CN104745634B - 提高利用昆虫杆状病毒表达***表达外源蛋白效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高利用昆虫杆状病毒表达***表达外源蛋白效率的方法，其包括：在培养基中培养基质细胞；在基质细胞的培养过程中对基质细胞进行热击；接种杆状病毒；以及，收获细胞悬液及提取表达的外源蛋白。利用本发明的方法，可以使昆虫杆状病毒表达***高效表达外源蛋白，特别是，较之现有技术，外源蛋白的表达量可以提高7.6倍上，可以极大扩展该表达***于大规模工业化生产疫苗等生物制品中的应用。

Description

提高利用昆虫杆状病毒表达***表达外源蛋白效率的方法

技术领域

本发明涉及一种利用昆虫杆状病毒表达***表达外源蛋白的方法，特别涉及一种提高利用昆虫杆状病毒表达***表达外源蛋白的方法，属于外源蛋白表达制备技术领域。

背景技术

近20年来昆虫细胞-杆状病毒表达***(BEVS)被成功应用于表达了很多外源蛋白。目前有三个相对比较好的细胞系具有良好的性质，适用于AcMNPB和BmNPV重组蛋白表达的研究和生产，其包括：来源于秋粘虫卵巢组织的IPLB-SF21AE(Sf21)细胞系及其衍生株Sf9，来自甘蓝尺镬的BTI TN5B1-4(High Five)细胞系，以及来源于家蚕卵巢的BmN及其亚系。其中Sf9是其中应用比较广泛的细胞株，现在有很多产品都应用昆虫杆状病毒表达外源蛋白，尤其是VLP作为疫苗。

昆虫细胞属于半贴壁细胞，可以使用含有10％的胎牛血清(FBS)培养，也可以进行无血清贴壁培养，为了更加适应大规模生产，现在一般均进行无血清悬浮培养，现有的利用BEVS***表达蛋白制备疫苗均采用悬浮培养的方式进行。因此在整个工艺过程中，细胞系的倍增时间、细胞密度、细胞对病毒敏感性和细胞表达外源基因的能力成为主要的考虑因素。

目前国内外已经利用昆虫-杆状病毒表达***已经成功开发上市了多种疫苗产品，包括人用上市疫苗、兽用上市疫苗等。将目标基因经过优化，然后通过分子生物学手段，构建获得充足杆状病毒，再通过杆状病毒感染昆虫细胞，经过获得目标蛋白，再经过各种纯化手段获得符合要求的目标产物，是目前利用昆虫-杆状病毒***开发疫苗产品的基本思路。一方面昆虫细胞生产的蛋白质较原核和低等真核表达***更容易糖基化，是蛋白质更加接近天然活性状态，另一方面利用杆状病毒表达病毒蛋白较293细胞和CHO细胞表达***更具有优势。因为以上优势，有多种利用该表达***生产的疫苗处于临床期或者研发期。

目前，使用昆虫杆状病毒表达***进行蛋白表达，虽然已经实现了1000L的生产规模，但是在昆虫细胞杆状病毒表达***使用过程中存在一个重要的影响因素——“细胞密度效应”，即在接种杆状病毒时，细胞密度应低于3×10⁶cells/ml，更为有效的是应低于2×10⁶cell/ml，高于该细胞密度接种病毒外源蛋白表达量不会提高甚至会下降。尽管有报道称，使用灌注培养工艺，可以提高接种病毒时的细胞密度，外源蛋白表达量也会提高，但昆虫细胞耗氧量极高，使用灌注培养现有的生物反应器难以维持。而且目前该***蛋白表达量仅在15mg/L左右，对产品后期的纯化带来了比较大的挑战。同时，昆虫细胞在一般商业化无血清培养基中的批培养最大细胞密度可以达到1×10⁷cells/ml，在某些特殊的无血清培养基中批培养可以达到2.3×10⁷cells/ml，但是仅在低密度时接种病毒，会造成培养基的严重浪费。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种提高利用昆虫杆状病毒表达***表达外源蛋白效率的方法，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

一种提高利用昆虫杆状病毒表达***表达外源蛋白效率的方法，包括：

(1)在培养基中培养基质细胞；

(2)在基质细胞的培养过程中对基质细胞进行热击；

(3)接种杆状病毒；

(4)收获细胞悬液及提取表达的外源蛋白。

在一较为优选的实施方案之中，步骤(1)包括：以Sf9细胞作为基质细胞进行培养。

进一步的，步骤(1)中基质细胞的培养条件包括：温度为25～28℃，搅拌转速为20～60rpm，溶氧为30～60％，pH值为6.0～6.4。

在一较为优选的实施方案之中，该方法包括：在培养基中接种基质细胞至细胞密度为0.5×10⁶～1.5×10⁶个/ml后进行培养，且在接种杆状病毒前，培养基中的基质细胞总量达到6×10⁶～1×10⁷个/ml。

