）树叶，粉碎过100目筛，按料液比1Kg:0.2L加水混合搅拌5分钟，在120℃，灭菌20分钟，冷却得栀子叶固体培养基240千克；
2．曲霉液体种子制备
（1）将黑曲霉（Aspergillus niger）接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于35℃恒温、培养7天，得到活化原种；
（2）将活化原种接种到液体种子培养基
每升液体种子培养基由酵母提取物30g、蔗糖50g、磷酸二氢钾3 g、磷酸氢二钾3g、硫酸镁3 g，加水定溶到1L制得；
三角瓶中装入40%容积量的液体种子培养基，接入活化原种，接种量为每1000mL液体种子培养基中接斜面菌种1支；在全温振荡培养箱中于35℃、250 rpm震荡培养7天，得到一级种子；共制备2000mL一级种子；
（3）在20L的液体发酵罐中裝入15L液体种子培养基，接入1800mL一级种子，接种量为15L液体种子培养基体积的15%；温度35℃、通气量按体积比1:1.5（v/v）、压力0.15MP，培养7天，得到16.8L二级种子；
（4） 在100L的液体发酵罐中装入70L液体种子培养基，接入10.5L二级种子，接种量为70L液体种子培养基体积的15%；温度25℃、通气量按体积比1:1.5（v/v）、压力0.15MP，培养7天，得到80.5L三级种子；
3．接种发酵
在240Kg栀子叶固体培养基中接种48L三级种子（接种量为每100Kg接种20L菌种），温度35℃条件下液固双向发酵培养7天，得到240Kg固体培养物；
4.栀子苷酶解
在240Kg固体培养物中加水1200L（料液比1:5）混合打浆，温度70℃条件下酶解16小时，得到栀子苷酶解液1440Kg；
5.栀子蓝色素生成及纯化
在1440Kg L栀子苷酶解液中加入17.28Kg谷氨酸钠（谷氨酸钠1.2%），于90℃保温10小时，然后过60目筛网粗滤，再进行微滤（膜截留分子量为5000），接着将滤液泵入树脂柱中，吸附饱和后用100%乙醇（v/v）洗脱，收集蓝色组分，脱去溶剂后得到1450g蓝黑色粉末，此即栀子蓝色素，其色价=194 (E1%1cm 590nm)。
实施例3：
从栀子叶中制备栀子蓝色素的具体操作步骤如下：
1．栀子叶培养基的制备
将200千克新鲜山栀子（Gardenia jasminoides Ellis）栀子叶，粉碎过50目筛，按料液比1Kg:0.5L加水混合搅拌30分钟，在110℃，灭菌50分钟，冷却得栀子叶液体培养基300千克；
2．曲霉液体种子制备
（1）将黑曲霉（Aspergillus niger）接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于30℃恒温、培养5天，得到活化原种；
（2）将活化原种接种到液体培养基
每升液体种子培养基由酵母提取物15g、蔗糖25g、磷酸二氢钾2 g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁2 g，加水定溶到1L制得。
三角瓶中装入30%容积量的液体种子培养基，接入活化原种，接种量为每500mL液体种子培养基中接斜面菌种1支；在全温振荡培养箱中于30℃、200 rpm震荡培养5天，得到一级种子；共制备1000mL一级种子；
（3）在5L的液体发酵罐中裝入3L液体种子培养基，接入300mL一级种子，接种量为3L液体种子培养基体积的10%；温度30℃、通气量按体积比1:1.2（v/v）、压力0.12MP，培养5天，得到3.3L二级种子；
（4）在20L的液体发酵罐中装入12L液体种子培养基，接入1.2L二级种子，接种量为12L液体种子培养基体积的10%；温度30℃、通气量按体积比1:1.2（v/v）、压力0.12MP，培养5天，得到13.2L三级种子；
3．接种发酵
在300Kg栀子叶液体培养基中接种9L三级种子（接种量为每100Kg接种3L菌种），温度25℃条件下液体发酵2天，得到309Kg发酵液；
4．栀子苷酶解
将309Kg发酵液直接升温到50℃，保持4小时即得到栀子苷酶解液309Kg；
5．栀子蓝色素生成及纯化
在309Kg栀子苷酶解液中加入1.854Kg谷氨酸钠（谷氨酸钠0.6%），于80℃保温7小时，然后过40目筛网粗滤，再进行微滤（膜截留分子量为5000），接着将滤液泵入树脂柱中，吸附饱和后用60%乙醇（v/v）洗脱，收集蓝色组分，脱去溶剂后得到1480g蓝黑色粉末，此即栀子蓝色素，其色价=197 (E1%1cm 590nm)。
实施例4：
从栀子叶中制备栀子蓝色素的具体操作步骤如下：
1．栀子叶培养基的制备
将200千克含水率1%的干燥小叶栀子（Gardenia angkorensis）树叶，粉碎过40目筛，按料液比1Kg:6L加水混合搅拌20分钟，在120℃，灭菌20分钟，冷却得栀子叶液体培养基1400 Kg；
