CN104737905B

CN104737905B - 一种牛大力组织培养生根的方法

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Publication number: CN104737905B
Application number: CN201510094777.3A
Authority: CN
Inventors: 涂湘炎
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-02-14
Filing date: 2015-02-14
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2035-02-14
Also published as: CN104737905A

Abstract

本发明涉及农业种植技术领域，尤其是涉及一种牛大力组织培养生根的方法，该方法由四个阶段完成，第一阶段为牛大力种子萌发；第二阶段为种苗增殖；第三阶段为壮苗；第四阶段为生根，主要包括如下步骤：(a)将成熟牛大力种子经过消毒处理，(b)将牛大力种子苗接入增殖培养基中培养，(c)将增殖好的无菌苗转入壮苗培养基中培养，(d)将高度为3～5cm的健壮无菌苗接入添加浓度为0.2～2.5mg·L^‑1硝酸钇的MS基本培养基中制成生根培养基。本发明的组织培养生根的方法中使用稀土元素钇(硝酸钇),既能避免组培苗愈伤组织的形成也能有效的促进牛大力组培苗的生根，这样不仅有效促进牛大力生根的生根率并且大大的降低生产成本。

Description

一种牛大力组织培养生根的方法

技术领域

本发明涉及农业种植技术领域，尤其是涉及一种牛大力组织培养生根的方法。

背景技术

牛大力植物学名为美丽崖豆藤(M illettia speciosaCham p.),是一种分布于热带和亚热带地区的野生名贵药材，主治肺热、肺虚咳嗽、肺结核、风湿性关节炎、腰肌劳损、慢性支气管炎、慢性肝炎、白带等。俗称山莲藕(广东、广西)、血藤、九龙串珠、甜牛大力、牛古大力(广西)、大力薯(广东)等，牛大力性味甘、平,具有补虚润肺、强筋活络的功用,临床证明其对腰肌劳损、风湿性关节炎、肺结核、慢性支气管炎等慢性疾病有一定疗效。早在20世纪70年代，牛大力作为壮腰健肾丸、强力健身胶囊的原料已用于中成药生产。目前，关于牛大力的化学成分、生物活性分析及组织培养已有报道，由于市场上销售的牛大力原料主要依靠采挖其野生资源，导致该药用植物资源日趋枯竭。

牛大力主要分布于福建，湖南，广东，广西，海南，贵州等地，由于分布的局限性和过度的采挖，牛大力野生自然资源已面临枯竭，采用植物组织培养快繁技术，有助解决这个问题，目前以成熟的种子和茎段为外植体进行组织培养快速繁殖牛大力以见有报道，但是不管是采用瓶外生根或者瓶内生根的方法，仍然存在生根率低的问题。

发明内容

本发明针对目前牛大力组培过程中生根困难的问题提供一种更加有效、快捷、低成本的生根方法，该方法可有效提高生根率，减少组织培养过程中资源的浪费和时间的消耗，为大规模的组培生产提供有利条件，本发明采用的技术方案如下：

一种牛大力组织培养生根的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(a)种子萌发：将成熟牛大力种子经过消毒处理，播入MS基本培养基中培养30～35天，将种子萌发成小苗，种子萌发培养条件为：培养温度为23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为8～12h/d；

(b)种苗繁殖：将牛大力种子苗接入增殖培养基中培养30～35天成小苗,增殖培养基为MS基本培养基+1.0～2.5mg·L^-1KT+0.1～1mg·L^-1NAA，小苗在增殖培养基中增殖高度达到1～2cm并有1～2片叶芽即可；种苗增殖培养条件为：培养温度为23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为8～12h/d；

(c)壮苗：将增殖好的无菌苗转入壮苗培养基中培养30～35天，壮苗培养基为MS基本培养基+1.0～2.0mg·L^-16-BA+0.1～1mg·L^-1NAA，无菌苗在壮苗培养基中培养高度达到3～5cm即可，壮苗培养条件为：培养温度为23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为8～12h/d；

(d)生根：将高度为3～5cm的健壮无菌苗接入生根培养基中，生根培养基为MS基本培养基+0.2～2.5mg·L^-1硝酸钇,生根培养的时间为15～35天，生根培养的根长为2～5cm的健壮根，生根培养条件为，培养温度为23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为8～12h/d。

