CN104711215A - 一种苹果干细胞的培养方法及培养的苹果干细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物干细胞培养技术领域，尤其涉及一种苹果干细胞的培养方法及培养的苹果干细胞。该方法以苹果新生枝条为原料，经诱导形成愈伤组织后增殖培养并扩大培养获得苹果干细胞。本发明提供的方法制备苹果干细胞，周期较短，产率高。可在48天左右的时间内获得大量的苹果干细胞。本发明在培养苹果干细胞过程中使用的诱导培养基和增殖培养基中所包含的植物激素种类恰当、比例适宜，能够保证苹果枝条细胞快速的去分化，并大量的繁殖。该苹果干细胞可冻干后或经提取后用于食品、药品、保健品或化妆品的制备。本发明提供的苹果干细胞提取方法简单易行，提取效率较高，经提取制得的提取物中黄酮和多酚类物质含量丰富。
Description
技术领域
本发明涉及植物干细胞培养技术领域，尤其涉及一种苹果干细胞的培养方法及培养的苹果干细胞。
背景技术
植物干细胞(plant stem cell)是未分化的细胞，具有很强的自我更新和持续***能力。植物干细胞培养技术，是在传统组培技术的基础上，以植物干细胞为目标，诱导、分离和培养外植体，建立相应的干细胞培养体系植物干细胞培养技术，不仅丰富了植物培养技术，而且为天然产物的商业化生产，乃至植物生物技术的发展，提供了新的研究方向和契机。
根据目标干细胞的不同，目前较为成功的植物干细胞培养方法主要分为三种：木本植物维管束形成层分生(例如：红豆杉干细胞)、草本植物储藏根的维管形成层(例如：人参干细胞)、静止中心(例如：水稻干细胞、苹果果实干细胞)。
现有的苹果果实干细胞由瑞士米百乐生化公司以成熟的瑞士苹果Uttwiler果实为基础研制，并将其制成脂质体用于美容产品，能够具有延缓衰老和去皱的能力。因此，添加有苹果果实干细胞的美容产品十分畅销，往往面临供不应求的问题。这主要是因为苹果果实干细胞的产量较低。究其原因，一方面由于Uttwiler苹果品种种质过于稀少，原料的稀少造成苹果果实干细胞产量无法得到提高。另一方面，苹果果实细胞属于静止中心，已处于分化末端，将其去分化而获得干细胞的难度较高，不仅需要较强诱导条件以使苹果果实细胞去分化，在培养过程中往往需要更长的周期和更多的去分化培养次数，这是造成苹果果实干细胞产量得不到提高的根本原因。
并且，虽然将苹果果实干细胞制成脂质体能够使皮肤更容易吸收，以便将其做成美容产品。但脂质体的添加无疑会导致活性物质浓度的降低的提取，且脂质体的制备方法较为复杂，再次延长了干细胞的制备周期。并且，脂质体对胃肠道内环境大多十分敏感，将其用于口服容易导致活性物质的降解或生物利用度的降低。
因此，提供一种能够快速制备苹果干细胞的方法进而提供一种活性成分含量较高的且适合口服的苹果干细胞十分必要。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种制备苹果干细胞的方法，本发明提供的方法能够快速且大量的制备苹果干细胞，进而提供一种活性成分含量较高的且适合口服的苹果干细胞提取物。
本发明提供的培养苹果干细胞的方法，包括以下步骤：
步骤1：苹果新生枝条杀菌、去除木质部和髓后，接种于诱导培养基，诱导培养获得形成层细胞；
步骤2：形成层细胞经继代培养，接入增殖培养基，摇床培养获得单细胞；
步骤3：将单细胞接种于增殖培养基经扩大培养，获得苹果干细胞；
诱导培养基为含有NAA、BA和水解酪蛋白的MS固体培养基；
增殖培养基为含有2,4-D、BA、水解酪蛋白和活性炭的MS液体培养基。
本发明选择苹果新生枝条作为原料进行诱导制备苹果干细胞。苹果为蔷薇科苹果属植物，其枝条由叶芽发展而来，纵切面由外之内分别为表皮、皮质、韧皮部、形成层、木质部和髓。其中，形成层位于韧皮部与木质部之间，是一种分生组织，起源于未分化，但保持胚性的增生和分化能力的细胞。愈伤组织内也可形成形成层。相对于果实而言，枝条的细胞更为原始，而果实的细胞处于分化的末端。苹果新生枝条指形成时间在一年以内的枝条，而多数苹果品种的新梢在年周期中都有两次生长，分别为春梢或秋梢。本发明采用的苹果品种为富士苹果(Malus pumila Mil)，其在国内种植广泛，原料来源广泛。
在本发明的实施例中，杀菌包括以下步骤：
步骤1：将苹果新生枝条以水冲洗后，以浓度为10～1000mg/L的L-抗坏血酸溶液浸泡；
步骤2：以体积分数为60％～95％的乙醇水溶液浸泡后以无菌水冲洗；
