CN104739955A

CN104739955A - 阳离子交换树脂法纯化雪上一枝蒿生物碱的制备方法

Info

Publication number: CN104739955A
Application number: CN201510058109.5A
Authority: CN
Inventors: 陈晓兰; 林亚平; 魏文珍
Original assignee: Guiyang College of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Guiyang College of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2015-02-04
Publication date: 2015-07-01

Abstract

本发明公开了阳离子交换树脂法纯化雪上一枝蒿生物碱的制备方法，用水煎煮法提取雪上一枝蒿药液，提取液浓缩至0.25g生药/ml，冷藏离心处理后取上清药液；阳离子交换树脂的预处理；采用预处理好的阳离子交换树脂对上清药液进行吸附纯化，并洗脱，得洗脱液，收集洗脱液干燥得干燥物；干燥物用乙醇回流除盐，回收乙醇后浓缩干燥得含有盐杂质的粗纯物；氯仿进一步除盐，蒸馏回收氯仿后浓缩液干燥得雪上一枝蒿纯化物。本发明的有益效果是制作雪上一枝蒿生物碱纯化物制作方法简单，成本低。

Description

阳离子交换树脂法纯化雪上一枝蒿生物碱的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及阳离子交换树脂法纯化雪上一枝蒿生物碱的制备方法。

背景技术

雪上一枝蒿来源于毛茛科植物短柄乌头(Aconitum brachypodum Diels)、铁棒锤(Aconitumpendulum Busch)及宣威乌头(Aconitum subrosullatum H-M.)的干燥块根。性温，味苦、辛，有大毒，归肝、肾经，具有祛风除湿、散瘀疗伤及活血止痛等功效，临床上用于治疗风寒湿痹所致的筋骨和关节疼痛、跌打损伤所致的瘀血疼痛及虫蛇咬伤等症。查阅文献发现，已有药理实验证明其具有显著的镇痛、抗炎作用，其有效成分为二萜类生物碱类物质。但目前市场上雪上一枝蒿生物碱提取物的供应短缺，唯有昆明市一家药业公司还在生产雪上一枝蒿生物碱，但其工艺较复杂、应用到大量的氯仿，该溶剂对操作人员、环境保护及产品安全方面有害。故需对雪上一枝蒿生物碱的纯化制备工艺进一步研究。

雪上一枝蒿生物碱常采用浸渍、煎煮、溶剂回流、渗漉等方法从药材中进行提取，经过溶剂提取后的生物碱溶液除生物碱及盐类之外还存在大量其他脂溶性或水溶性杂质,需要进一步纯化处理,将生物碱成分从中分离出来。其纯化处理方法通常使用的是有机溶剂萃取、色谱和树脂吸附等方法。树脂吸附是一种有效分离有效成分的方法。其特点是处理效率高、通量大，根据采用的树脂可分为大孔吸附树脂法和离子交换树脂法两种。

目前市面上现有的雪上一枝蒿生物碱纯化物价格高，制作成本高，制作方法复杂。本课题组曾用大孔吸附树脂对雪上一枝蒿药液进行纯化研究，结果发现，大孔吸附树脂的吸附量较少，且用水洗杂质时，生物碱成分泄漏量较大。故最后用阳离子交换树脂法对雪上一枝蒿药液进行纯化工艺考察，结果：雪上一枝蒿生物碱成分在阳离子交换树脂上吸附率较高，可达98％以上。对洗脱液进行考察，最终选择0.02g/ml NaCl-50％乙醇为洗脱液，洗脱率可达90％以上。洗脱液中残留的氯化钠杂质可用乙醇除掉大部分，再用少量氯仿进一步除杂，所得纯化物中总生物碱纯度达60％以上，其溶解性比购买的雪上一枝蒿生物碱的溶解性大大提高。

发明内容

本发明的目的在于提供阳离子交换树脂法纯化雪上一枝蒿生物碱的制备方法，解决了现有的雪上一枝蒿生物碱纯化物制作成本高，制作方法复杂的问题。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