优选地，所述MS基本培养基的pH值为5.6～5.8。

优选地，所述增殖培养基的pH值为5.6～5.8。

优选地，所述壮苗培养基的pH值为5.6～5.8。

优选地，所述生根培养基的pH值为5.6～5.8。

优选地，所述生根培养基中硝酸钇的浓度为0.7～1.5mg·L^-1。

本发明进一步优选地，所述培养基均含有25g/L蔗糖和6g/L琼脂。

综上所述，本发明具有如下显著的优势：

(1)牛大力组织培养过程中培养基的配制非常重要,培养基不但要求在无菌条件下,最重要的是要给牛大力的生长提供所需的及适宜的生长环境，选择合适的温度与光照进行培育对于牛大力的生根繁殖具有促进作用。

(2)本发明牛大力组织培养生根的方法中使用稀土元素钇(硝酸钇),既能避免组培苗愈伤组织的形成也能有效的促进牛大力组培苗的生根，这样不仅有效促进牛大力生根的生根率并且大大的降低生产成本。

(3)本发明的组织培养生根方法，工艺简单，生根操作容易，实用性强，对于快速繁殖培养牛大力，有效的解决了牛大力生根困难问题，为实现规模化生产及种植资源保护提供了条件，还在农业繁殖中进行大量推广。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详述。

一种牛大力组织培养生根的方法，该方法由四个阶段完成：第一阶段为牛大力种子萌发；第二阶段为种苗增殖；第三阶段为壮苗；第四阶段为生根。这四个阶段所用的培养基依次为：MS基本培养基、MS基本培养基+KT(1.0～2.5)+NAA(0.1～1.0)、MS基本培养基+6-BA(1.0～2.0)+NAA(0.1～1.0)、MS基本培养基+硝酸钇Y(NO₃)₃(0.2～2.5)。

所述四个阶段采用的培养条件：培养温度为23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为12h/d。

(a)将成熟牛大力种子经过消毒处理，播入MS基本培养基中培养30～35天种子萌发成小苗，种子萌发培养条件为：培养温度为23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为8～12h/d；所述MS基本培养基的pH值为5.6～5.8；

(b)将牛大力种子苗接入增殖培养基中培养30～35天成小苗,增殖培养基为MS基本培养基+1.0～2.5mg·L^-1KT+0.1～1mg·L^-1NAA，小苗在增殖培养基中增殖高度达到1～2cm并有1～2片叶芽即可；种苗增殖培养条件为：培养温度为23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为8～12h/d；所述增殖培养基的pH值为5.6～5.8；

(c)将增殖好的无菌苗转入壮苗培养基中培养30～35天，壮苗培养基为MS基本培养基+1.0～2.0mg·L^-16-BA+0.1～1mg·L^-1NAA，无菌苗在壮苗培养基中培养高度达到3～5cm即可，壮苗培养条件为：培养温度为23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为8～12h/d；所述壮苗培养基的pH值为5.6～5.8；

(d)将高度为3～5cm的健壮无菌苗接入生根培养基中，生根培养基为MS基本培养基+0.2～2.5mg·L^-1硝酸钇,生根培养的时间为15～35天，生根培养的根长为2～5cm的健壮根，生根培养条件为，培养温度为23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为8～12h/d；所述硝酸钇的MS培养基的pH值为5.6～5.8。

作为本发明的最佳实施例，所述MS基本培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基均含有25g/L蔗糖和6g/L琼脂。

实施例1

将高度为3～5cm的健壮无菌苗接入生根培养基中，生根培养基为MS基本培养基+0.2mg·L^-1硝酸钇,生根培养的时间为15～35天，生根培养的根长为2～5cm的健壮根，生根培养条件为，培养温度为23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间8～12h/d；在本实施例中的牛大力组织培养生根的生根率在40％以上。

实施例2

将高度为3～5cm的健壮无菌苗接入生根培养基中，生根培养基为MS基本培养基+0.7mg·L^-1硝酸钇,生根培养的时间为15～35天，生根培养的根长为2～5cm的健壮根，生根培养条件为，培养温度为23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为8～12h/d；在本实施例中的牛大力组织培养生根的生根率在92％以上。

实施例3

将高度3～5cm的健壮无菌苗接入生根培养基中，生根培养基为MS基本培养基+1.0mg·L^-1硝酸钇,生根培养的时间为15～35天，生根培养的根长为2～5cm的健壮根，生根培养条件为，培养温度为23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为8～12h/d；在本实施例中的牛大力组织培养生根的生根率在97％以上。

实施例4

将高度为3～5cm的健壮无菌苗接入生根培养基中，生根培养基为MS基本培养基+1.5mg·L^-1硝酸钇,生根培养的时间为15～35天，生根培养的根长为2～5cm的健壮根，生根培养条件为，培养温度为23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为8～12h/d；在本实施例中的牛大力组织培养生根的生根率在94％以上。