步骤3：以体积分数为10％～100％的过氧化氢水溶液浸泡后以无菌水冲洗。
作为优选，苹果新生枝条的长度为10cm。
作为优选，L-抗坏血酸的浓度为120mg/L。
作为优选，步骤1中所述浸泡的时间为0.5min～10min。
优选的，步骤1中所述浸泡的时间为1min。
作为优选，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为75％。
作为优选，步骤2中所述浸泡的时间为0.1min～10min。
优选的，步骤2中所述浸泡的时间为1min。
作为优选，步骤2中无菌水的体积为2L。
作为优选，过氧化氢水溶液中过氧化氢的体积分数为30％。
作为优选，步骤3中所述浸泡的时间为1min～50min。
优选的，步骤3中所述浸泡的时间为20min。
作为优选，步骤3中所述冲洗的时间为1min～50min。
优选的，步骤3中所述冲洗的时间为10min。
以本发明提供的杀菌方法对苹果新生枝条进行杀菌能够充分的杀除苹果新生枝条上所携带的真菌、细菌或病毒。以便保证苹果新生枝条在培养过程中不被干扰，从而保证苹果新生枝条上的细胞更加快速的去分化。而实验表明，本发明提供的方法能够有效将苹果新生枝条细胞去分化，经诱导和扩大培养，48天左右即可获得大量的苹果干细胞。
本发明提供方法采用的诱导培养基为含有NAA、BA和水解酪蛋白的MS固体培养基。MS培养基是一种常用的植物培养基，可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养。NAA是萘乙酸的简称，是一种常见的植物生长素、能促进细胞的***与扩大。BA为苄氨基腺嘌呤的缩写，是一种细胞***素，6-BA比较常见。水解酪蛋白(CH)对细胞的增殖有明显的促进作用。本发明通过实验证明，植物激素的种类、用量和比例对苹果干细胞的去分化诱导起着至关重要的作用。当采用NAA、BA和水解酪蛋白对苹果枝条进行诱导时，能够快速的获得去分化的形成层细胞，将这些去分化的形成层细胞经扩增后即可获得大量的苹果干细胞。
在本发明实施例中，NAA、BA和水解酪蛋白的质量比为(0.1～10)：(0.1～10)：(0.1～10)。
在本发明实施例中，NAA、BA和水解酪蛋白的质量比为0.5：2：1。
作为优选，诱导培养基中NAA的浓度为0.1mg/L～10mg/L。
优选的，诱导培养基中NAA的浓度为0.5mg/L。
作为优选，诱导培养基中BA的浓度为0.1mg/L～10mg/L。
优选的，诱导培养基中BA的浓度为2.0mg/L。
作为优选，诱导培养基中水解酪蛋白的浓度为0.1mg/L～10mg/L。
优选的，诱导培养基中水解酪蛋白的浓度为1.0mg/L。
作为优选，诱导培养基为固体培养基，其中琼脂的质量分数为1％。
作为优选，诱导培养基的pH值为6.0。
在本发明的实施例中，步骤1中所述的接种为，每g去除木质部和髓的苹果新生枝条接种于10cm2的诱导培养基。
本发明实施例中，诱导培养为暗培养；温度为10℃～30℃；时间为1天～20天。
在一些实施例中，诱导培养为暗培养；温度为25℃；时间为10天。
经诱导培养后，形成层组织为均一生长的平板状组织，而其他组织则为不规则的聚集生长物。
本发明的实施例中，继代培养为暗培养；温度为10℃～30℃；时间为1天～20天。
在一些实施例中，继代培养为暗培养；温度为25℃；时间为10天。
在本发明的实施例中，继代培养采用遇到培养基，每1g形成层细胞接种于10cm2的诱导培养基。
经10天的继代培养，形成层细胞形成愈伤组织，每10cm2的诱导培养基上约有愈伤组织20.8g。
本发明提供的增殖培养基为含有2,4-D、BA、水解酪蛋白和活性炭的MS液体培养基。2,4-D即2，4-二氯苯氧乙酸，是一种植物生长素，对不同植物细胞而言，适宜浓度不同，适宜浓度下可促进植物细胞生长，而浓度不当会抑制植物细胞生长。活性炭可吸附植物的有害分泌物，避免这些分泌物抑制细胞的增殖，可降低培养基变色，促进细胞增殖。本发明通过实验证明，采用2,4-D、BA、水解酪蛋白和活性炭的MS液体培养基能够使苹果愈伤组织快速扩增。
在本发明的实施例中，增殖培养基中，2,4-D、BA、水解酪蛋白和活性炭的质量比为(0.1～10)：(0.1～10)：(0.1～10)：(0.1～10)。
一些实施例中，增殖培养基中，2,4-D、BA、水解酪蛋白和活性炭的质量比为2:1:1:1。
作为优选，增殖培养基中2,4-D的浓度为0.1mg/L～10mg/L。
优选的，增殖培养基中2,4-D的浓度为2.0mg/L。
作为优选，增殖培养基中BA的浓度为0.1mg/L～10mg/L。
优选的，增殖培养基中BA的浓度为1.0mg/L。
作为优选，增殖培养基中水解酪蛋白的浓度为0.1mg/L～10mg/L。
优选的，增殖培养基中水解酪蛋白的浓度为1.0mg/L。
作为优选，增殖培养基中活性炭的浓度为0.1mg/L～10mg/L。
优选的，增殖培养基中活性炭的浓度为1.0mg/L。
作为优选，增殖培养基的pH值为6.0。
在本发明的实施例中，每g愈伤组织接入20mL增殖培养基。
作为优选，摇床培养时，增殖培养基中还添加经灭菌的直径为0.5cm的玻璃珠。
优选的，玻璃珠的添加量为100g/L增殖培养基。
实施例中，培养采用三角瓶，1000mL三角瓶中加入200mL增殖培养基。
在本发明的实施例中，摇床培养的条件为每小时用20W的白炽灯照射10min。
在本发明的实施例中，摇床培养的温度为10℃～30℃；转速为10转/分钟～200转/分钟；时间为8天～17天。
在一些实施例中，摇床培养的温度为25℃；转速为120转/分钟；时间为14天。
作为优选，在摇床培养7天后加入新鲜的增殖培养基。
作为优选，加入新鲜的增殖培养基的体积为原增殖培养基的2倍。
添加新鲜的增殖培养基后，其中细胞的密度为1×105/ml。
采用本发明提供的方法进行摇床培养，愈伤组织成为单细胞悬液，细胞增殖速度较快，用100目的不锈钢筛网过滤，除去细胞团、玻璃珠和残渣，获得细胞密度约1×106/ml。
在一些实施例中，步骤3中接种的密度为0.1×103/ml～1×104/ml。
作为优选，步骤3中接种的密度为1×104/ml。
在本发明的实施例中，扩大培养具体为：于生物反应器中培养7天后添加增殖培养基至细胞浓度为1×105/ml，再培养1天～20天。
在一些实施例中，扩大培养具体为：于20L的生物反应器中添加5L增殖培养基，培养7天后添加增殖培养基至细胞浓度为1×106/ml，再培养7天。
采用本发明提供方法培养苹果干细胞，培养时间短，收率高。48天左右即可收获大量的干细胞。收获的干细胞呈黏胶状，可冻干后用于或经提取后用于食品、药品、保健品或化妆品的制备。
以本发明提供方法制备的苹果干细胞。
本发明还提供了苹果干细胞的诱导培养基，为含有NAA、BA和水解酪蛋白的MS固体培养基。
在本发明实施例中，NAA、BA和水解酪蛋白的质量比为(0.1～10)：(0.1～10)：(0.1～10)。
在本发明实施例中，NAA、BA和水解酪蛋白的质量比为0.5：2：1。
作为优选，诱导培养基中NAA的浓度为0.1mg/L～10mg/L。
优选的，诱导培养基中NAA的浓度为0.5mg/L。
作为优选，诱导培养基中BA的浓度为0.1mg/L～10mg/L。
优选的，诱导培养基中BA的浓度为2.0mg/L。
作为优选，诱导培养基中水解酪蛋白的浓度为0.1mg/L～10mg/L。
优选的，诱导培养基中水解酪蛋白的浓度为1.0mg/L。
作为优选，诱导培养基为固体培养基，其中琼脂的质量分数为1％。
作为优选，诱导培养基的pH值为6.0。
本发明还提供了苹果干细胞的增殖培养基，为含有2,4-D、BA、水解酪蛋白和活性炭的MS液体培养基。
在本发明的实施例中，增殖培养基中，2,4-D、BA、水解酪蛋白和活性炭的质量比为(0.1～10)：(0.1～10)：(0.1～10)：(0.1～10)。
一些实施例中，增殖培养基中，2,4-D、BA、水解酪蛋白和活性炭的质量比为2:1:1:1。
作为优选，增殖培养基中2,4-D的浓度为0.1mg/L～10mg/L。
优选的，增殖培养基中2,4-D的浓度为2.0mg/L。
作为优选，增殖培养基中BA的浓度为0.1mg/L～10mg/L。
优选的，增殖培养基中BA的浓度为1.0mg/L。
作为优选，增殖培养基中水解酪蛋白的浓度为0.1mg/L～10mg/L。
优选的，增殖培养基中水解酪蛋白的浓度为1.0mg/L。
作为优选，增殖培养基中活性炭的浓度为0.1mg/L～10mg/L。
优选的，增殖培养基中活性炭的浓度为1.0mg/L。
作为优选，增殖培养基的pH值为6.0。
本发明还提供了一种苹果干细胞冻干粉的制备方法，包括：将本发明提供方法制备的苹果干细胞反复冻融后冻干，获得苹果干细胞冻干粉。
本发明提供方法制备的苹果干细胞冻干粉。
本发明提供的苹果干细胞冻干粉在制备食品、药品、保健品或化妆品中的应用。
采用本发明提供的方法，制得的苹果干细胞冻干粉中，黄酮及多酚含量非常丰富，实验结果显示，每g苹果干细胞冻干粉中含有苹果黄酮18.9mg，多酚22.9mg。
本发明还提供了一种苹果干细胞的的提取方法，包括：将本发明提供方法制备的苹果干细胞反复冻融后经冻干、粉碎，以乙醇水溶液为提取液提取、强超声、浓缩、干燥、粉碎获得苹果干细胞提取物。
在本发明的实施例中，反复冻融具体为：将苹果干细胞于-30℃～-80℃预冻1小时～10小时后于液氮中速冻1小时～10小时；然后解冻1分钟～100分钟；反复1次～10次后室温放置1min～50min。
在一些实施例中，反复冻融具体为：将苹果干细胞于-30℃预冻3小时后于液氮中速冻2小时；然后解冻30分钟；反复2次后室温放置10min。
本发明所述室温为15℃～30℃。
在本发明的实施例中，粉碎为高速粉碎，粉碎至1～100目。
在一些实施例中，粉碎至60目。
在本发明的实施例中，提取液中乙醇的体积分数为50％～95％。
在一些实施例中，提取液中乙醇的体积分数为75％。
在本发明的实施例中，苹果干细胞与提取液的质量体积比为1:5。
在本发明的实施例中，提取的温度为10℃～30℃，搅拌提取10h～100h。
在本发明的实施例中，浓缩采用旋转蒸发。
在本发明的实施例中，干燥采用低温冷冻干燥。
在本发明的实施例中，粉碎至10目～200目。
在一些实施例中，粉碎至100目。
本发明提供方法制备的苹果干细胞提取物。
本发明提供的苹果干细胞提取物在制备食品、药品、保健品或化妆品中的应用。
采用本发明提供的方法，制得的苹果干细胞提取物中，黄酮及多酚含量非常丰富，实验结果显示，每g苹果干细胞提取物溶于1L蒸馏水中，苹果黄酮的浓度为18.2μg/ml，苹果多酚22.1μg/ml。
本发明提供了一种苹果干细胞的培养方法，该方法以苹果新生枝条为原料，经诱导形成愈伤组织后增殖培养并扩大培养获得苹果干细胞。本发明提供的方法制备苹果干细胞，周期较短，产率高。可在48天左右的时间内获得大量的苹果干细胞。本发明在培养苹果干细胞过程中使用的诱导培养基和增殖培养基中所包含的植物激素种类恰当、比例适宜，能够保证苹果枝条细胞快速的去分化，并大量的繁殖。该苹果干细胞可冻干后或经提取后用于食品、药品、保健品或化妆品的制备。本发明提供的苹果干细胞提取方法、冻干方法简单易行，提取效率较高，经提取制得的提取物中黄酮和多酚类物质含量丰富。
具体实施方式
本发明提供了一种苹果干细胞的培养方法及培养的苹果干细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
本发明实施例中采用的培养基分别为：
诱导培养基A：MS固体培养基+NAA 0.1mg/L+BA 0.1mg/L+CH 0.1mg/L，pH值为6.0；
诱导培养基B：MS固体培养基+NAA 10mg/L+BA 10mg/L+CH 10mg/L，pH值为6.0；
诱导培养基C：MS固体培养基+NAA0.5mg/L+BA 2mg/L+CH 1mg/L，pH值为6.0；
诱导培养基D：CaCl2332mg/L、KH2PO4170mg/L、KNO31900mg/L、MgSO4180.54mg/L、NH4NO31650mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、EDTA铁钠36.7mg/L、硼酸6.2mg/L、KI 83mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、ZnSO4·7SO48.6mg/L、肌醇100mg/L、烟酸5mg/L、甘氨酸2mg/L、维生素B6 0.5mg/L、维生素B1 0.5mg/L、叶酸0.5mg/L、生物素0.05mg/L、维生素C 50mg/L、硫脲25mg/L、L-天冬酰胺180mg/L、蔗糖30g/L、琼脂0.8％，pH5.6。
增殖培养基A：MS液体培养基+2,4-D 0.1mg/L+BA 0.1mg/L+CH0.1mg/L+AC 0.1mg/L，pH值为6.0；
增殖培养基B：MS液体培养基+2,4-D 10mg/L+BA 10mg/L+CH 10mg/L+AC 10mg/L，pH值为6.0；
增殖培养基C：MS液体培养基+2,4-D 2.0mg/L+BA 1.0mg/L+CH1.0mg/L+AC 1.0mg/L，pH值为6.0；