2．曲霉液体种子制备
（1）将黑曲霉（Aspergillus niger）接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于28℃恒温、培养5天，得到活化原种；
（2）将活化原种接种到液体培养基
每升液体种子培养基由酵母提取物20g、蔗糖20g、磷酸二氢钾1.5g、磷酸氢二钾1.5g、硫酸镁1.5g和水1 L制成；
三角瓶中装入25%容积量的液体种子培养基，接入活化原种，接种量为每500mL液体种子培养基中接斜面菌种1支；在全温振荡培养箱中于28℃、180 rpm震荡培养5天，得到一级种子；共制备1000mL一级种子；
（3）在20L的液体发酵罐中裝入15L液体种子培养基，接入900mL一级种子，接种量为15L液体种子培养基体积的6%；温度28℃、通气量按体积比1:1.1（v/v）、压力0.11MP，培养5天，得到15.9L二级种子；
（4）在300L的液体发酵罐中装入250L液体种子培养基，接入15L二级种子，接种量为250L液体种子培养基体积的6%；温度28℃、通气量按体积比1:1.1（v/v）、压力0.11MP，培养5天，得到265L三级种子；
3．接种发酵
在1400Kg栀子叶液体培养基中接种210L三级种子（接种量为每100Kg接种15L菌种），温度35℃条件下液体发酵7天，得到1610Kg发酵液；
4．栀子苷酶解
将1610Kg发酵液直接升温到70℃，保持16小时即得到栀子苷酶解液1610Kg；
5．栀子蓝色素生成及纯化
在1610Kg栀子苷酶解液中加入8.05Kg谷氨酸钠（谷氨酸钠0.5%），于75℃保温6小时，然后过50目筛网粗滤，再进行微滤（膜截留分子量为5000），接着将滤液泵入树脂柱中，吸附饱和后用50%乙醇（v/v）洗脱，收集蓝色组分，脱去溶剂后得到2660g蓝黑色粉末，此即栀子蓝色素，其色价=196 (E1%1cm 590nm)。
实施例5：
从栀子叶中制备栀子蓝色素的具体操作步骤如下：
1．栀子叶培养基的制备
将200千克含水率10%的干燥小叶栀子（Gardenia angkorensis）树叶，粉碎过30目筛，按料液比1Kg:3L加水混合搅拌15分钟，在120℃，灭菌20分钟，冷却得栀子叶液体培养基800 Kg；
2．曲霉液体种子制备
（1）将黑曲霉（Aspergillus niger）接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，于31℃恒温、培养4天，得到活化原种；
（2）将活化原种接种到液体培养基
每升液体种子培养基由酵母提取物20g、蔗糖20g、磷酸二氢钾2 g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁2g，加水定溶到1L制得；
三角瓶中装入30%容积量的液体种子培养基，接入活化原种，接种量为每500mL液体种子培养基中接斜面菌种1支；在全温振荡培养箱中于31℃、180 rpm震荡培养4天，得到一级种子；共制备1000mL一级种子；
（3）在10L的液体发酵罐中裝入7L液体种子培养基，接入700mL一级种子，接种量为7L液体种子培养基体积的10%；温度28℃、通气量按体积比1:1.1（v/v）、压力0.11MP，培养5天，得到7.7L二级种子；
（4）在100L的液体发酵罐中装入70L液体种子培养基，接入7L二级种子，接种量为70L液体种子培养基体积的10%；温度28℃、通气量按体积比1:1.1（v/v）、压力0.11MP，培养5天，得到77L三级种子；
3．接种发酵
在800Kg栀子叶液体培养基中接种64L三级种子（接种量为每100Kg接种8L菌种），温度31℃条件下液体发酵5天，得到864Kg发酵液；
4．栀子苷酶解
将864Kg发酵液直接升温到60℃，保持10小时即得到栀子苷酶解液864Kg；
5．栀子蓝色素生成及纯化
在864Kg栀子苷酶解液中加入5.184Kg谷氨酸钠（谷氨酸钠0.6%），于75℃保温6小时，然后过40目筛网粗滤，再进行微滤（膜截留分子量为5000），接着将滤液泵入树脂柱中，吸附饱和后用60%乙醇（v/v）洗脱，收集蓝色组分，脱去溶剂后得到2370g蓝黑色粉末，此即栀子蓝色素，其色价=198 (E1%1cm 590nm)。
Claims (5)
1.栀子蓝色素的制备方法，其特征在于工艺操作步骤如下：
（1）栀子叶固体培养基的制备
将新鲜的栀子叶洗涤，控干，粉碎，100~120℃灭菌20~120分钟，冷却既得固体培养基；或将含水率1~20%的栀子叶，粉碎，按料液比1Kg:0.2~0.6L加水，混合搅拌5~30分钟，温度100~120℃灭菌20~100分钟，冷却既得固体培养基；
