CN104667294B - miR‑216在制备促进成骨分化的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及miR‑216在制备促进成骨分化的药物中的用途。miR‑216a能够促进人脂肪组织来源的间充质干细胞（hAMSC_s）向成骨分化，碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性、茜素红染色和RT‑PCR、western blot分析成骨相关标志基因和转录因子均表明，miR‑216a使得hAMSC_s的成骨能力增加。

Description

miR-216在制备促进成骨分化的药物中的用途

技术领域

本领域涉及再生医学领域，具体而言涉及miRNA在制备促进成骨分化的药物中的用途。

背景技术

人间充质干细胞（hMSC_s）具有自我更新和多谱系分化潜能，在适当条件下能够分化为骨、软骨、脂肪和肌组织（Prockop,DJ，1997；Phinney,DG，2007；Pittenger,MF等人，1999和Fink,T等人，2011）。研究者首先从骨髓中分离出MSC（BMSC_s），并证明了其多系分化的能力。BMSC_s向成骨细胞分化是机体普遍存在的生理过程。在生理条件下，骨组织呈现成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收的动态平衡。一旦各种原因导致这种动态平衡破坏，如成骨分化能力降低时，就会引起骨质疏松、锁骨颅骨发育不全、股骨头坏死、关节退行性变、脊柱侧弯等骨相关疾病。因此，揭示间充质干细胞成骨的调控机制具有极其重要的临床应用价值。

由于受来源的限制以及取样困难，BMSC的研究和应用发展较慢。后来的研究发现，除骨髓外，MSC还广泛存在于脂肪、皮肤、滑液、脱落的牙齿、羊水和胎盘等多种组织器官中（Prockop,DJ，1997）。研究证明，与骨髓来源的MSC相似，人脂肪组织来源的MSC（hAMSC_s）具有跨系甚至跨胚层的多向分化潜能，在体内外可分化成多种细胞类型，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、内皮细胞、神经胶质细胞等。此外与BMSC相比，hAMSC_s具有原料充足，取材方便，体外分离扩增方法简单易行等优点，因此备受研究者青睐。目前hAMSC_s已经成为研究MSC自我更新和分化的最佳细胞模型和最有发展潜力的组织工程种子细胞。

MicroRNA_s（miRNA_s）是一类高度保守的非编码小RNA分子，能够在转录或转录后水平调控靶基因表达（Ambros,V，2004；Bartel,DP，2004）。最近，越来越多的证据表明miRNA_s能够调控细胞分化和命运决定（Ivey,KN and D Srivastava，2010）。目前，miR-125、miR-133、miR-135、miR-138、miR-181、miR-206、miR-9、miR-27、miR-196a、miR-214、miR-764-5p、miR-2861、miR-3960、miR-642a-3p、miR-141/200a和miR-17-5p～92/miR-106a等许多miRNA_s已经被证实参与成骨分化的调控。miR-214转基因小鼠表现出明显的成骨能力降低（Wang,X，2013）。这些研究结果提示，miRNA_s在MSC的成骨分化调控中可能扮演了非常重要的角色。

发明内容

根据一些具体实施方式，本发明提供miR-216在制备促进成骨分化的药物中的用途。

在一些具体实施方式中，miR-216促进人脂肪组织来源的间充质干细胞向成骨分化。

在一些具体实施方式中，miR-216的序列如SEQ ID No.1所示。SEQ ID No.1为UAAUCUCAGCUGGCAACUGUGA，其登录号为miRbase Accession number MIMAT0000273。

在一些具体实施方式中，通过转染试剂提供miR-216；转染试剂优选为脂质体。在一些具体实施方式中，转染试剂是Lipofectamine2000。

在一些具体实施方式中，miR-216的转染浓度为100nmol/L。

附图说明

图1：hAMSC_s经成骨诱导培养基诱导后3天的ALP染色。

图2：hAMSC_s经成骨诱导培养基诱导后12天的茜素红染色。

图3A：转染NC对照后，hAMSC_s的ALP染色。

图3B：转染miR-216a后，hAMSC_s的ALP染色。

图4A：转染NC对照后，hAMSC_s的茜素红染色。

图4B：转染miR-216a后，hAMSC_s的茜素红染色。

图5：成骨诱导后碱性磷酸酶的活性。hAMSCs：未经转染的hAMSC_s；NC：转染有NC对照的、经过成骨诱导的hAMSC_s；miR-216a：转染有miR-216a的、经过成骨诱导的hAMSC_s。

具体实施方式

以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下组织、细胞、试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。