增殖培养基D：CaCl2332mg/L、KH2PO4170mg/L、KNO31900mg/L、MgSO4180.54mg/L、NH4NO31650mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、EDTA铁钠36.7mg/L、硼酸6.2mg/L、KI 83mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、ZnSO4·7SO48.6mg/L、肌醇100mg/L、烟酸5mg/L、甘氨酸2mg/L、维生素B6 0.5mg/L、维生素B1 0.5mg/L、叶酸0.5mg/L、生物素0.05mg/L、维生素C 50mg/L、硫脲25mg/L、L-天冬酰胺180mg/L、蔗糖30g/L，pH5.6。
实施例1苹果枝条的杀菌
选择无化肥农药污染、绿色种植的苹果树，按照一定的评判标准挑选10支10cm长新生枝条；用无菌水2L洗涤新生枝条表面附着物；将新生枝条放进120mg/L L-抗坏血酸中浸泡1分钟；将新生枝条放入75％的乙醇溶液中杀菌1分钟，用2L无菌水冲洗干净；再放入30％的过氧化氢溶液中杀菌20分钟，并用无菌水冲洗10分钟。
实施例2形成层组织的诱导
将实施例1灭菌的苹果新生枝条用接种刀剥离形成层、韧皮部、皮质和表皮等组织，丢弃木质部和髓；将获得的组织接种至新鲜的固体培养基中，以每1g组织接种10cm2固体培养基的密度进行接种，在受控的暗室内培养，培养后，形成层组织为均一生长的平板状组织，而其他组织则为不规则的聚集生长物，对获得的形成层组织称重。
表1培养条件
| 培养基 | 温度 | 时间 | 形成层组织重量 | |
| 实验组1 | 诱导培养基A | 10℃ | 20天 | 3.1±0.3 |
| 实验组2 | 诱导培养基B | 30℃ | 1天 | 1.3±0.1 |
| 实验组3 | 诱导培养基C | 25℃ | 10天 | 20.8±1.2 |
| 对照组 | 诱导培养基D | 25℃ | 21天 | 17.5±1.3 |
实施例3继代培养形成层组织
将再生的形成层组织与其他组织分离开；以每1g组织接种10cm2固体培养基的密度，将再生的形成层组织接种至新鲜的固体培养基中，暗室培养，分离愈伤组织、称重。
表2培养条件
| 培养基 | 温度 | 时间 | 愈伤组织重量 | |
| 实验组1 | 诱导培养基A | 10℃ | 20天 | 4.2±0.3 |
| 实验组2 | 诱导培养基B | 30℃ | 1天 | 1.4±0.2 |
| 实验组3 | 诱导培养基C | 25℃ | 10天 | 25.6±1.8 |
| 对照组 | 诱导培养基D | 25℃ | 21天 | 22.7±1.5 |
实施例4单细胞培养
在1000ml三角瓶中加入200ml液体培养基、灭菌处理的20g、直径0.5cm的玻璃珠；
将实施例2各组获得的愈伤组织10g分别转移到三角瓶中；
将三角瓶置于摇床上进行培养，其中：
实验组1～3每小时用20W的白炽灯照射10分钟；第7天，加入400ml新鲜的液体培养基至细胞密度为其中细胞的密度为1×105/ml，然后继续培养；具体如表3；培养后用100目的不锈钢筛网过滤，除去细胞团、玻璃珠和残渣，得到单细胞悬液，计算细胞密度。
表3培养条件
| 培养基 | 温度 | 继续培养时间 | 细胞密度 | |
| 实验组1 | 增殖培养基A | 10℃ | 10天 | 2.5±0.2×105/ml |
| 实验组2 | 增殖培养基B | 30℃ | 1天 | 1.1±0.1×105/ml |
| 实验组3 | 增殖培养基C | 25℃ | 7天 | 9.5±0.8×105/ml |
对照组于25℃、100rpm摇床，黑暗培养14天后，用100目的不锈钢筛网过滤，除去细胞团、玻璃珠和残渣，得到单细胞悬液，计算细胞密度为2.8×105/ml。
实施例5放大培养
按照将实施例4制得的单细胞悬液转移至20L生物反应器中进行大规模培养，生物反应器中容纳5L的增殖培养基。实验组1～3在生物反应器中培养第7天时，加入10L的新鲜液体培养基，继续培养后收获细胞。对照组培养在生物反应器中持续培养20天，中间不添加培养基。具体条件如表4。培养后收获细胞，称重。
表4培养条件
| 培养基 | 接种密度 | 温度 | 通气条件 | 继续培养时间 | 细胞重量 | |