（2）用黑曲霉制备活化原种、一级种子、二级种子，最后制得三级种子；
将黑曲霉（Aspergillus niger）接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，温度25～35℃、培养4～7天，得到活化原种；
将活化原种接种到液体种子培养基，接种量为每200～1000mL培养基中接斜面菌种1支；温度25～35℃、转速150～250 rpm条件下，震荡培养3～7天，得到一级种子；
将一级菌种按体积比3～15%的接种量，扩大培养，温度25～35℃、通气量按体积比1:1～1.5、压力0.1～0.15MP条件下，培养3～7天得到二级种子；
将二级菌种按体积比3～15%的接种量，扩大培养，温度25～35℃、通气量按体积比1:1～1.5、压力0.1～0.15MP条件下，培养3～7天得到三级种子；
其中一级菌种、二级菌种和三级菌种的培养基均为液体种子培养基；
（3）接种发酵
将所述三级种子接种至栀子叶固体培养基中，接种量为每100Kg接种5~20L，温度25～35℃发酵培养2～7天，得到固体发酵物；
（4）栀子苷酶解
按料液比1Kg:0.5~5 L将固体发酵物加水打浆，温度50～70℃、酶解4～16小时，得到栀子苷酶解液；
（5）栀子蓝色素生成及纯化
在栀子苷酶解液中按每100L加入0.3~1.2Kg氨基酸，70～90℃保温3～10小时，粗滤或离心分离，对滤液或上清再进行微滤，接着将滤液泵入树脂柱中，吸附饱和，用20～100%乙醇洗脱或0.1～1mol/L的盐酸洗脱，收集蓝色洗脱液，脱去溶剂后得到蓝黑色粉末，即为栀子蓝色素，所述栀子蓝色素在590nm，1cm比色皿，1%浓度时的色价大于190。
2.栀子蓝色素的制备方法，其特征在于具体制备操作步骤如下：
（1）栀子叶液体培养基的制备
将新鲜的栀子叶按料液比1 Kg:0.5~3 L加水混合打浆，在100~120℃，灭菌20~100分钟，冷却既得液体培养基；或将含水率1~20%的栀子叶粉碎，按料液比1 Kg:1~6 L加水混合搅拌5~30分钟，温度100~120℃灭菌20~100分钟，冷却既得液体培养基；
（2）曲霉液体种子制备
将黑曲霉（Aspergillus niger）接种于萨氏（SDAY）斜面培养基，温度25～35℃、培养4～7天，得到活化原种；
将活化原种接种到液体种子培养基，接种量为每200～1000mL培养基中接斜面菌种1支；温度25～35℃、转速150～250 rpm条件下，震荡培养3～7天，得到一级种子；
将一级菌种按体积比3～15%的接种量，扩大培养，温度25～35℃、通气量按体积比1:1～1.5、压力0.1～0.15MP条件下，培养3～7天得到二级种子；
将二级菌种按体积比3～15%的接种量，扩大培养，温度25～35℃、通气量按体积比1:1～1.5、压力0.1～0.15MP条件下，培养3～7天得到三级种子；
其中一级菌种、二级菌种和三级菌种的培养基均为液体种子培养基；
（3）接种发酵
将所述三级种子接种至栀子叶液体培养基中，接种量为每100Kg接种3~15L，温度25～35℃发酵培养2～7天，得到发酵液；
（4）栀子苷酶解
将发酵液升温至50～70℃、酶解4～16小时，得到栀子苷酶解液；
（5）栀子蓝色素生成及纯化
在栀子苷酶解液中按每100L加入0.3~1.2Kg氨基酸，70～90℃保温3～10小时，粗滤或离心分离，对滤液或上清再进行微滤，接着将滤液泵入树脂柱中，吸附饱和，用20～100%乙醇洗脱或0.1～1mol/L的盐酸洗脱，收集蓝色洗脱液，脱去溶剂后得到蓝黑色粉末，即为栀子蓝色素，所述栀子蓝色素在590nm，1cm比色皿，1%浓度时的色价大于190。
3.根据权利要求1或2所述的栀子蓝色素的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述栀子叶粉过10-100目筛。
4.根据权利要求1或2所述的栀子蓝色素的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述液体种子培养基，每升培养基由蛋白胨或酵母提取物5～30g、淀粉或蔗糖10～5 0g、硝酸钾或磷酸二氢钾1～3g、磷酸氢二钾1～3 g、硫酸镁1～3 g，加水定溶到1L制成。
5.根据权利要求1或2所述的栀子蓝色素的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述粗滤为过20~60目筛；所述离心分离为转速2000~10000转/分钟、分离5~20分钟；微滤的微滤膜截留分子量为5000；所述氨基酸为谷氨酸钠。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |