CN114106106A - 一种自组装树状抗菌肽Pal3RP和其制备方法及其自组装纳米颗粒和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种自组装树状抗菌肽Pal3RP和其制备方法及其自组装纳米颗粒和应用。其序列：Pal‑GGGK(RPRPRP)K(RPRPRP)RPRPRP，其中Pal为正十六烷酸。通过利用赖氨酸作为分支氨基酸的结构特殊性，同时利用阳离子抗酶解单元和十六烷酸，形成树枝状结构和肽链之间的空间位阻，具有高抗菌活性，低毒性和高稳定性。进一步通过超声静置的方法使树状抗菌肽自组装成具有微纳米尺寸的自组装抗菌肽纳米颗粒。自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米颗粒不革兰氏阴性菌和阳性菌有明显的抑制作用，并对多重耐药菌有高效的抑制作用，同时具有很低的溶血毒性；高浓度的蛋白酶对树状抗菌肽Pal3RP纳米颗粒降解程度很弱。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种自组装树状抗菌肽Pal3RP和其制备方法及其自组装纳米颗粒和应用。
背景技术
耐药细菌感染，尤其是革兰氏阴性耐药菌感染的日益流行，被公认为是全球公共卫生的最大威胁之一。近年来，大多数小分子抗生素表现出较弱的治疗作用，抗生素耐药菌引起的感染需要更长治疗过程，并且死亡率更高。因此迫切需要开发可规避现有细菌耐药机制的新型抗菌药物。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)已被提议作为一种有吸引力且有前景的策略来对抗强大的耐药细菌感染。与大多数抗生素作用于少数特定靶点的作用机理不同，大多数抗菌肽通过物理性吸附并迅速渗透和破坏细菌膜的基本成分来杀死细菌。因此，病原微生物几乎不可能对抗菌肽产生耐药性，因为这需要膜完整的变更或多个生化传递途径全部发生改变。而且，抗菌肽可以在微摩尔浓度广谱抗菌，包括许多对常规抗生素已经产生耐药的病原微生物。
抗菌肽在解决微生物多重耐药性问题有着巨大的应用潜力，但其稳定性差，特别是蛋白酶稳定性差阻碍了它们的应用。各种合成策略，如非天然氨基酸替代和化学修饰，在提高抗菌肽稳定性方面已经取得了一些进展。然而，这些复杂的合成策略通常也大大增加了生产成本。自组装纳米抗菌肽由于其分子多价性、高效性和生物相容性，在靶向药物和多肽类药物的开发中引起了科研人员的极大兴趣。理论上纳米结构和树状多聚大分子的形成可以有效增强抗菌肽对蛋白酶水解消化的抵抗力，并增加抗菌肽体内半衰期。抗菌肽通过自组装的方式制备的纳米粒子保持了抗菌肽快速而强烈的物理性破膜杀菌机制，同时赋予抗菌肽高效的抗酶解性能和更长的体内半衰期，使它们具有成为优于传统抗生素的新型抗感染药物。
但是现有自组装多肽多用于靶向药物，基因载体及免疫诊断学中，其作为抗菌剂的功能极少被探究。并且自组装赋予多肽的抗酶解能力较弱，因此新型自组装纳米抗菌多肽的设计和制备势在必行。
发明内容
基于以上不足之处，本发明的目的是提供一种自组装树状抗菌肽Pal3RP，解决了以上背景技术的不足之处，抗菌肽Pal3RP的序列为：Pal-GGGK(RPRPRP)K(RPRPRP)RPRPRP，其中Pal为正十六烷酸,两个赖氨酸的氨基和R基上的两个-NH2分别作为树状大分子的主链和分支链的链接位点，将三个阳离子抗酶解多肽单元RPRPRP链接起来，用于形成树枝状结构和肽链之间的空间位阻。
进一步，如上所述的一种自组装树状抗菌肽Pal3RP的制备方法，如下：利用两个赖氨酸氨基和R基上的两个-NH2分别作为树状大分子的主链和分支链的链接位点，将三个阳离子抗酶解多肽单元RPRPRP链接起来设计出具有一个主链两个侧链的树状抗菌肽，形成树枝状结构和肽链之间的空间位阻，进一步使用柔性氨基酸连接体GGG将树状抗菌肽与一个正十六烷酸Pal链接，将树状抗菌肽命名为Pal3RP。
本发明的另一目的是提供如上所述的一种树状抗菌肽Pal3RP自组装形成的一种树状抗菌肽Pal3RP纳米颗粒，该自组装树状抗菌肽纳米颗粒抗菌能力强，毒性小，同时具有优异的抵抗高浓度蛋白酶水解的能力。
进一步的，如上所述的一种树状抗菌肽Pal3RP纳米颗粒的自组装方法，如下：将树状抗菌肽Pal3RP溶于pH＝7.4、10mM的磷酸缓冲溶液中，终浓度为256μM，在28℃下超声5分钟后，放置在4℃静置18小时以上形成自组装纳米颗粒。
本发明的另一目的是提供如上所述的一种自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米颗粒在制备治疗革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌感染性疾病的药物中的应用。
进一步，如上所述的革兰氏阴性菌为多重耐药大肠杆菌E.coli CLNP19、CHP 25或CHP 114。
进一步，如上所述的革兰氏阳性菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
本发明的优点及有益效果：本发明通过利用赖氨酸可作为分支氨基酸的结构特殊性，同时利用阳离子抗酶解单元和十六烷酸，设计出具有高抗菌活性，低毒性和高稳定性的树状抗菌肽。进一步通过超声静置的方法使树状抗菌肽自组装成具有微纳米尺寸的自组装抗菌肽纳米颗粒，形成肽链之间的空间位阻，进一步提高抗菌肽的稳定性。对得到的纳米抗菌肽进行抗菌活性、溶血活性和抗蛋白酶水解能力检测，发现自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米颗粒不但对大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏杆菌，金黄色葡萄球菌等革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有明显的抑制作用，而且对多重耐药的大肠杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等耐药菌有高效的抑制作用，同时具有很低的溶血毒性；并且高浓度的胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K对树状抗菌肽Pal3RP的纳米颗粒降解程度很弱，因而，综合来看，自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米颗粒是一种具有较高实际应用潜力的纳米抗菌肽。