在一较为优选的实施方案之中，步骤(2)包括：在接种基质细胞后60～72h，将培养温度上升1～5℃，并维持1～8小时，之后将温度恢复至正常培养温度。

进一步的，所述培养基优选为昆虫细胞无血清培养基。

在一较为优选的实施方案之中，步骤(3)包括：按照MOI＝5～15接种杆状病毒。

在一较为优选的实施方案之中，所述杆状病毒优选为含有PCV-2病毒壳蛋白基因的重组杆状病毒。

在一较为优选的实施方案之中，该方法包括：采用补料分批培养方式培养基质细胞。

在一较为优选的实施方案之中，该方法还包括：在接种杆状病毒后，间歇补加营养物质，所述营养物质包括葡萄糖、谷氨酰胺、蛋白胨、酵母提取物中的任一种或两种以上的组合。

相对于现有的昆虫细胞杆状病毒表达***来说，本发明方法中利用无血清培养基培养昆虫细胞，例如Sf9昆虫细胞，并且不因为“细胞密度效应”而在细胞生长到1.5～3×10⁶个/ml时接种杆状病毒启动外源基因表达。造成“细胞密度效应”的本质是当细胞达到某个细胞密度后，这个时期S期细胞占得的比例及总量最多，当细胞密度继续升高，S期细胞比例和数量都下降很快，所以即使提高接种病毒时候的细胞密度并相应增加病毒接种量也不能提高甚至是降低外源基因的表达量。当细胞增长至需要的密度，对细胞进行一定时间的热击，之后恢复正常培养温度，细胞中S期细胞比例显著增加。S期细胞增加为病毒侵染提供了良好的条件。可以实现病毒在高细胞密度下的侵染。故在本发明中采用高细胞密度接种病毒，例如在0.6～1×10⁷个/ml进行接毒，接种细胞密度较原来提高了3～6倍。同时通过热击效应提高了细胞中S期细胞比例，使得单细胞产量提高，在提高接种细胞密度和单细胞产量增加双重作用下，可以显著提高接种病毒后外源蛋白的表达量。

又及，传统工艺中，接种病毒后一般采用分批培养的方式，不进行任何补充营养物质的操作。但是在本发明中，接种病毒后进行分批补料培养，对其进行营养物质补充，保证表达外源蛋白时细胞所需营养物质充足。

总之，与现有技术相比，藉由本发明的方法中，可以显著提高接种病毒时细胞密度，进而大幅提高了单位体积内外源蛋白的表达量，特别是，较之现有的接种病毒工艺，外源蛋白表达量可以提高7.6倍以上，可以极大扩展该表达***于大规模工业化生产疫苗等生物制品中的应用。

附图说明

图1是为本发明一实施例中利用热击提高生物反应器领用昆虫杆状病毒表达***表达外源蛋白的工艺流程图；

图2是在使用热击(实施例1)和未使用热击(对照例1)的条件下，生物反应器中细胞的生长曲线图；

图3是本发明一实施方案之中一种试剂盒标准品的检测标准曲线。

具体实施方式

针对现有技术中在利用昆虫杆状病毒表达***进行蛋白表达时所存在的蛋白表达量低，培养基浪费严重等不足，本案发明人在长期研究和大量实践中，非常意外的发现，采用热击法能够令人惊喜的大幅提高昆虫杆状病毒表达***的表达效率。基于此发现，本案发明人得以提出本发明的技术方案，如下进行具体解释说明。

在本发明的一实施方案之中，提供了一种提高利用昆虫杆状病毒表达***表达外源蛋白效率的方法，其包括以下步骤：

1)应用搅拌式生物反应器培养基质细胞；

2)培养过程中对细胞进行热击；

3)接种重组杆状病毒；

4)收获细胞悬液，检测目的蛋白含量。

优选的，步骤1)中所用的基质细胞系为Sf9细胞。

优选的，步骤3)中采用的杆状病毒为含有外源蛋白表达基因的重组杆状病毒。

本发明采用的生物反应器可以带有斜三叶桨或称为elephant ear桨；或者，所用的生物反应器为一次性搅拌式生物反应器。

优选的，步骤1)中所述的生物反应器培养细胞工艺包含放大工艺，单级培养中所用种子细胞为摇瓶悬浮培养细胞，放大培养所用种子细胞为生物反应器***培养所获细胞。单级培养为14L生物反应器单级培养模式，放大培养为14L到42L放大模式。具体放大方法为将摇瓶中培养的细胞，稀释后转移到生物反应器中培养，达到一定密度后继续稀释，导入新的更大体积的生物反应器中继续培养，依次方法放到所需要的规模。

