CN104694660B - 卵形鲳鲹家系亲子鉴定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种卵形鲳鲹家系亲子鉴定的方法，针对采用多亲本制备混合家系的实例，筛选出11对遗传多样性高、扩增效率稳定的微卫星引物。结合毛细管电泳测序及软件分析，达到检测卵形鲳鲹家系个体亲子关系的目的。通过本发明的方法，卵形鲳鲹亲子鉴定准确率能够达到90％以上。

Description

卵形鲳鲹家系亲子鉴定的方法

技术领域

本发明涉及鱼类育种和分子标记技术领域，具体涉及一种利用微卫星分子标记鉴定卵形鲳鲹混养家系子代亲本的方法。

背景技术

卵形鲳鲹隶属鲈形目(Perciformes)，鲹科(Carangidae)，鲳鲹亚科(Trachinotinae)，鲳鲹属(Trachinotus)，俗称金鲳，黄腊鲳等，是一种中上层暖水性鱼类，广泛分布于热带、亚热带海域，具有生长速度快，肉嫩味美，营养价值高等特点，现已成为我国南方沿海池塘和网箱养殖的重要经济品种。

近些年来，卵形鲳鲹市场需求量大幅上升，已经成为南方海水养殖鱼类的最大宗种类，目前我国金鲳商品鱼年产量20万吨以上，仅广东湛江鱼类交易市场每天就有500吨冰鲜卵形鲳鲹交易量。这样大的市场对卵形鲳鲹苗种的需求量也是非常巨大的。卵形鲳鲹是暖水性海水鱼类，卵形鲳鲹受温度条件影响养殖区域主要集中在海南、广东、福建等地。而海南地处亚热带、热带地区，海水温度相对较高，适宜卵形鲳鲹的孵化与育苗。目前，三省区所有卵形鲳鲹养殖苗种均来自于海南地区。由于卵形鲳鲹普遍存在近亲繁殖的现象,导致苗种种质退化,生长缓慢,病害爆发等问题日益凸显。传统苗种繁殖产业所采用的野种家养模式面临着巨大的挑战，对于卵形鲳鲹进行良种选育便成为水产养殖研究者迫在眉睫的任务。

家系选育是鱼类育种的重要基础手段，是根据某个或某几个性状明显优于其亲属、生产性能显著高于其亲属的混有不同类型的原始群里选出一些优良个体留种，建立几个或若干个家系并繁殖后代，逐代与原始群体及对照品种相比较，选留那些符合原定选择指标的优良***，进而进行品系性能测定。在鱼类育种中,家系选育尤为重要，几乎所有育成种类均需要经过家系选育这一步骤。目前鱼类人工家系的建立通常采用1(雌)对1(雄)交配生产子代。这样的方式建立的家系数量较少，而且单独管理每个家系受环境影响较大，对家系选择不利；而对混合家系进行个体的物理标记，在较多家系的情况下非常困难。目前对于卵形鲳鲹繁殖成熟度及雌雄性别的判断比较困难，也并不适用1对1的生产方式。因此对于卵形鲳鲹家系的建立和家系的鉴定一直是难以解决的问题,在很大程度上阻碍的卵形鲳鲹育种工作。

微卫星DNA(Microsatellites DNA)是广泛分布于真核生物基因组中的一种中度重复序列。微卫星标记以其多态性丰富，共显性遗传的优点被广泛应用于群体遗传结构分析，性状分析，种质鉴定，家系鉴定,遗传作图等领域。亲本的微卫星遗传信息可以通过繁殖传递给子代，微卫星标记技术通过检测不同亲子个体的微卫星差异区分个体所属家系。目前尚未见将微卫星标记用于卵形鲳鲹家系鉴定的报道。

发明内容

本发明的目的是提供了一种利用微卫星标记鉴定卵形鲳鲹家系的方法，为卵形鲳鲹育种提供亲子鉴定的分子标记工具。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种卵形鲳鲹家系亲子鉴定的方法，该方法包括如下步骤：

1)选择卵形鲳鲹体型较大，生长速度较快的个体87尾作为亲本，将亲本混合进行人工繁殖；待鱼苗长到10公分时随机选取1万尾转入网箱养殖，作为用于亲子鉴定的家系群体；

2)选取步骤1)的卵形鲳鲹繁殖亲本的鳍条组织，提取基因组DNA，以DNA为模板，选用51对微卫星引物进行巢式PCR扩增；

3)步骤2)所述的巢式PCR扩增方法指PCR体系内包含3个引物：位点特异性正向引物，其5’末端加M13序列(5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)；位点特异性反向引物；FAM、PET、VIC、NED四种荧光标记的M13通用引物；PCR反应体系20ul：50ng DNA，2ul dNTP(2.5mM)，2ul10×Buffer mixture，1U rTaq，0.4ul的含加通用引物M13的正向引物(10mM)，0.5ul反向引物，0.1ul的荧光标记通用引物，ddH₂O补足；

4)卵形鲳鲹亲本在51个微卫星位点的PCR产物经ABI3730型基因分析仪，根据荧光标记进行基因型分析，使用Genemapper3.7软件模拟分析，筛选出适合鉴定卵形鲳鲹混养家系的有效微卫星位点11个：ZD13、ZD15、TBG008、ZD02、ZD03、ZD04、ZD11、ZD12、ZD01、ZD10、TBG016；

5)将卵形鲳鲹1万条子代混养7月龄，随机选取2000尾个体，在每条鱼的背部肌肉植入电子标记并剪取每个个体鳍条组织，提取个体基因组DNA，选取步骤4)中的11个有效微卫星位点，分析子代的基因型；

6)根据亲本和子代在11个微卫星位点的基因型，采用PAPA 2.0软件对不同子代进行区分，鉴定子代个体的父母本。

其中步骤4)所述的11对有效微卫星引物的核苷酸序列如下所示。

表1卵形鲳鲹亲子鉴定微卫星引物

*分别合成四种荧光标记的M13引物，与卵形鲳鲹引物配合使用

本发明具有以下优点：

1.本发明采用亲鱼群体繁殖的方式制备混合家系，无需人工一对一配对繁殖。可用于雌雄性别不易区分及成熟度不易控制的卵形鲳鲹人工繁殖及家系育种构建，极大的解决了这一类型鱼类家系良种选育的问题。

2.本发明中混合家系的子代从受精卵开始到商品鱼这一阶段都处于同一环境下养殖，可避免单独家系养殖环境差异所导致的误差，提高家系选育的准确度。

3.本发明采用混合培育家系的方式，从育苗到半成鱼阶段不需要维持庞大的隔离养殖设施，大大节约管理与养殖成本。

4.本发明采用巢式PCR扩增方法，选用FAM、PET、VIC、NED四种荧光标记对通用引物M13标记，采用微卫星正向引物5’端加M13序列的方法，对于鉴定个体较多时，可极大节省了引物荧光标记的费用。

附图说明

图1引物TBG008的PCR扩增结果；

图2引物ZD15的PCR扩增结果；

图3 ZD02位点等位基因的出峰图；

图4 ZD03位点等位基因的出峰图；

具体实施方式

1)卵形鲳鲹家系的繁育及子代养殖

从卵形鲳鲹天然群体(海南地区)中挑选87尾优良个体作为亲本，在其背部肌肉植入电子标记并测量每个个体的生长性状数据。每条亲本剪取一小块鳍条，储存在95％酒精中，保存于-20℃。亲本通过注射激素的方法进行人工催产，87尾亲鱼均注射，注射激素的方法：一次性注射绒毛膜***(HCG)，注射剂量：200IU/kg；促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)，注射剂量：3ug/kg。87尾亲鱼共产10kg受精卵，取1.2kg受精卵放入面积为4亩的池塘中进行孵化，1d后估测仔鱼112万尾培育60天后，仔鱼平均长度为10公分，随机选取1万条转入6m×6m网箱养殖。培育7月龄时从1万条中随机选取2200尾转入另一个6m×6m网箱养殖并打入电子标记，拍照记录生长性状并剪取每个子代尾鳍组织，储存在95％酒精中，保存于-20℃。采用醋酸铵法提取亲本及家系个体的基因组DNA。

2)PCR引物的筛选及扩增反应体系

选取了51个卵形鲳鲹微卫星位点进行PCR扩增，大部分的位点扩增效果不佳或在卵形鲳鲹群体中差异较小，最终筛选出11对遗传多态性高，扩增效率稳定的引物用于卵形鲳鲹亲子鉴定，11对有效微卫星标记扩增引物和条件如表1所示。PCR反应体系为20ul：10×PCR Buffer 2ul，dNTP mixture(2.5mM each)2ul，TaKaRa Taq 0.2ul(5U/ul)(宝生物工程大连有限公司生产)，10umol/L正向引物5’端加M13通用引物0.4ul，10umol/L反向引物0.5ul，10umol/L M13荧光引物0.1ul。扩增反应在ABI2720PCR***上完成，PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；Tm退火30s；72℃延伸30s，反应进行32个循环，94℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸30s，反应进行8个循环；最后在72℃延伸10min。其中Tm值根据表1不同引物退火温度来设定。图1、图2展示部分微卫星位点的扩增结果。

3)微卫星位点基因型分析

PCR反应完成后，邮寄到北京理化分析中心进行上机检测，所用检测仪器为ABI3730基因分析仪。用软件Gene Mapper3.7做基因型分析，分别读取亲本和子代微卫星位点基因型。图3、图4为部分位点的峰图。

4)有效微卫星位点的选取及卵形鲳鲹亲子鉴定分析

采用步骤4)的方法分析87尾卵形鲳鲹亲本及2200尾子代在51对微卫星位点的基因型，通过软件PAPA 2.0中未知亲本性别模块模拟繁殖家系子代的基因型与亲本基因型匹配关系，筛选到11个微卫星位点(ZD13、ZD15、TBG008、ZD02、ZD03、ZD04、ZD11、ZD12、ZD01、ZD10、TBG016)亲子鉴定准确率可到达90.625％(表2)。

5)结果分析

在11个微卫星位点对87尾卵形鲳鲹亲本和2200尾混养家系子代中96尾进行扩增和基因分型。基因型应用Gene Mapper 3.7软件进行分析，卵形鲳鲹亲子鉴定应用PAPA 2.0软件未知亲本性别模块进行分析。为保证实验结果的准确性，只有保证所有微卫星座位全部匹配成功，并符合亲本交配体制的才确认亲子关系。最终确认87尾混养子代的父母，亲子鉴定率为90.625％。

表2卵形鲳鲹96尾个体亲子鉴定信息表

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (1)

1.一种卵形鲳鲹家系亲子鉴定的方法，该方法包括如下步骤：

1)选择卵形鲳鲹体型较大，生长速度较快的个体87尾作为亲本，将亲本混合进行人工繁殖；待鱼苗长到10公分时随机选取1万尾转入网箱养殖，作为用于亲子鉴定的家系群体；

2)选取步骤1)的卵形鲳鲹繁殖亲本的鳍条组织，提取基因组DNA，以DNA为模板，选用51对微卫星引物进行巢式PCR扩增；

3)步骤2)所述的巢式PCR扩增方法指PCR体系内包含3个引物：位点特异性正向引物，其5’末端加M13序列5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’；位点特异性反向引物；FAM、PET、VIC、NED四种荧光标记的M13通用引物；PCR反应体系20μL：50ng DNA，2μL dNTP，2μL 10×Buffermixture，1U rTaq，0.4μL的含加通用引物M13的正向引物10mM，0.5μL反向引物，0.1μL的荧光标记通用引物，ddH₂O补足；

4)卵形鲳鲹亲本在51个微卫星位点的PCR产物经ABI3730型基因分析仪，根据荧光标记进行基因型分析，使用Genemapper3.7软件模拟分析，筛选出适合鉴定卵形鲳鲹混养家系的有效微卫星位点11个：ZD13、ZD15、TBG008、ZD02、ZD03、ZD04、ZD11、ZD12、ZD01、ZD10、TBG016；所述11个有效微卫星位点是由以下引物序列5’-3’扩增获得：

ZD13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTAGCTTTGCATTGTGTG；

ZD13-R：CAGCCCAGTCAGTCCCTACT；

ZD15-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGACGTGTTCCACAGCAAGAA；

ZD15-R：AGGAATGGTCCCAAAGAATG；

TBG008-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCGCGACAAACTTTAACTCATCTC；

TBG008-R：AGCATTTTCACCTCCTCCATTG；

ZD02-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTTAGGACACCATCCCCTCA；

ZD02-R：GCTCCTGTGGAGGACAGAGA；

ZD03-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATATCAGCGTCCACCCAAAC；

ZD03-R：CTTTTCCATCTCTCCCCTCA；

ZD04-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGGAGACCATGACG；

ZD04-R：CTCCTGGAGGAACTGTGGAG；

ZD11-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGAGCAGGACGTCCAAAA；

ZD11-R：CTTTTCCATCTCTCCCCTCA；

ZD12-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCACCATCAATCAGCTGTCA；

ZD12-R：AGGTGCTCCACAGATGTTCC；

ZD01-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGCTTGAAAAATCAGGCAAG；

ZD01-R：TGCCAGGGAAAAGAGAGAGA；

ZD10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCTGTAGAGAACCAGAACAGTC；

ZD10-R：GCTCCTGTGGAGGACAGAGA；

TBG016-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTAGAAATACATCCTGGGTCACT；

TBG016-R：GAACCGGAGTCTGTAAACAAGAT；

5)将卵形鲳鲹1万条子代混养7月龄，随机选取2000尾个体，在每条鱼的背部肌肉植入电子标记并剪取每个个体鳍条组织，提取个体基因组DNA，选取步骤4)中的11个有效微卫星位点，分析子代的基因型；

6)根据亲本和子代在11个微卫星位点的基因型，采用PAPA 2.0软件对不同子代进行区分，鉴定子代个体的父母本。