附图说明
图1为自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米粒子的质谱图。
图2为自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米粒子高效液相色谱图。
图3为自组装树状抗菌肽纳米粒子。(a)自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米粒子的SEM图；(b)自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米粒子的尺寸分布。
图4为自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米粒子3D结构示意图。
图5为自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米粒子的溶血活性图。
图6为自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米粒子的作用机制透射电镜图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
树状抗菌肽的设计：
树状抗菌肽Pal3RP的氨基酸序列为：
Pal-GlyGlyGlyLys(ArgProArgProArgPro)Lys(ArgProArgProArgPro)ArgProArgProArgPro
利用两个赖氨酸Lys氨基和R基上的两个-NH2分别作为树状大分子的主链和分支链的链接位点，将三个阳离子抗酶解多肽单元(ArgProArgProArgPro)链接起来设计出具有一个主链两个侧链的树状抗菌肽。如图所示，该树枝状结构形成了肽链之间的空间位阻，进一步使用柔性氨基酸连接体GGG将树状抗菌肽与一个正十六烷酸链接，为其发挥抗菌活性提供疏水性和自组装的疏水驱动力，将树状抗菌肽命名为Pal3RP，序列为Pal-GlyGlyGlyLys(ArgProArgProArgPro)Lys(ArgProArgProArgPro)ArgProArgProArgPro。抗菌肽的序列如表1所示。
表1棕榈酸化抗酶解抗菌肽B3C16的主要参数
Pal3RP为树状抗菌肽，正电荷数为9，分子量为2963.69。
其结构式为：
实施例2
将上述树状抗菌肽使用多肽合成仪进行合成，方法为固相化学合成法，具体步骤为：
1、多肽主链的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
2、使用水合肼脱去Fmoc-Lys(Dde)-OH侧链Dde保护基团，重复步骤1，完成支链氨基酸链接。
3、在上述得到的多肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水***，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水***洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
4、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH＝7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；
5、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(见附图1)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％(见附图2)。
实施例3
将上述树状抗菌肽通过超声静置进行自助装纳米粒子的制备，具体步骤为：
1、自组装纳米粒子的制备：将树状抗菌肽Pal3RP溶于10mM的磷酸缓冲溶液中(pH＝7.4)中，终浓度为256μM。在28℃下超声5分钟后，放置在4℃静置18小时以上形成自组装纳米颗粒。
2、自组装纳米粒子的鉴定：将上述制备的纳米粒子通过扫描电子显微镜(SEM)观测。如附图3和4所示，树状抗菌肽Pal3RP在磷酸缓冲液中自装成直径约为20nm左右的纳米粒子。
实施例4
对制备完成的自组装树状抗菌肽纳米粒子通过体外抑菌活性、溶血活性、抗酶解能力及作用机制检测；
1、抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。挑取细菌单菌落在MHB培养基中培养过夜，并转移至新的MHB中生长到对数中期。然后将上述细菌溶液离心并重悬于MHB中至终浓度为1×106CFU ml-1，并将其转移到96孔板中，每孔50μl。将50μl含有不同浓度纳米粒子的BSA分别加入到上述的96孔板中，96孔板中的最终树状抗菌肽浓度范围为0.125至64μM。在37℃温育22-24小时后，用酶标仪在492nm(OD＝492nm)处测定光吸收值,确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。
表2自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米粒子的抑菌活性
注：a E.coli HZP 25、114和E.coli CLNP19为临床分离的多重耐药菌。
通过表2可以看出，自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米粒子对于革兰氏阴性、革兰氏阳性菌和多重耐药菌均表现出高效的抑菌活性。