优选的，步骤1)所述的生物反应器培养基质细胞方式为补料分批培养方式。

优选的，步骤1)中所述的生物反应器培养细胞条件为：温度25～28℃，搅拌转速为20～60rpm，溶氧(DO)为30～60％，pH值为6.0～6.4。

优选的，步骤1)中所述的生物反应器培养细胞所用的培养基为昆虫细胞无血清培养基(例如，倍进SF20112-4)。

在一个具体的实施方式中，本发明中接种细胞密度为0.5～1.5×10⁶个/ml，接种前的细胞总量达到0.6～0.9×10⁷cells/ml。

本发明的生物反应器培养模式为补料分批培养方式。

在生物反应器培养基质细胞的过程中，对细胞进行热击，是指：在接种后60～72小时，将培养温度上升1～5℃，并维持1～8小时，之后将温度恢复正常。

生物反应器表达外源蛋白按照适当比例接种重组杆状病毒，接种病毒的比例一般为MOI＝5～15。MOI即病毒感染附属(Multiplicity Of Infection)的英文缩写，直观来讲就是总病毒数与总细胞数的比值，通过取样计数接种病毒前细胞浓度来确定接种病毒量。

本发明中，进一步优选的技术方案是，步骤3)所述的病毒培养工艺为补料培养工艺，即，在接种病毒后，间歇补加营养物质，如葡萄糖、谷氨酰胺、蛋白胨、酵母提取物等任一或其组合。

其中，细胞悬液的收获可以采用分批收获方式。

优选的，步骤4)检测外源蛋白中将收获的细胞悬液进行超声破碎，将悬浮物进行离心，去除碎片，取上清，例如可使用PCV2-Cap蛋白定量检测试剂盒(货号：P1001)检测收获液中目的产物的浓度(检测曲线可参阅图3)。

以下将结合典型实施例对本发明的技术方案进行更为清楚、完整的描述。但本发明的实施方案并不局限于此。

实施例1：本实施例采用的反应器为赛多利斯搅拌式14L反应器和42L反应器，为斜三叶桨，采用的基质细胞为Sf9细胞，培养基为SF-SFM(苏州市沃美生物技术有限公司)，而采用的含有外源基因的重组杆状病毒为带有PCV-2壳蛋白的重组杆状病毒(上海米迪生物技术有限公司)。其工艺流程包括：

(1)摇瓶及生物反应器的准备

将摇瓶彻底清洗，锡箔纸分别包扎摇瓶，进行高压灭菌，121℃，30min，自然冷却至室温，转移至烘箱中烘干备用。

将生物反应器罐体进行彻底清洗，将pH进行标定后及DO电极安装到罐体上，包扎管道接口并进行验漏实验。完成后生物反应器进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件为121℃，30min。将无菌过滤好的细胞生长培养基无菌连接到反应器上，通过蠕动泵导入罐体，培养基的最少加入量以浸没电极探头为标准，并打开反应器温度、搅拌及通气控制进行培养基的平衡和预热，并对DO电极进行校正，过夜待用。

(2)生物反应器制备基质细胞

具体步骤为，将摇瓶中培养的细胞导入生物反应器中，并补充新鲜培养基，使得生物反应器中细胞悬液的密度为1×10⁶个/ml，设定生物反应器培养工艺条件为：温度为27℃，搅拌转速为60rpm，DO 40％，pH 6.3。每天取样计数细胞密度，当细胞密度达到3×10⁶个/ml，将培养物转移到42L反应器中，并补充培养基，使得细胞密度为1×10⁶个/ml，设定培养条件为27℃，搅拌转速为35rpm，DO 40％，pH 6.3。细胞生长周期一般为72小时。

(3)进行热击

细胞取样后，计数细胞密度。在培养72h后，细胞密度达到8×10⁶cells/ml，升高培养温度至29.5℃，并维持8小时，之后恢复培养温度至27℃。

(4)接种病毒

按照MOI＝1接种含有外源基因的重组杆状病毒。

(5)继续培养72h，收获细胞悬液。

(6)将收获的细胞悬液进行三次反复冻融，使用ELISA检测外源蛋白浓度为494mg/L。

对照例1：该对照例采用的反应设备及原料与实施例相同，其工艺流程包括：

1)摇瓶及生物反应器的准备

将摇瓶彻底清洗，锡箔纸分别包扎摇瓶，进行高压灭菌，121℃，30min，自然冷却至室温，转移至烘箱中烘干备用。

将生物反应器罐体进行彻底清洗，将pH电极进行标定后及DO电极安装到罐体上，包扎管道接口并进行验漏实验。完成后生物反应器进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件为121℃，30min。将无菌过滤好的细胞生长培养基无菌连接到反应器上，通过蠕动泵导入罐体，培养基的最少加入量以浸没电极探头为标准，并打开反应器温度、搅拌及通气控制进行培养基的平衡和预热，对DO进行校正，过夜待用。