实施例5

将高度为3～5cm的健壮无菌苗接入生根培养基中，生根培养基为MS基本培养基+2.5mg·L^-1硝酸钇,生根培养的时间为15～35天，生根培养的根长为2～5cm的健壮根，生根培养条件为，培养温度为23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为8～12h/d；在本实施例中的牛大力组织培养生根的生根率在30％以上。

实施例6

一种牛大力组织培养生根的方法，该方法由四个阶段完成：第一阶段为牛大力种子萌发；第二阶段为种苗增殖；第三阶段为壮苗；第四阶段为生根。具体培养方法采用步骤，包括如下步骤(a)至步骤(d)的方法对牛大力生根进行进行繁殖培养，其中步骤(d)中的硝酸钇(Y(NO₃)₃)浓度替换成生长调节剂，选取4种调节剂做处理，每一个处理接种10瓶，每瓶5株芽，培养条件：培养温度为23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为12h/d，试验结果如表1所示。

表1 不同生长调节剂对牛大力生根率的影响

编号	激素	接种株数(株)	生根株数(株)	生根率(％)
					A1	IAA(1.5-2.5mg/L)	50	1	2
A2	IBA(0.5-2.0mg/L)	50	3	6
					A3	一号生根粉(0.5-2.0mg/L)	50	5	10
A4	IAA2.5mg/L+IBA2.0mg/L	50	8	16

实施例7

一种牛大力组织培养生根的方法，该方法由四个阶段完成：第一阶段为牛大力种子萌发；第二阶段为种苗增殖；第三阶段为壮苗；第四阶段为生根。具体培养方法采用步骤，包括如下步骤(a)至步骤(d)的方法对牛大力生根进行繁殖培养，对不同硝酸钇浓度对牛大力生根培养的方法：

以MS为基培养基，添加不同浓度的硝酸钇Y(NO₃)₃其中硝酸钇的浓度选取0.2，0.7，1.0，1.5，2.0，2.5mg/L，做6个处理组，每一个处理组接种10瓶，每瓶5株芽，培养条件：培养温度23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为12h/d，不同硝酸钇浓度对牛大力生根率的影响，如表2所示。

表2 不同硝酸钇浓度对牛大力生根率的影响

由以上实施例可以得出：实施例6通过在培养基中添加生根类激素甚至生根粉牛大力生根率都很低，说明想通过添加激素或生根粉实现牛大力组培苗生根困难；实施例7中通过添加不同浓度硝酸钇极大的促进了牛大力组培苗的生根，有效的解决了牛大力生根困难问题，为实现规模化生产及种植资源保护提供了条件。

以上所述仅仅是本发明的优选实施方式，并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

Claims

1.一种牛大力组织培养生根的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(c)壮苗：将增殖好的无菌苗转入壮苗培养基中培养30～35天，壮苗培养基为MS基本培养基+1.0～2.0mg·L^-16-BA+0.1～1mg·L^-1NAA，无菌苗在壮苗培养基中培养高度达到3～5cm即可，壮苗培养条件为：培养温度23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为8～12h/d；

(d)生根：将高度为3～5cm的健壮无菌苗接入生根培养基中，生根培养基为MS基本培养基+0.2～2.5mg·L^-1硝酸钇,生根培养的时间为15～35天，生根培养的根长为2～5cm的健壮根，生根培养条件为，培养温度23～27℃，光照度为1500～2000lx，光照时间为8～12h/d。

2.根据权利要求1所述的一种牛大力组织培养生根的方法，其特征在于：所述MS基本培养基的pH值为5.6～5.8。

3.根据权利要求1所述的一种牛大力组织培养生根的方法，其特征在于：所述增殖培养基的pH值为5.6～5.8。

4.根据权利要求1所述的一种牛大力组织培养生根的方法，其特征在于：所述壮苗培养基的pH值为5.6～5.8。

5.根据权利要求1所述的一种牛大力组织培养生根的方法，其特征在于：所述生根培养基的pH值为5.6～5.8。

6.根据权利要求1或5所述的一种牛大力组织培养生根的方法，其特征在于：所述生根培养基中硝酸钇的浓度为0.7～1.5mg·L^-1。

7.根据权利要求1～5任意一项权利要求所述的一种牛大力组织培养生根的方法，其特征在于：所述培养基均含有25g/L蔗糖和6g/L琼脂。