2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2ml PBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10ml PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的纳米粒子溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μL PBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL 0.1％Tritonx-100作为阳性对照。多肽溶血活性检测结果见图1。溶血率越低，表明多肽越安全。通过附图5可以看出，自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米粒子在64μM以下的浓度检测范围内没有明显的溶血活性。溶血活性远高于抑菌活性，表明自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米粒子具有极高的实际应用潜力。
3、蛋白酶抗性：为了检验抗菌肽对抗蛋白酶水解的能力，我们测定了纳米粒子经过不同类型蛋白酶处理后的抑菌活性。在37℃水浴条件下，用不同反应浓度为的胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K溶液分别处理纳米粒子，时间为1h，然后按照抗菌活性的测定中的方法，将这些处理后的多肽与菌液混合于96孔培养板的孔中，以此来测定多肽经过蛋白酶处理后的最小抑菌浓度是否发生了变化。对照组为没有经过蛋白酶处理的组别，测试结果见表3。
表3蛋白酶处理后的自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米粒子对E.coli ATCC25922的最小抑菌浓度
注：a蛋白酶浓度均为8mg/mL。
通过表3可以看出，糜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K对Pal3RP纳米粒子的抑菌活性均没有明显影响，这表明全新设计的自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米粒子具有优异的抵抗高浓度蛋白酶水解的能力。
4、作用机制测定：利用高分辨透射电子显微镜(TEM)对自组装树状抗菌肽纳米粒的作用机制进行探究。挑取大肠杆菌ATCC25922单菌落在MHB培养基中培养过夜，并转移至新的MHB中生长到对数中期。然后将上述细菌溶液离心并重悬于磷酸缓冲液中至终浓度为OD600＝0.2，加入制备好的自组装树状抗菌肽纳米粒至终浓度为MIC值。室温孵育5分钟后，取5μL至300目的铜网格上吸附2分钟，使用浓度为1％的磷钨酸染色10秒后放置过夜风干，并通过TEM观察拍照。结果见图6。
如图所示，Pal3RP纳米粒子首先通过静电吸引相互作用与大肠杆菌表面的LPS相结合，快速吸附到大肠杆菌表面，增大外膜通透性，并穿透外膜到达质膜，使质膜去极化进而破坏质膜完整性，导致细菌内容物外漏，从而导致细菌死亡。
以上结果显示，通过将抗酶解单元通过树状分支化的方式链接，同时结合纳米尺度的自组装形成肽链之间空间位阻的方法，全新设计出的自组装树状抗菌肽纳米粒子可以有效提高多肽类抗菌素的稳定性能力。综合分析上述结果，自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米粒子对包括耐药菌在内的多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度可达微摩尔级别，展现了高效的抑制能力；同时Pal3RP纳米粒子具有极高的安全性和蛋白酶稳定性，通过物理性破膜机制杀死细菌，表明全新设计出的自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米粒子具有较高的替代抗生素的发展潜力。
Claims (7)
1.一种自组装树状抗菌肽Pal3RP，其特征在于，其序列为：Pal-GGGK(RPRPRP)K(RPRPRP)RPRPRP，其中Pal为正十六烷酸,两个赖氨酸的氨基和R基上的两个-NH2分别作为树状大分子的主链和分支链的链接位点，将三个阳离子抗酶解多肽单元RPRPRP链接起来，用于形成树枝状结构和肽链之间的空间位阻。
2.根据权利要求1所述的一种自组装树状抗菌肽Pal3RP的制备方法，其特征在于，方法如下：利用两个赖氨酸氨基和R基上的两个-NH2分别作为树状大分子的主链和分支链的链接位点，将三个阳离子抗酶解多肽单元RPRPRP链接起来设计出具有一个主链两个侧链的树状抗菌肽，形成树枝状结构和肽链之间的空间位阻，进一步使用柔性氨基酸连接体GGG将树状抗菌肽与一个正十六烷酸Pal链接，将树状抗菌肽命名为Pal3RP。
3.根据权利要求1所述的一种树状抗菌肽Pal3RP自组装形成的一种树状抗菌肽Pal3RP纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的一种树状抗菌肽Pal3RP纳米颗粒的自组装方法，其特征在于：将树状抗菌肽Pal3RP溶于pH＝7.4、10mM的磷酸缓冲溶液中，终浓度为256μM，在28℃下超声5分钟后，放置在4℃静置18小时以上形成自组装纳米颗粒。
5.根据权利要求3所述的一种自组装树状抗菌肽Pal3RP纳米颗粒在制备治疗革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌感染性疾病的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的革兰氏阴性菌为多重耐药大肠杆菌E.coli CLNP19、HP 25或CHP 114。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的革兰氏阳性菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
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