2)生物反应器制备基质细胞

具体步骤为，将摇瓶中培养的细胞导入生物反应器中，并补充新鲜培养基，使得生物反应器中细胞悬液的密度为1×10⁶个/ml，设定生物反应器培养工艺条件为：温度为27℃，搅拌转速为60rpm，DO 40％，pH 6.3。每天取样计数细胞密度，当细胞密度达到3×10⁶个/ml，将培养物转移到42L反应器中，并补充培养基，使得细胞密度为0.8×10⁶个/ml，设定培养条件为27℃，搅拌转速为35rpm，DO 40％，pH 6.3。细胞生长周期一般为12小时。

3)接种病毒

细胞取样后，计数细胞密度。在培养12h后，细胞密度达到1.5×10⁶cells/ml，按照MOI＝1接种含有外源基因的重组杆状病毒。

5)继续培养72h，收获细胞悬液。

6)将收获的细胞悬液进行三次反复冻融，使用ELISA检测外源蛋白浓度为65mg/L。

实施例2

本实施例采用的反应器为赛多利斯搅拌式14L反应器和42L反应器，为斜三叶桨，采用的基质细胞为Sf9细胞，培养基为SF-SFM(苏州市沃美生物技术有限公司)，而采用的含有外源基因的重组杆状病毒为含有GFP外源基因的重组杆状病毒(上海米迪生物技术有限公司)。其工艺流程包括：

(1)摇瓶及生物反应器的准备

将摇瓶彻底清洗，锡箔纸分别包扎摇瓶，进行高压灭菌，121℃，30min，自然冷却至室温，转移至烘箱中烘干备用。

将生物反应器罐体进行彻底清洗，将pH及DO电极进行标定后安装到罐体上，包扎管道接口并进行验漏实验。完成后生物反应器进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件为121℃，30min。将无菌过滤好的细胞生长培养基无菌连接到反应器上，通过蠕动泵导入罐体，培养基的最少加入量以浸没电极探头为标准，并打开反应器温度、搅拌及通气控制进行培养基的平衡和预热，过夜待用。

(2)生物反应器制备基质细胞

具体步骤为，将摇瓶中培养的细胞导入生物反应器中，并补充新鲜培养基，使得生物反应器中细胞悬液的密度为1×10⁶个/ml，设定生物反应器培养工艺条件为：温度为27℃，搅拌转速为60rpm，DO 40％，pH 6.3。每天取样计数细胞密度，当细胞密度达到3×10⁶个/ml，将培养物转移到42L反应器中，并补充培养基，使得细胞密度为1×10⁶个/ml，设定培养条件为27℃，搅拌转速为35rpm，DO 40％，pH 6.3。细胞生长周期一般为72小时。

(3)进行热击

细胞取样后，计数细胞密度。在培养72h后，细胞密度达到8×10⁶cells/ml，升高培养温度至29.5℃，并维持8小时，之后恢复培养温度至27℃。

(4)接种病毒

按照MOI＝1接种含有外源基因的重组杆状病毒。

(5)继续培养72h，收获细胞悬液，计数活细胞密度为7.3×10⁶个/ml，3000rpm，离心5min。

(6)使用冷PBS重选细胞沉淀，3000rpm，离心5min，重复3次，将细胞密度稀释至1×10⁶个/ml制备细胞细胞悬液。

对照例2：

该对照例采用的反应设备及原料与实施例相同，其工艺流程包括：

1)摇瓶及生物反应器的准备

将摇瓶彻底清洗，锡箔纸分别包扎摇瓶，进行高压灭菌，121℃，30min，自然冷却至室温，转移至烘箱中烘干备用。

将生物反应器罐体进行彻底清洗，将pH及DO电极进行标定后安装到罐体上，包扎管道接口并进行验漏实验。完成后生物反应器进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件为121℃，30min。将无菌过滤好的细胞生长培养基无菌连接到反应器上，通过蠕动泵导入罐体，培养基的最少加入量以浸没电极探头为标准，并打开反应器温度、搅拌及通气控制进行培养基的平衡和预热，过夜待用。