步骤1：用水煎煮法提取雪上一枝蒿药液，提取液浓缩至0.25g生药/ml，冷藏离心处理后取上清药液；

步骤2：阳离子交换树脂的预处理；

步骤3：采用预处理好的阳离子交换树脂对上清药液进行吸附纯化，并洗脱，得洗脱液，收集洗脱液干燥得干燥物；

步骤4：干燥物用乙醇回流除盐，回收乙醇后浓缩干燥得含有盐杂质的粗纯物；

步骤5：氯仿进一步除盐，蒸馏回收氯仿后浓缩液干燥得雪上一枝蒿纯化物。

进一步，所述步骤1中水煎煮法提取雪上一枝蒿药液过程为：先将药材破碎，每次加12倍量的水煎煮提取1h，提取3次，每次滤过，合并3次提取液，用文火浓缩至0.25g生药/mL，至4℃冰箱冷藏后离心处理，取上清药液即得雪上一枝蒿药液。

进一步，所述步骤2中阳离子交换树脂的预处理：选用钠型732阳离子交换树脂，置于2～3倍树脂体积、10％的NaCl与水溶液中，浸泡2～4小时，去掉食盐水，用蒸馏水漂洗至接近无色；用2～3倍树脂体积的乙醇溶液浸泡2～4小时，用蒸馏水洗至无醇味；用2～3倍树脂体积的1mol·L^-1HCl与水溶液浸泡树脂2～4小时，去掉酸液，蒸馏水冲洗至接近中性；用2～3倍体积的1mol·L^-1NaOH与水溶液浸泡2～4小时，去掉碱液，用蒸馏水冲洗至接近中性；再用2～3倍1mol·L^-1HCl与水溶液浸泡2～4小时，使树脂转化为H⁺型，用蒸馏水冲洗至接近中性，备用。

进一步，所述步骤3中吸附纯化过程：选用15mm*200mm层析柱，阳离子交换树脂，0.25g生药/ml的药液上样4-6BV，以2ml/min流速上样，用蒸馏水按2ml/min流速水洗8-10BV。

进一步，所述步骤3中洗脱采用0.02g/ml NaCl-50％乙醇洗脱。

进一步，所述步骤3中洗脱液干燥处理：将收集的洗脱液用饱和氢氧化钠溶液调pH值为6～7，用旋转蒸发仪回收乙醇，温度为70℃，浓缩液置真空干燥箱中进一步干燥，得含有盐杂质的粗纯物。

进一步，所述步骤4中干燥物用乙醇回流除盐方法为干燥物用10倍量乙醇回流提取1次。

进一步，所述步骤5中氯仿进一步除盐过程为氯仿回流提取2次，第一次8倍量氯仿，第二次6倍量氯仿，每次1.5h。

本发明的有益效果是制作雪上一枝蒿生物碱纯化物制作方法简单，成本低。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明具体实施方案如下：

(1)雪上一枝蒿药液的制备：将药材破碎，采用水煎煮法进行提取，提取3次，每次加12倍量的水提取1h，滤过，合并3次提取液，文火浓缩至0.25g生药/mL，至4℃冰箱冷藏2天后离心处理，2400r/min转数离心30min，取上清药液即得。

(2)阳离子交换树脂的预处理：选用钠型732阳离子交换树脂，置于2～3倍树脂体积、10％的NaCl与水溶液中，浸泡2～4小时，去掉食盐水，用蒸馏水漂洗至接近无色，除去树脂中部分杂质和机械碎片；用2～3倍树脂体积的95％乙醇与水溶液浸泡2～4小时，洗去树脂内的醇溶性有机物，用蒸馏水洗至无醇味；用2～3倍树脂体积的1mol·L^-1HCl与水溶液浸泡树脂2～4小时，去掉酸液，蒸馏水冲洗至接近中性；然后用2～3倍体积的1mol·L^-1NaOH与水溶液浸泡2～4小时，去掉碱液，用蒸馏水冲洗至接近中性；再用2～3倍1mol·L^-1HCl与水溶液浸泡2～4小时，使树脂转化为H⁺型，用蒸馏水冲洗至接近中性，备用。