实施例1：成人脂肪源间充质干细胞的分离和鉴定

1.成人脂肪组织取自吸脂手术患者（中国医学科学院整形医院），与自愿捐献者签订知情同意书，捐献者均为25-35岁的健康女性。

2.从脂肪组织中分离hAMSC_s的方法简述如下：

吸脂术采集出来的脂肪组织用D-Hanks洗去血细胞和***，0.2g/100mlII型胶原酶（购自：美国Life Technologies公司）消化1h，之后用D-Hanks洗涤2遍以除去胶原酶。

离心收集细胞，细胞以2×10⁶/ml的密度接种于含58％（v/v）DMEM/F12+40%（v/v）MCDB-201、2%（v/v）胎牛血清、10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF、1×胰岛素-转铁蛋白-***（ITS）、l×亚油酸-牛血清白蛋白、50μM beta-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、l00μg/m1青霉素和100U/ml硫酸链霉素的干细胞培养液，37℃、5%CO₂、95%湿度的培养箱培养。

两天后换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3天半量换液。

当细胞达70%～80%汇合时，0.25g/100ml胰酶（Gibco）常规消化，细胞按照l：3进行传代。

3.hAMSC_s的表型：

收集第三代细胞，PBS洗3次；

加0.1%皂素室温破膜1小时，PBA洗3次（若检测细胞内抗原，则进行本步骤；若检测细胞表面抗原，则直接进行下一步）；

加一抗（CD29、CD44、CD105、CD31、CD34、CD106、HLA-DR、FLK-1单抗，购自：BD公司），4℃孵育30分钟；

加PBS洗3次，加FITC标记二抗（兔抗鼠，购自中杉金桥生物技术有限公司），4℃孵育30分钟；

加PBS洗3次，4%多聚甲醛固定，300ul PBS重悬；

上流式细胞仪（品牌、型号）检测细胞。经鉴定，细胞呈现典型的AMSC表型：

CD29⁺、CD44⁺、CD105⁺、FLK-1⁺；

CD31^-、CD34^-、CD106^-、HLA-、DR^-。

实施例2：miRNA_s的转染

1.试剂：

（1）转染试剂为Lipofectamine2000（Invitrogen）；

（2）待转染的miRNA_s：

miR-216粉末为美国Life Technologies公司合成；

采用公知技术合成与miR-216长度相似的无关序列（SEQ ID No.2：UUCUUCGAACGUGUCACGUTT）作为NC对照。

2.待转染的miRNA_s储备液配置：

将装有待转染的miRNA_s的管低速离心5min，按照Lipofectamine2000（Invitrogen）说明书加入Opti-MEM溶解miRNA_s，震荡并瞬时离心配成20μM的储备液。

3.细胞准备：

取第3代对数生长期、70%-80%汇合的hAMSC_s进行转染。

4.转染过程：

用Opti-MEM分别稀释待转染的miRNA_s和Lipofectamine2000，轻轻混匀后室温放置5min；

将Lipofectamine2000稀释液缓慢逐滴加入待转染的miRNAs稀释液中，轻轻混匀获得miRNA_s和Lipofectamine2000混合液，室温孵育20min；

从培养箱取出待转染细胞，吸出培养液，用DPBS液（杜氏磷酸缓冲液）洗3遍，吸净洗液后每孔加入1.5ml Opti-MEM；

将孵育好的miRNA_s-Lipofectamine2000混合液缓慢逐滴入培养皿中.转染量：miRNA_s终浓度为100nmol/L，轻摇混匀后放培养箱继续培养；

转染6h后，去除转染工作液，用DPBS洗3遍；

更换干细胞培养液；24h后，去除干细胞培养基，用DPBS洗3遍，随后可更换成骨诱导培养基。

实施例3：hAMSCs向成骨诱导分化

分别取第3代的hAMSCs（未经转染）、实施例2所获得的细胞（转染有miR-216、或转染有NC对照）以2×10⁴细胞/cm²的密度接种于T25培养瓶，贴壁过夜后，观察细胞达70%-80%汇合后，更换成骨诱导培养基（H-DMEM培养基中加入10%FBS、10nM***、0.2mM抗坏血酸和10mM beta-甘油磷酸钠）继续培养，每隔两天半量换液一次。

分别于诱导后的第0、3、6、9天取样，用qRT-PCR检测成骨表型标志基因的表达变化。

分别于诱导后3天和12天时，用碱性磷酸酶染色和茜素红染色鉴定钙化情况和矿化基质的产生。

实施例4：hAMSC_s向成骨分化的鉴定

1.碱性磷酸酶染色

1.1实验原理：细胞内碱性磷酸酶在pH9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性蓝色沉淀。

1.2操作步骤：

使用天津血研所碱性磷酸酶染色试剂盒进行碱性磷酸酶染色。

向成骨诱导的培养皿中滴加数滴1号液，室温固定1min，流水漂洗2min；

取2号储备液10ml，加3号液200μl，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，用滤纸立即过滤，滤液即工作液：

滴加工作液数滴，置湿盒内于37℃孵育2h，流水冲洗2min；

甘油封片，显微镜下观察照相。

2.茜素红染色

2.1实验原理：茜素红可与钙离子以螯合方式形成复合物。用来识别组织细胞的钙盐成分。通过茜素红染色，产生桔红色沉积（即钙结节），在细胞外基质中被染成橘红色。细胞本身被染成粉红色。钙盐变化是骨细胞增殖分化和骨组织成骨潜能的标志之一。

2.2操作步骤：

培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，去离子水冲洗3次；

0.1%茜素红S（Tris-HCl，pH8.3）37℃孵育30min；

蒸馏水冲洗；

甘油封片，显微镜下观察照相。

3.碱性磷酸酶（ALP）活性测定

3.1实验原理：ALP与底物pNPP反应，生成黄色物质，通过测定405nm处的吸光度可以反应ALP活性。

3.2操作步骤：

培养细胞去除培养基，冷PBS洗2遍，加适量蛋白裂解液（RIPA裂解液（中），碧云天生物技术研究所），冰上裂解30min，收集细胞裂解液；

12000rpm在4℃离心15分钟；

取5μl细胞裂解液，加入96孔酶标板；

加200μl的碱性磷酸酶底物pNPP（sigma公司）；

37℃孵育30min；

405nm检测吸光值；

计算ALP活性，ALP的活性以细胞裂解液的总蛋白浓度为标准化。

结果：

1.hAMSC_s（未经转染）经过成骨诱导培养基的诱导，3天后ALP染色呈阳性（图1），12天后出现茜素红染色阳性的钙结节（图2）。该结果表明，hAMSC_s在成骨诱导培养条件下，具有成骨分化的能力。

2.miR-216a促进hAMSC_s成骨分化

（1）图3为ALP染色的结果（图3A为NC对照组、图3B为miR-216组）。具体而言，从图3A中可见，仅有较少比例的细胞呈ALP染色阳性。图3B显示大部分细胞呈ALP染色阳性。这种差异表明miR-126与NC相比，可以促进hAMSC_s成骨分化。

（2）图4为茜素红染色的结果（图4A为NC对照组、图4B为miR-216组）。具体而言，从图4A中可见，少部分细胞呈茜素红染色阳性。然而图4B显示大部分细胞呈茜素红染色阳性。这种结果再次证明miR-126与NC相比，可以促进hAMSC_s的成骨分化。

（3）经过成骨诱导后，ALP活性增加，即转染NC对照的ALP活性比未经过成骨诱导的hAMSC_s高。然而，转染有miR-216a的、经过成骨诱导后的hAMSC_s碱性磷酸酶活性明显高于转染有NC对照的经过相同时间的成骨诱导的hAMSC_s（图5）。这一结果表明miR-126与NC相比，可以促进hAMSC_s成骨分化。

综上结果证实，转染miR-216a后，hAMSC_s的成骨能力增加。

参考文献：

Ambros,V.The functions of animal microRNAs.Nature2004;431:350-355.

Bartel,DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction.Cell2004;116:281-297.

Fink,T,JG Rasmussen,J Emmersen,et al.Adipose-derived stem cells fromthe brown bear(Ursus arctos)spontaneously undergo chondrogenic and osteogenicdifferentiation in vitro.Stem Cell Res2011;7:89-95.

Ivey,KN and D Srivastava.MicroRNAs as regulators of differentiationand cell fate decisions.Cell Stem Cell2010;7:36-41.

Phinney,DG and DJ Prockop.Concise review:mesenchymal stem/multipotentstromal cells:the state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.Stem Cells2007;25:2896-2902.

Pittenger,MF,AM Mackay,SC Beck,et al.Multilineage potential of adulthuman mesenchymal stem cells.Science1999;284:143-147.

Prockop,DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietictissues.Science1997;276:71-74.

Wang,X,B Guo,Q Li,et al.miR-214targets ATF4to inhibit boneformation.Nat Med2013;19:93-100。

Claims (5)

1.miR-216在制备促进成骨分化的药物中的用途，其中miR-216的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

2.根据权利要求1所述的用途，miR-216促进人脂肪组织来源的间充质干细胞向成骨分化。

3.根据权利要求1所述的用途，药物含有转染试剂。

4.根据权利要求3所述的用途，所述转染试剂是Lipofectamine2000。

5.根据权利要求3所述的用途，miR-216的转染浓度为100nmol/L。