2)生物反应器制备基质细胞

具体步骤为，将摇瓶中培养的细胞导入生物反应器中，并补充新鲜培养基，使得生物反应器中细胞悬液的密度为1×10⁶个/ml，设定生物反应器培养工艺条件为：温度为27℃，搅拌转速为60rpm，DO 40％，pH 6.3。每天取样计数细胞密度，当细胞密度达到3×10⁶个/ml，将培养物转移到42L反应器中，并补充培养基，使得细胞密度为0.8×10⁶个/ml，设定培养条件为27℃，搅拌转速为35rpm，DO 40％，pH 6.3。细胞生长周期一般为12小时。

3)接种病毒

细胞取样后，计数细胞密度。在培养12h后，细胞密度达到1.5×10⁶cells/ml，按照MOI＝1接种含有GFP基因的重组杆状病毒。

5)继续培养72h，收获细胞悬液，计数活细胞密度为1.2×10⁶个/ml

6)使用冷PBS重选细胞沉淀，3000rpm，离心5min，重复3次，将细胞密度稀释至1×10⁶个/ml制备细胞细胞悬液。

检测实施例2和对照例2中的荧光蛋白强度：在黑色96孔板中，按照以下顺序加入样品：

样品1：使用冷PBS制备的Sf9(接种不含有外源基因的杆状病毒)细胞悬液，细胞密度为1×10⁶个/ml

样品2：实施例2中用PBS制备的Sf9(接种含有GFP基因的杆状病毒)细胞悬液，细胞密度为1×10⁶个/ml。

样品3：对照例2中用PBS制备的Sf9(接种含有GFP基因的杆状病毒)细胞悬液，细胞密度为1×10⁶个/ml。

使用Biotek H1荧光酶标仪，设定激发光485nm，发射光535nm进行荧光检测。检测结果如下表所示：

	样品1	样品2	样品3	PBS
					A	16	38654	59328	15
B	19	39700	62723	16
					C	15	40103	60209	15
D	17	40059	63800	13
					E	17	41216	63360	19
F	15	41747	64043	16
					G	17	41989	63255	17
H	12	41520	63540	21
					平均值	14.33333	36110	55584.56	15.11111

从上述结果可以看出，实施例2中荧光值为(55584.56-15.11111)×7.3＝405657，对照例2中荧光值(36110-15.11111)×1.2＝43314，那么实施例2中是对照例2中荧光值的9.3倍。

另外，本案发明人还参照前述实施例及对照例的方法，利用昆虫杆状病毒表达***，以Sf9细胞作为基质细胞，分别接种带有猪细小病毒外壳蛋白基因的重组杆状病毒，带有猪瘟病毒壳蛋白基因的重组杆状病毒，进行了外源蛋白的表达，经测试表明，采用本发明的方法，平均可使外源蛋白的表达效率提高7.6倍上。

本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，应当理解，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。

Claims (4)

1.一种提高利用昆虫杆状病毒表达***表达外源蛋白效率的方法，其特征在于包括：

(1)在培养基中接种基质细胞至细胞密度为0.5×10⁶～1.5×10⁶个/ml后进行培养，相应的培养条件包括：温度为25～28℃，搅拌转速为20～60rpm，溶氧为30～60％，pH值为6.0～6.4，所述基质细胞为Sf9细胞，所述培养基为昆虫细胞无血清培养基，且在接种杆状病毒前，培养基中的基质细胞总量达到6×10⁶～1×10⁷个/ml；

(2)在基质细胞的培养过程中对基质细胞进行热击；

(3)接种杆状病毒，所述杆状病毒为包含外源蛋白基因的重组杆状病毒；

(4)收获细胞悬液及提取表达的外源蛋白；

其中，步骤(2)具体包括：在接种基质细胞后60～72h，将培养温度上升1～5℃，并维持1～8小时，之后将温度恢复至正常培养温度。

2.根据权利要求1所述的提高利用昆虫杆状病毒表达***表达外源蛋白效率的方法，其特征在于包括：按照MOI＝1接种杆状病毒。

3.根据权利要求1所述的提高利用昆虫杆状病毒表达***表达外源蛋白效率的方法，其特征在于包括：采用补料分批培养方式培养基质细胞。

4.根据权利要求1所述的提高利用昆虫杆状病毒表达***表达外源蛋白效率的方法，其特征在于包括：在接种杆状病毒后，间歇补加营养物质，所述营养物质选自葡萄糖、谷氨酰胺、蛋白胨、酵母提取物中的任一种或两种以上的组合。