(3)阳离子交换树脂吸附纯化：选用15mm*200mm层析柱(直径15mm、高200mm，径高比为1:9(需24.5ml树脂，此处为湿法装柱，24.5ml为树脂的体积)，0.25g生药/ml的药液上样4-6BV，以2ml/min流速上样，用蒸馏水按2ml/min流速水洗8-10BV，以0.02g/ml氯化钠-50％乙醇为洗脱液，按0.5ml/min流速洗脱20BV，收集洗脱液。

放大工艺：各工艺参数按层析柱直径放大倍数放大。若选用层析柱直径比15mm*200mm的直径放大n倍，则其纯化工艺参数为：径高比为1:9确定阳离子交换树脂的用量，浓度为0.25g生药/ml的雪上一枝蒿药液上样4-6BV，以2nml/min流速上样，用蒸馏水按2n ml/min流速水洗8-10BV，以0.02g/ml氯化钠-50％乙醇以1.5n ml/min流速洗脱20BV，收集洗脱液。

(4)洗脱液干燥处理：将收集的洗脱液用饱和氢氧化钠溶液调pH值为6～7，用旋转蒸发仪回收乙醇(温度为70℃)，浓缩液用真空干燥箱进一步干燥，得含有盐杂质的干燥物。

(5)除盐处理：将干燥物用10倍质量乙醇回流提取1次，提取液中雪甲素提取率达92％以上。提取液用旋转蒸发仪回收乙醇浓缩干燥后用氯仿进一步除盐，氯仿回流提取2次，第一次8倍量氯仿，第二次6倍量氯仿，每次1.5h。过滤得氯仿液，蒸馏回收氯仿，浓缩液干燥得雪上一枝蒿生物碱纯化物。

所得雪上一枝蒿纯化物中总生物碱含量的测定：称取适量纯化物、雪上一枝蒿甲素对照品分别用pH＝3盐酸溶液溶解配置成一定浓度的溶液。其余照贵州省中药材、民族药材质量标准法测定其雪上一枝蒿总生物碱含量，以雪上一枝蒿甲素计为60％以上。

纯化物中雪上一枝蒿甲素含量的测定：称取适量纯化物、雪上一枝蒿甲素对照品分别用甲醇溶解配置成一定浓度的溶液。采用高效液相色谱(HPLC)法，按以下色谱条件：色谱柱：Kromasil-C18(150mm×4.6mm,5μm)；流动相：磷酸盐缓冲液(pH7.3)：乙腈(80:20)；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：199nm；柱温：30℃；进样量：10μL。测得纯化物中雪上一枝蒿甲素的含量为19％以上。

利用阳离子交换树脂法纯化制备雪上一枝蒿生物碱的方法研究，首先采用水煎煮法对雪上一枝蒿药材进行提取，提取液经过浓缩、冷藏离心处理后通过预处理好的阳离子交换树脂，树脂用蒸馏水洗后用0.02g/ml NaCl-50％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇减压干燥后用乙醇回流除去大量NaCl，乙醇提取液回收乙醇至干，干燥物再加少量氯仿回流进一步除去剩余杂质，提高纯化物的纯度，得到雪上一枝蒿生物碱纯化物。该方法工艺简单、成本低、大大减少氯仿有毒试剂的用量。所得雪上一枝蒿生物碱纯化物具有镇痛、抗炎的药理作用。

本发明的优点还在于：

(1)克服药厂使用的工艺技术复杂难题，减少有毒溶剂氯仿的使用量。利用成本较低的阳离子交换树脂对雪上一枝蒿药液进行纯化，药液在树脂上有很好的吸附作用，吸附率可达98％以上，用水洗脱杂质后，直接用0.02g/ml NaCl-50％乙醇为洗脱液对生物碱成分进行洗脱，洗脱率达90％以上。洗脱液干燥后用乙醇除掉大部分氯化钠杂质，再用少量氯仿进一步除杂，所得纯化物中总生物碱纯度达60％以上。

(2)本发明中雪上一枝蒿药液的制备采用水煎煮法提取，方法简便，节约成本。

(3)阳离子交换树脂价格便宜、预处理简便、可再生利用，是比较理想的树脂。阳离子交换树脂纯化雪上一枝蒿药液工艺操作简便且吸附率较高。

(4)洗脱溶液采用0.02g/mlNaCl-50％乙醇溶液，减少有机溶剂的用量，绿色环保，且洗脱效果好，洗脱率达90％以上。

(5)除盐过程先用乙醇除掉大部分盐，再用少量氯仿进一步除杂，与药厂现有工艺相比，大大减少氯仿有毒溶剂的用量。

(6)所得雪上一枝蒿生物碱纯化物与药厂中制备的相比，具有很好的溶解性能，解决药厂制备纯化物溶解困难、制剂载药量小的难题。

(7)药理实验证明雪上一枝蒿生物碱具有镇痛、抗炎的作用，可用于治疗关节疼痛、跌打损伤所致的瘀血疼痛及虫蛇咬伤等症，具有较好的药用价值。而目前市场上雪上一枝蒿生物碱的供应不足，本发明可解决雪上一枝蒿生物碱资源短缺的问题。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.阳离子交换树脂法纯化雪上一枝蒿生物碱的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行：

步骤2：阳离子交换树脂的预处理；

2.按照权利要求1所述阳离子交换树脂法纯化雪上一枝蒿生物碱的制备方法，其特征在于：所述步骤1中水煎煮法提取雪上一枝蒿药液过程为：先将药材破碎，每次加12倍量的水煎煮提取1h，提取3次，每次滤过，合并3次提取液，用文火浓缩至0.25g生药/mL，至4℃冰箱冷藏后离心处理，取上清药液即得雪上一枝蒿药液。

3.按照权利要求1所述阳离子交换树脂法纯化雪上一枝蒿生物碱的制备方法，其特征在于：所述步骤2中阳离子交换树脂的预处理：选用钠型732阳离子交换树脂，置于2～3倍树脂体积、10％的NaCl与水溶液中，浸泡2～4小时，去掉食盐水，用蒸馏水漂洗至接近无色；用2～3倍树脂体积的95％乙醇与水溶液浸泡2～4小时，用蒸馏水洗至无醇味；用2～3倍树脂体积的1mol·L^-1HCl与水溶液浸泡树脂2～4小时，去掉酸液，蒸馏水冲洗至接近中性；用2～3倍体积的1mol·L^-1NaOH与水溶液浸泡2～4小时，去掉碱液，用蒸馏水冲洗至接近中性；再用2～3倍1mol·L^-1HCl与水溶液浸泡2～4小时，使树脂转化为H⁺型，用蒸馏水冲洗至接近中性，备用。

4.按照权利要求1所述阳离子交换树脂法纯化雪上一枝蒿生物碱的制备方法，其特征在于：所述步骤3中吸附纯化过程：选用15mm*200mm层析柱，阳离子交换树脂，0.25g生药/ml的药液上样4-6BV，以2ml/min流速上样，用蒸馏水按2ml/min流速水洗8-10BV。

5.按照权利要求1所述阳离子交换树脂法纯化雪上一枝蒿生物碱的制备方法，其特征在于：所述步骤3中洗脱液采用0.02g/ml NaCl-50％乙醇。

6.按照权利要求1所述阳离子交换树脂法纯化雪上一枝蒿生物碱的制备方法，其特征在于：所述步骤3中洗脱液干燥处理：将收集的洗脱液用饱和氢氧化钠溶液调pH值为6～7，用旋转蒸发仪回收乙醇，温度为70℃，浓缩液用真空干燥箱进一步干燥，得含有盐杂质的粗纯物。

7.按照权利要求1所述阳离子交换树脂法纯化雪上一枝蒿生物碱的制备方法，其特征在于：所述步骤4中干燥物用乙醇回流除盐方法为干燥物用10倍量乙醇回流提取1次。

8.按照权利要求1所述阳离子交换树脂法纯化雪上一枝蒿生物碱的制备方法，其特征在于：所述步骤5中氯仿进一步除盐过程为氯仿回流提取2次，第一次8倍量氯仿，第二次6倍量氯仿，每次1.5h。