| 实验组1 | 增殖培养基A | 1×103/ml | 10℃ | 0.1vvm | 20天 | 0.1g |
| 实验组2 | 增殖培养基B | 0.1×103/ml | 30℃ | 0.1vvm | 1天 | 0.01g |
| 实验组3 | 增殖培养基C | 1×104/ml | 25℃ | 0.1vvm | 7天 | 1.1g |
| 对照组 | 增殖培养基D | 1×104/ml | 25℃ | 0.1vvm | 21天 | 0.8g |
实施例6苹果干细胞冻干粉的制备
收集实施例5实验组3制得的苹果干细胞悬液用1um过滤器过滤，去掉培养基，收获截留的黏胶状细胞取出；
将细胞放入-30℃的冰箱内预冻3小时；
放入液氮罐中超低温速冻2小时；
取出解冻30分钟后，再放入-30℃冰箱内预冻和液氮罐内速冻，依次2遍；
将细胞取出，室温下维持10分钟，入低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥后，高速粉碎成60目冻干粉。
实施例7苹果干细胞冻干粉的制备
收集实施例5实验组2制得的苹果干细胞悬液用1um过滤器过滤，去掉培养基，收获截留的黏胶状细胞取出；
将细胞放入-50℃的冰箱内预冻10小时；
放入液氮罐中超低温速冻10小时；
取出解冻1分钟后，再放入-50℃冰箱内预冻和液氮罐内速冻，依次10遍；
将细胞取出，室温下维持50分钟，入低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥后，高速粉碎成10目冻干粉。
实施例8苹果干细胞的提取方法
收集实施例5实验组1制得的苹果干细胞悬液用1um过滤器过滤，去掉培养基，收获截留的黏胶状细胞取出；
将细胞放入-80℃的冰箱内预冻1小时；
放入液氮罐中超低温速冻2小时；
取出解冻100分钟后，再放入-80℃冰箱内预冻和液氮罐内速冻，依次1遍；
将细胞取出，室温下维持1分钟，入低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥后，高速粉碎成100目冻干粉；
实施例9苹果干细胞冻干粉的制备
收集实施例5对照组制得的苹果干细胞悬液用1um过滤器过滤，去掉培养基，收获截留的黏胶状细胞取出；
将细胞放入-30℃的冰箱内预冻3小时；
放入液氮罐中超低温速冻2小时；
取出解冻30分钟后，再放入-30℃冰箱内预冻和液氮罐内速冻，依次2遍；
将细胞取出，室温下维持10分钟，入低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥后，高速粉碎成60目冻干粉。
实施例10苹果干细胞冻干粉质量鉴定
苹果多酚是苹果中所含多元酚类物质的通称，苹果多酚具有很强的抗氧化性、清除体内自由基、预防高血压、抗肿瘤、抗衰老、抗突变、抗辐射、抗过敏、防龋齿、增强肌力等多种保健功能，常用于食品及保健品中。苹果中含有的黄酮类物质是一种高效抗氧化剂，它不但是最好的血管清理剂，而且是癌症的克星。因此，检测苹果干细胞中的多酚和黄酮含量从而鉴定苹果干细胞的品质。
将实施例6～9制备的苹果干细胞冻干粉，以75％乙醇提取3次，合并提取液经旋转蒸发、冷冻干燥后，以蒸馏水溶解后，以Folin-ciocalteu法测定多酚含量，以芦丁做标准曲线测定黄酮含量。
具体的：苹果多酚含量的测定采用Folin-ciocalteu方法，以没食子酸为标准品，准确吸取0.1mg/ml没食子酸标准品溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6ml，分别置于100ml容量瓶中，加50ml蒸馏水，再加5ml Folin-ciocalteu试剂，摇匀后再加入15ml 1mol/L Na2CO3溶液，于室温反应2h。同时配制空白溶液：在100ml容量瓶中加入5ml Folin-ciocalteu试剂，再加入15ml 1mol/LNa2CO3溶液，定容，室温反应2h。在760nm波长处测定对照品溶液的吸光度，测定的标准曲线回归方程为：A＝0.00049x-0.0131，R2＝0.9932
公式中x——对照品含量，ug
A——吸光度值。
将1g苹果干细胞粉用100ml蒸馏水溶解后，分别取2,4,6ml取代没食子酸对照品，按标准曲线制作法测定样品中的多酚含量。
黄酮类化合物与硝酸铝作用，生成黄酮的盐络离子，呈黄色，颜色的深浅与黄酮的含量成一定的比例关系。根据摩尔定律，利用分光光度计于510nm光波处进行比色定量测定，用芦丁作标准曲线，从而定量测定样品中黄酮含量。
