CN104678109A - 一种人源性的cd13可溶性蛋白的免疫组化试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人源性的CD13可溶性蛋白的免疫组化试剂盒及其应用，该免疫组化试剂盒可以应用于人的肝癌细胞CD13抗原的检测，根据CD13的表达量作为肝癌患者愈后复发检测指标。本发明优点在于：本发明以病人肿瘤组织为检测样本，具有快捷，敏感性好，特异性高，易于推广应用等特点；可用于指导肝癌术后点辅助治疗，降低高危患者术后复发率。

Description

一种人源性的CD13可溶性蛋白的免疫组化试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种人源性的CD13可溶性蛋白的免疫组化试剂盒及其应用。
背景技术
肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界常见的恶性肿瘤之一，不仅手术切除率低于50％，而且癌肿切除后易于复发和转移。
近年研究发现，肝癌与白血病、乳腺癌和结直肠癌一样，肿瘤组织和癌细胞株中均含有的肝癌干细胞(cancer stem cells，CSCs)处于休眠或慢增殖的细胞周期，具有自我更新、多向分化，对放化疗抵抗特性，可能是肝癌复发和转移的根源。因此肝癌病人的发现与愈后和肝癌干细胞的关系密不可分。目前肝癌干细胞的标记物已经报道的有CD133、cd44、cd90、EpCAM和SP，但是对于识别肝癌干细胞的准确率与最新发现的CD13相比稍有不足。
CD13是一种将氨基酸从寡肽N末端切除的膜结合糖蛋白(氨基肽酶N)，具有锌离子结合依赖性金属蛋白酶活性，可酶解基底膜蛋白，促进血管生成，从而调控肿瘤细胞的侵袭和转移。研究发现，CD13的抑制剂可以抑制肝癌细胞的侵袭和血管生成，在临床治疗中CD13抑制剂结合放化疗对肝癌的治疗效果好于单纯放化疗。因此有必要针对于临床开发出检测CD13的方法，从而有望将CD13作为一种新的肿瘤标记物，为肝癌的诊断、愈后观察、个性化用药提供一种辅助判定指标。
中国专利文献CN102869992A公开了一种用于癌症诊断的方法和试剂盒，涉及用于对怀疑患有***癌的对象进行诊断或提供预后的方法，包括体外检测***小体和对至少一种选自CD13、CD59、CD10、CD26、CD142、CD143和MHC I的抗原的***小体表达进行定量，以及将所定量的表达值与来源于健康对象的相应抗原的参考值进行比较，还提供用于对怀疑患有***癌的对象进行诊断或提供预后的试剂盒。但是关于一种人源性的CD13可溶性蛋白的免疫组化试剂盒及其应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种能够检测人源性的肝癌CD13表达量的免疫组化试剂盒，抗原作为肝癌诊断试剂或根据CD13的表达量作为肝癌患者愈后复发检测指标，以减少患者由于盲目用药造成的损失及病情延误。
本发明的再一的目的是，提供一种能够检测人源性的肝癌CD13表达量的免疫组化试剂盒的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种能够检测肝癌CD13表达量的免疫组化试剂盒，所述的试剂盒包括：检测人源性可溶性CD13抗原的抗体，HRP标记的羊抗鼠IgG，DAB显色液和苏木素复染液。
所述的抗体能够特异性结合CD13抗原分子。
所述的试剂盒的检测样本为肿瘤组织。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的试剂盒在制备肝癌诊断试剂中的应用。
所述的试剂盒在制备肝癌患者愈后复发检测试剂中的应用。
本发明优点在于：
1、本发明的试剂盒敏感性级高，CD13抗体与市面上其它的肝癌标志物相比，阳性强度可以达到++++，符合临床监测标准；
2、本发明的试剂盒准确性级高，CD13抗体与市面上其它的肝癌标志物相比，准确率较高，符合临床监测标准；
3、本发明的能够检测人源性的肝癌CD13表达量的免疫组化试剂盒，可以应用于人的肝癌细胞CD13抗原的检测，根据CD13的表达量作为肝癌患者愈后复发检测指标；本发明以病人肿瘤组织为检测样本具有快捷，敏感性好，特异性高，易于推广应用等特点。可用于指导肝癌术后点辅助治疗，降低高危患者术后复发率。
附图说明
图1.本发明用于肝癌患者免疫组化实验的图片(20x)：图示结果显示CD13在肝癌患者中表达呈阳性。
图2.本发明用于肝癌患者癌旁免疫组化实验的图片(20x)：图示结果显示CD13在肝癌患者中表达呈阴性。
图3.Western blot验证CD13在上述肝癌患者癌组织及癌旁组织中的表达。结果显示与图1和图2的结果相符合。
图4.肝癌患者CD13阳性与愈后，复发的关系：根据实施例1和2筛选出的肝癌患者CD13阳性患者，通过与治疗愈后数据比对后发现，CD13阳性患者愈后差，复发率高，因此可以作为肿瘤愈后查，复发率高的评判标准，具有显著性差异。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明使用的能够检测人源性的肝癌CD13表达量的免疫组化试剂盒，由人源性可溶性CD13抗原的抗体，HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG，DAB显色液和苏木素复染液组成。
实施例1
试剂盒组成：
肝癌个体化诊断检测试剂盒(10人份)
试剂盒的使用方法：
(1)3％H2O2每张切片组织滴5ul，随后室温孵育15min；
(2)PH7.5PBS漂洗3次，每次5min；
(3)2.5μg/ml人源性可溶性CD13抗体每张切片组织滴5ul，过夜37℃孵育；
(4)PH7.5PBS漂洗3次，每次5min；
(5)HRP标记的羊抗鼠IgG每张切片组织滴5ul，37℃孵育1hrs；
(6)PH7.5PBS漂洗3次，每次5min；
(7)DAB显色缓冲液每张切片组织滴5ul，室温孵育3-10min；
(8)苏木素复染1min，盐酸酒精泛蓝1min；
(9)脱水；
(10)透明；
(11)指甲油封片；
(12)显微镜拍照。
实施例2
试剂盒进行肝癌临床样本的检测
收集了本院254份肝癌手术样本，包括肝癌组织(见图1)和癌旁组织(见图2)。根据试剂盒使用说明方案进行试验，结果显示，按照染色程度+(＜20％＝、++(20-50％)、+++(51-75％)、++++(76-100％)4级进行评分。最后用统计软件进行分析，肝癌中CD13阳性率达到11.81％，具有显著性差异。
实施例3
Western blot进行肝癌临床样本的检测
将收集的本院254份肝癌手术样本，Western blot进行试验，结果显示实施例2中鉴定的CD13阳性样本符合Western blot检测结果。(见图3)。
实施例4
根据实施例2和3所得数据与医院提供的愈后，复发率数据比对后发现，CD13阳性患者出现治疗愈后差，复发率高，因此可以作为肝癌愈后复发的评判标准，具有显著性差异。(见图4)。
本发明通过大量探索性实验研究，制备了一种能够检测人源性的肝癌CD13表达量的免疫组化试剂盒，首次通过CD13在肝癌诊断领域或在愈后复发提供临床依据。与现有技术相比，本发明涉及的CD13免疫组化试剂盒具有如下优点和显著性的进步：
1、敏感性：本发明的试剂盒敏感性级高，该CD13抗体与市面上其它的肝癌标志物相比，阳性强度可以达到++++，符合临床监测标准。
2、准确性：本发明的试剂盒准确性级高，CD13抗体与市面上其它的肝癌标志物相比，准确率较高，符合临床监测标准。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种能够检测肝癌CD13表达量的免疫组化试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：检测人源性可溶性CD13抗原的抗体，HRP标记的羊抗鼠IgG，DAB显色液和苏木素复染液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗体能够特异性结合CD13抗原分子。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的检测样本为肿瘤组织。
4.根据权利要求1所述的试剂盒在制备肝癌诊断试剂中的应用。
5.根据权利要求1所述的试剂盒在制备肝癌患者愈后复发检测试剂中的应用。
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