将1g苹果干细胞粉用100ml蒸馏水溶解后，取1ml于50ml比色管，加入5％亚硝酸钠溶液0.75ml摇匀放5min，精确加入10％硝酸铝溶液0.75ml放置5min，再加入10ml 1mol/L NaOH，用水定容。用分光光度计在510nm处测吸光度，每样平行做2次求平均值。将测得的吸光度值代入到芦丁标准曲线方程中，便可求得其中黄酮含量。
检测结果如表5所示：
表5检测结果
| 黄酮含量(mg/g) | 多酚含量(mg/g) | |
| 实施例6 | 18.6 | 21.7 |
| 实施例7 | 17.5 | 21.1 |
| 实施例8 | 18.9 | 22.9 |
| 实施例9 | 7.5 | 10.8 |
结果表明，本发明制备的苹果干细胞中黄酮和多酚的含量都较高。
实施例11苹果干细胞的提取方法
收集实施例5实验组3制得的苹果干细胞悬液用1um过滤器过滤，去掉培养基，收获截留的黏胶状细胞取出；
将细胞放入-30℃的冰箱内预冻3小时；
放入液氮罐中超低温速冻2小时；
取出解冻30分钟后，再放入-30℃冰箱内预冻和液氮罐内速冻，依次2遍；
将细胞取出，室温下维持10分钟，入低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥后，高速粉碎成60目冻干粉；
放入3000ml 75％乙醇溶液中，间接加温26℃，并搅拌48小时；
放入超声波分离提取机内进行强超声粉碎细胞质，然后超声过滤，收集滤液；
用旋转式真空蒸发器26℃浓缩；
将浓缩物放入低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥；
高速粉碎100目，真空分装保存，制成苹果提取物。
实施例12苹果干细胞的提取方法
收集实施例5实验组2制得的苹果干细胞悬液用1um过滤器过滤，去掉培养基，收获截留的黏胶状细胞取出；
将细胞放入-80℃的冰箱内预冻1小时；
放入液氮罐中超低温速冻2小时；
取出解冻100分钟后，再放入-80℃冰箱内预冻和液氮罐内速冻，依次1遍；
将细胞取出，室温下维持1分钟，入低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥后，高速粉碎成10目冻干粉；
放入100ml 50％乙醇溶液中，间接加温10℃，并搅拌10小时；
放入超声波分离提取机内进行强超声粉碎细胞质，然后超声过滤，收集滤液；
用旋转式真空蒸发器26℃浓缩；
将浓缩物放入低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥；
高速粉碎10目，真空分装保存，制成苹果提取物。
实施例13苹果干细胞的提取方法
收集实施例5实验组1制得的苹果干细胞悬液用1um过滤器过滤，去掉培养基，收获截留的黏胶状细胞取出；
将细胞放入-50℃的冰箱内预冻10小时；
放入液氮罐中超低温速冻10小时；
取出解冻1分钟后，再放入-50℃冰箱内预冻和液氮罐内速冻，依次10遍；
将细胞取出，室温下维持50分钟，入低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥后，高速粉碎成100目冻干粉；
放入10000ml 95％乙醇溶液中，间接加温30℃，并搅拌100小时；
放入超声波分离提取机内进行强超声粉碎细胞质，然后超声过滤，收集滤液；
用旋转式真空蒸发器30℃浓缩；
将浓缩物放入低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥；
高速粉碎200目，真空分装保存，制成苹果提取物。
实施例14苹果干细胞冻干粉的制备
收集实施例5对照组制得的苹果干细胞悬液用1um过滤器过滤，去掉培养基，收获截留的黏胶状细胞取出；
将细胞放入-30℃的冰箱内预冻3小时；
放入液氮罐中超低温速冻2小时；
取出解冻30分钟后，再放入-30℃冰箱内预冻和液氮罐内速冻，依次2遍；
将细胞取出，室温下维持10分钟，入低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥后，高速粉碎成60目冻干粉；
放入3000ml 75％乙醇溶液中，间接加温26℃，并搅拌48小时；
放入超声波分离提取机内进行强超声粉碎细胞质，然后超声过滤，收集滤液；
用旋转式真空蒸发器26℃浓缩；
将浓缩物放入低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥；
高速粉碎100目，真空分装保存，制成苹果提取物。
实施例15苹果干细胞提取物的品质鉴定
以实施例10提供的方法检测实施例11～14制得的苹果干细胞提取物的质量。并将其与瑞士PhytoCelltec苹果干细胞冻干粉比较。瑞士PhytoCelltec苹果干细胞目前主要用于美容护肤品中，据称具有抗皱美容功效。选择瑞士苹果干细胞10％原液精华(30ml装)作为对照，比较其与本发明产品在苹果黄酮、苹果多酚等有效活性成分含量的差异。
将1g苹果提取物用1000ml蒸馏水溶解(浓度为0.1％)，取1ml，并取瑞士苹果干细胞10％原液精华1ml，分别用实施例6的方法测定苹果多酚、苹果黄酮物质的含量，结果显示(见表6)：
表6鉴定结果
| 黄酮含量(μg/ml) | 多酚含量(μg/ml) | |
| 实施例11 | 18.2 | 22.1 |
| 实施例12 | 17.9 | 21.7 |
| 实施例13 | 17.5 | 21.1 |
| 实施例14 | 18.6 | 22.9 |
| 瑞士苹果干细胞 | 0.9 | 1.2 |
本发明的0.1％浓度的产品，比瑞士苹果干细胞10％原液的产品，前者的苹果多酚、苹果黄酮的含量远高于后者。
实施例16苹果干细胞保健品
先将苹果干细胞冻干粉、低聚果糖进行粉碎、过筛，然后将已粉碎、过筛的物料与聚葡萄糖于混合机中混合均匀，用分装机进行分装，即制得具有改善胃肠道保健功能的苹果干细胞粉(粉剂)。
实施例17苹果干细胞保健品
先将苹果干细胞提取物、低聚果糖进行粉碎、过筛，然后将已粉碎、过筛的物料与聚葡萄糖于混合机中混合均匀，用分装机进行分装，即制得具有改善胃肠道保健功能的苹果干细胞粉(粉剂)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (13)
1.一种培养苹果干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：苹果新生枝条杀菌、去除木质部和髓后，接种于诱导培养基，诱导培养获得形成层细胞；
步骤2：所述形成层细胞经继代培养，接入增殖培养基，摇床培养获得单细胞；
步骤3：将所述单细胞接种于增殖培养基经扩大培养，获得苹果干细胞；
所述诱导培养基为含有NAA、BA和水解酪蛋白的MS固体培养基；
所述增殖培养基为含有2,4-D、BA、水解酪蛋白和活性炭的MS液体培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养为暗培养；温度为10℃～30℃；时间为1天～20天。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述继代培养为暗培养；温度为10℃～30℃；时间为1天～20天。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述摇床培养的温度为10℃～30℃；转速为10转/分钟～200转/分钟；时间为8天～17天；每小时光照10min。
5.如权利要求1～4任一项所述方法制备的苹果干细胞。
6.一种苹果干细胞的诱导培养基，其特征在于，为含有NAA、BA和水解酪蛋白的MS固体培养基。
7.一种苹果干细胞的增殖培养基，其特征在于，为含有2,4-D、BA、水解酪蛋白和活性炭的MS液体培养基。
8.一种苹果干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，将权利要求1～4任一项所述方法制备的苹果干细胞反复冻融后冻干，获得苹果干细胞冻干粉。
9.如权利要求8所述方法制备的苹果干细胞冻干粉。
10.如权利要求8所述方法制备的苹果干细胞冻干粉在制备食品、药品、保健品或化妆品中的应用。
11.一种苹果干细胞的提取方法，其特征在于，将权利要求1～4任一项所述方法制备的苹果干细胞反复冻融后冻干、粉碎，以乙醇水溶液为提取液经提取、强超声、浓缩、干燥、粉碎获得苹果干细胞提取物。
12.如权利要求11所述方法制备的苹果干细胞提取物。
13.如权利要求11所述方法制备的苹果干细胞在制备食品、药品、保健品或化妆品中的应用。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |