CN104655855A - 基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用 - Google Patents

基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用，特点是包括将三聚氰胺加热真空干燥后得到氮化碳粉末，然后加硝酸反应得到羧基化的氮化碳，然后依次加入偶联试剂、肿瘤标志物抗体和氨基化的纳米四氧化三铁悬浊液得到多功能化氮化碳材料步骤；最后将多功能化氮化碳材料溶液滴在磁性玻碳电极表面得到用于检测肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器的步骤，该传感器可用于检测待测样品中肿瘤标志物的浓度，优点是特异性好、灵敏度高、结果准确可靠、成本低、快速，且制备过程极其简单。

Description

基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种电化学发光免疫传感器，尤其是涉及一种基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用。
背景技术
据WHO统计与预测：2008年全世界有760万人死于肿瘤疾病，2030年预计将有1100万人死于肿瘤疾病，肿瘤疾病已经成为公共卫生的头号公敌。肿瘤专家认为，实现对肿瘤的早期发现、早期诊断、早期治疗，可以有效降低肿瘤发病率、减少病死人数、控制医治费用，其中早期诊断是关键。然而，肿瘤疾病早期症状不明显，实现稳定、准确、可靠的早期诊断并不容易，肿瘤标志物的发现使癌症的早期诊断成为可能。肿瘤标志物是指在肿瘤的发生和增殖过程中产生的、反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶、基因等。一般而言，肿瘤细胞越多，恶性程度越高，越晚期，肿瘤标志物的浓度越高。因此，患者血液或组织中肿瘤标志物的检测，对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、病情监测以及预后的评价具有很高价值。
目前检测肿瘤标志物的方法主要有：放射免疫分析法（RIA）、酶联免疫吸附分析法（ELISA）、化学发光免疫分析法（CLIA）、电化学免疫分析法（ECIA）、电化学发光免疫（ECLIA）和免疫电镜法等，这些方法都有一定的灵敏度和准确度，但也各有一定的不足之处：有的仪器昂贵、操作复杂、技术要求高，有的步骤繁多、易出现假阳性和假阴性，有的使用放射性试剂，有的特异性不强、灵敏度不高，有的响应时间长、无法重复测量。因此，开发灵敏、准确、快速、简便的肿瘤标志物检测方法是迫切需求。
免疫传感器是利用抗体与抗原之间的特异性识别与结合而研制成的一类生物传感器，电化学发光（ECL）免疫传感器是电化学发光和免疫传感器相结合的产物，其中无标记型电化学发光免疫传感器以具备快速、稳定、选择性强、重现性好、易于操作、步骤简单等优点被广泛运用，具有良好的应用前景。
氮化碳材料（g-C3N4）是一种类似石墨的纳米薄膜，具有比表面积大、稳定性强、硬度大、导电性好、生物相容性良好等特点，并且氮化碳材料本身具有极强的电化学发光的能力，非常适合用于开发电化学发光免疫传感器。目前未见基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、结果准确可靠、成本低、快速，且制备过程极其简单的基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器的制备方法，具体步骤如下：
（1）多功能化氮化碳材料的制备
a. 将三聚氰胺在500～600℃下加热3～5 h，真空干燥后得到氮化碳（g-C3N4）粉末；
b. 取0.8～1.5 g 氮化碳粉末加入到80～120 mL 4～6 mol/L HNO3中，于120～150℃下回流24～48小时后，自然冷却至室温，水洗涤至pH=7，离心，将沉淀在35～40℃下真空干燥12～20小时，得到羧基化的氮化碳（g-C3N4）；
c. 取0.2～0.5 g FeCl2·4H2O和0.6～1.0 g FeCl3·6H2O溶于50～100 mL除氧的二次水中，然后在氮气氛保护下逐滴加入到三口烧瓶中，磁力搅拌使其充分混合均匀，然后将25wt%～28wt%的氨水逐滴缓慢加入到三口烧瓶中直至溶液的pH为8.0～10.0，将三口烧瓶内的溶液加热到70～100℃后，于70～100℃搅拌回流1～3 h，然后停止加热在氮气氛保护下搅拌、回流冷却至室温，得到黑色沉淀物纳米四氧化三铁；将纳米四氧化三铁用水清洗至中性，定容至50 mL，超声30 min～1 h后，加入0.1～0.2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），室温下搅拌 6～8 h，得到氨基化的纳米四氧化三铁悬浊液；
d. 取150～250 µL 0.5～1.5 mg/mL羧基化的氮化碳加入150～250 µL偶联试剂后，用0.8～1.2 mol/L盐酸调pH为4.0～6.0，振摇 1～2 h，离心取沉淀加水洗涤后，再离心取沉淀加水洗涤，再次离心取沉淀加水洗涤后，定容至200～300 µL，用0.1～0.2 mol/L NaOH溶液调pH为8.0～10.0，然后加入50～100 µL 0.1～1 µg/mL肿瘤标志物抗体溶液，摇床孵育1～2 h后再加入150～250 µL氨基化的纳米四氧化三铁悬浊液，继续孵育3～5 h，再加入50～100 µL 2%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2 h，用磁铁吸引分离，水清洗至中性后，定容至100～200 µL，即得到多功能化氮化碳材料溶液；
（2）电化学发光免疫传感器的组装
a. 将直径为3～5 mm的磁性玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3抛光粉在麂皮上抛光至镜面，超声清洗2 min，然后依次用乙醇水溶液、硝酸水溶液和蒸馏水超声清洗；
b. 取5～10 µL步骤（1）所得的多功能化氮化碳材料溶液，滴在磁性玻碳电极表面，多功能化氮化碳材料即被均匀、牢固地吸附于电极表面，即得到用于检测肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器。
步骤（1）中所述的偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中得到，所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为10～100 mmol/L，所述的N-羟基琥珀酰亚胺摩尔浓度为1～10 mmol/L。
步骤（1）中所述的肿瘤标志物为：甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA)、糖类抗原15-3（CA15-3）、糖类抗原125（CA125）、糖类抗原19-9（CA19-9）或***特异性抗原（PSA）。
步骤（2）中所述的乙醇水溶液由乙醇和水按体积比1:1混合而成；所述的硝酸水溶液由硝酸和水按体积比1:1混合而成。
上述基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器用于检测肿瘤标志物的方法，具体步骤如下：将用于检测肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器浸泡在不同浓度的肿瘤标志物溶液中，于37℃下温育1 h后取出，水清洗后，作为工作电极；采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极，构成三电极体系；将三电极体系放入缓冲溶液，启动电化学反应，测量电化学发光强度；获得一系列不同浓度的肿瘤标志物溶液对应的电化学发光强度值，建立电化学发光强度值与肿瘤标志物溶液浓度之间的定量关系；根据这个定量关系检测待测样品中肿瘤标志物的浓度。
所述的缓冲溶液为：pH = 7.5～8.5的磷酸盐缓冲溶液，含有10～30 mmol/L K2S2O8和80～100 mmol/L KCl。
所述的电化学反应的条件如下：电位阶跃计时电流法，脉冲宽度：0.25秒；脉冲间隔：30秒；初始电压：0V；脉冲电压:−1.1V。
所述的肿瘤标志物为：甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA)、糖类抗原15-3（CA15-3）、糖类抗原125（CA125）、糖类抗原19-9（CA19-9）或***特异性抗原（PSA）。
发明原理：多功能化氮化碳材料，在氮化碳上同时负载有纳米四氧化三铁、肿瘤标志物抗体，具有多种功能：（1）氮化碳材料表面积大、羧基官能团多，可以负载大量的纳米四氧化三铁、肿瘤标志物抗体；（2）氮化碳材料自身具有极强的电化学发光，不需要另外标记电化学发光体，大大简化了制备步骤；（3）纳米四氧化三铁，可以使得平面结构的多功能化氮化碳材料均匀、牢固地吸附于电极表面，实现电化学发光免疫传感器的一步制备，进一步简化了传感器制备方法，且纳米四氧化三铁可以大大提高多功能化氮化碳材料的导电性，提高电化学发光性能；（4）肿瘤标志物抗体，可以特异性识别肿瘤标志物；（5）多功能化氮化碳材料，具有平面结构和良好的导电性能，在磁力吸引下完全处于电极表面的外赫姆霍兹面之内，大大增强电化学发光信号。
本发明将多功能化氮化碳材料滴涂于磁性玻碳电极表面之后，即被均匀、牢固地吸附于电极表面，构建成电化学发光免疫传感器，电化学反应激发下，多功能化氮化碳材料即会产生稳定的电化学发光；如果样品中含有肿瘤标志物，肿瘤标志物就会被电化学发光免疫传感器中的肿瘤标志物抗体俘获；肿瘤标志物是大分子蛋白，被结合到电极表面形成免疫复合物后，阻碍了电极表面的物质传递、电子传递和电化学发光，使得电化学发光强度降低；肿瘤标志物浓度越大，电化学发光强度越低，电化学发光强度与肿瘤标志物浓度的对数之间呈线性关系。据此可以实现样品中肿瘤标志物的未知浓度的检测。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
（1）高灵敏度，本发明的检测灵敏度大约是现有方法的10倍以上，原因在于：首先，传统电化学发光免疫分析方法，是将电化学发光物质标记在肿瘤标志物抗体或者纳米材料上，可以标记的数量很有限，本发明使用的氮化碳材料，自身具有极强的电化学发光；其次，纳米四氧化三铁负载在氮化碳材料上，不仅使得传感器制备更简单，更重要的是，增强了功能化氮化碳材料的导电性；再次，纳米四氧化三铁使得整个多功能化氮化碳材料完全处于电极表面的外赫姆霍兹面之内，大大提高多功能化氮化碳材料的整体电化学发光性能。
（2）高特异性，常见其他肿瘤标志物对本检测体系均无干扰。原因在于：本发明是基于肿瘤标志物抗体与肿瘤标志物之间的特异性识别与结合而构建的电化学发光免疫传感器，干扰物质不是抗体的目标物，因此待测液中的干扰物质并不能与抗体结合，故对本检测体系无干扰。
（3）结果准确，回收率均在90%～110%之间。
（4）制备与检测方法简单、快速。将多功能化氮化碳材料滴涂于磁性玻碳电极表面之后，即可一步构建成电化学发光免疫传感器，制备方法极其简单；孵育完成后，即可检测得到即时的电化学发光信号，实现定量检测。
综上所述，本发明一步制备一种基于多功能化氮化碳材料的检测肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器，兼具免疫分析的高选择性、电化学发光分析与功能化氮化碳结合的高灵敏度，具有高灵敏度、高特异性、简单、快速、易于操作等优点，可以实现对超低浓度肿瘤标志物的检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的多功能化氮化碳材料的制备流程图；
图2为不同浓度糖类抗原125的电化学发光强度(y)—浓度(x)对数线性图；
图3为不同浓度糖类抗原15-3的电化学发光强度 (y)—浓度(x)对数线性图；
图4为不同浓度糖类抗原19-9的电化学发光强度 (y)—浓度(x)对数线性图；
图5为不同浓度甲胎蛋白的电化学发光强度 (y)—浓度(x)对数线性图；
图6为不同浓度癌胚抗原的电化学发光强度 (y)—浓度(x)对数线性图；
图7为不同浓度***特异性抗原的电化学发光强度 (y)—浓度(x)对数线性图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
一种基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器的制备方法，具体步骤如下：
（1）多功能化氮化碳材料的制备，工艺流程如图1所示
a. 将三聚氰胺在500～600℃下加热3～5 h，真空干燥后得到氮化碳（g-C3N4）粉末；
b. 取0.8～1.5 g 氮化碳粉末加入到80～120 mL 4～6 mol/L HNO3中，于120～150℃下回流24～48小时后，自然冷却至室温，水洗涤至pH=7，离心，将沉淀在35～40℃下真空干燥12～20小时，得到羧基化的氮化碳（g-C3N4）；
c. 取0.2～0.5 g FeCl2·4H2O和0.6～1.0 g FeCl3·6H2O溶于50～100 mL除氧的二次水中，然后在氮气氛保护下逐滴加入到三口烧瓶中，磁力搅拌使其充分混合均匀，然后将25wt%～28wt%的氨水逐滴缓慢加入到三口烧瓶中直至溶液的pH为8.0～10.0，将三口烧瓶内的溶液加热到70～100℃后，于70～100℃搅拌回流1～3 h，然后停止加热在氮气氛保护下搅拌、回流冷却至室温，得到的黑色沉淀物纳米四氧化三铁；将纳米四氧化三铁用水清洗至中性，定容至50 mL，超声30 min～1 h后，加入0.1～0.2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），室温下搅拌 6～8 h，得到氨基化的纳米四氧化三铁悬浊液；
d. 取150～250 µL 0.5～1.5 mg/mL羧基化的氮化碳加入150～250 µL偶联试剂后，用0.8～1.2mol/L盐酸调pH为4.0～6.0，振摇 1～2 h，离心取沉淀加水洗涤后，再离心取沉淀加水洗涤，再次离心取沉淀加水洗涤后，定容至200～300 µL，用0.1～0.2mol/L NaOH溶液调pH为8.0～10.0，然后加入50～100 µL 0.1～1 µg/mL肿瘤标志物抗体溶液（抗体冻干粉溶于水配制而成），摇床孵育1～2 h后再加入150～250 µL氨基化的纳米四氧化三铁悬浊液，继续孵育3～5 h，再加入50～100 µL 2%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2 h，用磁铁吸引分离，水清洗至中性后，定容至100～200µL，即得到多功能化氮化碳材料溶液；其中偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中得到，偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为10～100 mmol/L，N-羟基琥珀酰亚胺摩尔浓度为1～10 mmol/L；
（2）电化学发光免疫传感器的组装
a. 将直径为3～5 mm的磁性玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3抛光粉在麂皮上抛光至镜面，超声清洗2 min，然后依次用乙醇水溶液（乙醇与水体积比为1:1）、硝酸水溶液（硝酸与水体积比为1:1）和蒸馏水超声清洗；
b. 取5～10 µL步骤（1）所得的多功能化氮化碳材料溶液，滴在磁性玻碳电极表面，多功能化氮化碳材料即被均匀、牢固地吸附于电极表面，即得到用于检测肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器。
上述肿瘤标志物为：甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA)、糖类抗原15-3（CA15-3）、糖类抗原125（CA125）、糖类抗原19-9（CA19-9）或***特异性抗原（PSA）。
具体实施例二
上述具体实施例一制备得到的基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器用于检测肿瘤标志物的方法，具体步骤如下：将用于检测肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器浸泡在不同浓度的肿瘤标志物溶液中，于37℃下温育1 h后取出，水清洗后，作为工作电极；采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极，构成三电极体系；将三电极体系放入缓冲溶液，启动电化学反应，测量电化学发光强度；获得一系列不同浓度的肿瘤标志物溶液对应的电化学发光强度值，建立电化学发光强度值与肿瘤标志物溶液浓度之间的定量关系；根据这个定量关系检测待测样品中肿瘤标志物的浓度。
上述缓冲溶液为：pH = 7.5～8.5的磷酸盐缓冲溶液，含有10～30 mmol/L K2S2O8和80～100 mmol/L KCl。
上述电化学反应的条件如下：电位阶跃计时电流法，脉冲宽度：0.25秒；脉冲间隔：30秒；初始电压：0V；脉冲电压：-1.1V。
上述肿瘤标志物为：甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA)、糖类抗原15-3（CA15-3）、糖类抗原125（CA125）、糖类抗原19-9（CA19-9）或***特异性抗原（PSA）。
具体实施例三
一种基于多功能化氮化碳材料的糖类抗原125（CA125）电化学发光免疫传感器的制备方法，具体步骤如下：
（1）多功能化氮化碳材料的制备
a. 将三聚氰胺在550℃下加热4h，真空干燥后得到氮化碳（g-C3N4）粉末；
b. 取1.2 g 氮化碳粉末加入到100 mL 5 mol/L HNO3中，于135℃下回流36小时后，自然冷却至室温，水洗涤至pH=7，离心，将沉淀在38℃下真空干燥16小时，得到羧基化的氮化碳（g-C3N4）；
c. 取0.35 g FeCl2·4H2O和0.8 g FeCl3·6H2O溶于75 mL除氧的二次水中，然后在氮气氛保护下逐滴加入到三口烧瓶中，磁力搅拌使其充分混合均匀，然后将26.5wt%的氨水逐滴缓慢加入到三口烧瓶中直至溶液的pH为9.0，将三口烧瓶内的溶液加热到85℃后，于85℃搅拌回流2 h，然后停止加热在氮气氛保护下搅拌回流冷却至室温，得到的黑色沉淀物纳米四氧化三铁；将纳米四氧化三铁用水清洗至中性，定容至50 mL，超声45 min后，加入0.15 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），室温下搅拌 7 h，得到氨基化的纳米四氧化三铁悬浊液；
d. 取200 µL 1.0 mg/mL羧基化的氮化碳加入200 µL偶联试剂后，用1.0 mol/L盐酸调pH为5.0，振摇 1.5 h，离心取沉淀加水洗涤后，再离心取沉淀加水洗涤，再次离心取沉淀加水洗涤后，定容至250 µL，用0.15mol/L NaOH溶液调pH为9.0，然后加入75 µL 0.5µg/mL糖类抗原125抗体溶液，摇床孵育1.5 h后再加入200 µL氨基化的纳米四氧化三铁悬浊液，继续孵育4 h，再加入75 µL 2%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1.5h，用磁铁吸引分离，水清洗至中性后，定容至150µL，即得到多功能化氮化碳材料溶液；其中偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中得到，偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为50 mmol/L，所述的N-羟基琥珀酰亚胺摩尔浓度为5 mmol/L；
（2）电化学发光免疫传感器的组装
a. 将直径为3～5 mm的磁性玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3抛光粉在麂皮上抛光至镜面，超声清洗2 min，然后依次用乙醇水溶液（乙醇与水体积比为1:1）、硝酸水溶液（硝酸与水体积比为1:1）和蒸馏水超声清洗；
b. 取8 µL步骤（1）所得的多功能化氮化碳材料溶液，滴在磁性玻碳电极表面，多功能化氮化碳材料即被均匀、牢固地吸附于电极表面，即得到用于检测糖类抗原125的电化学发光免疫传感器。
将用于检测糖类抗原125的电化学发光免疫传感器浸泡在不同浓度的糖类抗原125溶液中，于37℃下温育1 h后取出，水清洗后，作为工作电极；采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极，构成三电极体系；将三电极体系放入缓冲溶液，启动电化学反应，测量电化学发光强度；获得一系列不同浓度的糖类抗原125溶液对应的电化学发光强度值，建立电化学发光强度值与糖类抗原125溶液浓度之间的定量关系；根据这个定量关系检测待测样品中糖类抗原125的浓度。图3 不同浓度CA125的ECL信号(y)—浓度(x)对数线性关系如图2所示。线性线性方程为： y=-1635.66*logx+1839.02，相关系数R 2=0.9932；线性范围为0.001～10 U/mL，检测限为0.3 mU/mL，线性良好，可用于检测待测样品中糖类抗原125的浓度。
具体实施例四
同上述具体实施例三，其区别在于：
步骤（1）多功能化氮化碳材料的制备中：
a. 将三聚氰胺在500℃下加热5 h，真空干燥后得到氮化碳粉末；
b. 取0.8 g 氮化碳粉末加入到80 mL 6 mol/L HNO3中，于120℃下回流48小时后，自然冷却至室温，水洗涤至pH=7，离心，将沉淀在35℃下真空干燥20小时，得到羧基化的氮化碳；
c. 取0.2 g FeCl2·4H2O和0.6 g FeCl3·6H2O溶于50 mL除氧的二次水中磁力搅拌使其充分混合均匀，然后将25wt%的氨水逐滴缓慢加入到三口烧瓶中直至溶液的pH为8.0，将三口烧瓶内的溶液加热到70℃后，于70℃搅拌回流3 h；将得到纳米四氧化三铁用水清洗至中性，定容至50 mL，超声30 min后，加入0.1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌 6 h，得到氨基化的纳米四氧化三铁悬浊液；
d. 取150 µL 1.5 mg/mL羧基化的氮化碳加入150 µL偶联试剂后，用0.8mol/L盐酸调pH为6.0，振摇 1h；离心洗涤后定容至200 µL，用0.1mol/L NaOH溶液调pH为8.0，然后加入50 µL 1 µg/mL CA125抗体溶液，摇床孵育1h后再加入150 µL氨基化的纳米四氧化三铁悬浊液，继续孵育3 h，再加入50 µL牛血清白蛋白溶液继续孵育1 h，用磁铁吸引分离，水清洗至中性后，定容至100µL，即得到多功能化氮化碳材料溶液；其中偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为10 mmol/L，所述的N-羟基琥珀酰亚胺摩尔浓度为10 mmol/L；
步骤（2）电化学发光免疫传感器的组装中取5 µL多功能化氮化碳材料溶液，滴在磁性玻碳电极表面。
具体实施例五
同上述具体实施例三，其区别在于：
步骤（1）多功能化氮化碳材料的制备中：
a. 将三聚氰胺在600℃下加热3 h；
b. 取1.5 g 氮化碳粉末加入到120 mL 4 mol/L HNO3中，于150℃下回流24小时；将沉淀在40℃下真空干燥12小时；
c. 取0.5 g FeCl2·4H2O和1.0 g FeCl3·6H2O溶于100 mL除氧的二次水中；将28wt%的氨水逐滴缓慢加入到三口烧瓶中直至溶液的pH为10.0，将三口烧瓶内的溶液加热到100℃后，于100℃搅拌回流1 h；将得到纳米四氧化三铁用水清洗至中性定容，超声1 h后，加入0.2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌 8 h；
d. 取250 µL 0.5 mg/mL羧基化的氮化碳加入250 µL偶联试剂后，用1.2mol/L盐酸调pH为4.0，振摇 2 h；离心洗涤定容至300 µL，用0.2mol/L NaOH溶液调pH为10.0，然后加入100 µL 0.1µg/mL CA125抗体溶液，摇床孵育2 h后再加入250 µL氨基化的纳米四氧化三铁悬浊液，继续孵育5 h，再加入100 µL牛血清白蛋白溶液继续孵育2 h，用磁铁吸引分离水清洗至中性后，定容至200µL，即得到多功能化氮化碳材料溶液；其中偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为100 mmol/L，所述的N-羟基琥珀酰亚胺摩尔浓度为1 mmol/L；
步骤（2）电化学发光免疫传感器的组装中取10 µL多功能化氮化碳材料溶液，滴在磁性玻碳电极表面。
具体实施例六
基于多功能化氮化碳材料的糖类抗原15-3（CA15-3）电化学发光免疫传感器，其具体制备方法同上述具体实施例三，其区别在于：肿瘤标志物为糖类抗原15-3，不同浓度CA15-3的ECL信号(y)—浓度(x)对数线性关系如图3所示，线性方程为：y=-1603.51*logx+1903.56，相关系数R 2=0.9989，线性范围为0.001～10 U/mL，检测限为0.3 mU/mL。线性良好，可用于检测待测样品中糖类抗原15-3的浓度。
具体实施例七
基于多功能化氮化碳材料的糖类抗原19-9（CA19-9）电化学发光免疫传感器，其具体制备方法同上述具体实施例三，其区别在于：肿瘤标志物为糖类抗原19-9（CA19-9），不同浓度糖类抗原19-9的ECL信号(y)—浓度(x)对数线性关系如图4所示，线性方程为：y=-1739.39*logx+1860.24，相关系数R 2=0.9984，线性范围为0.001～10 U/mL，检测限为0.3 mU/mL。线性良好，可用于检测待测样品中糖类抗原19-9的浓度。
具体实施例八
基于多功能化氮化碳材料的甲胎蛋白（AFP）电化学发光免疫传感器，其具体制备方法同上述具体实施例三，其区别在于：肿瘤标志物为甲胎蛋白，不同浓度甲胎蛋白的ECL信号(y)—浓度(x)对数线性关系如图5所示，线性方程为：y=-1994.52*logx+4782.94，相关系数R 2=0.9905，线性范围为0.01～10 ng/mL，检测限为3 pg/mL。线性良好，可用于检测待测样品中甲胎蛋白（AFP）的浓度。
具体实施例九
基于多功能化氮化碳材料的癌胚抗原（CEA)电化学发光免疫传感器，其具体制备方法同上述具体实施例三，其区别在于：肿瘤标志物为癌胚抗原（CEA)，不同浓度CEA的ECL信号(y)—浓度(x)对数线性关系如图6所示，线性方程为：y=-1995.52*logx+2049.94,相关系数R 2=0.9805，线性范围为0.01～10 ng/mL，检测限为3 pg/mL。线性良好，可用于检测待测样品中癌胚抗原的浓度。
具体实施例十
基于多功能化氮化碳材料的***特异性抗原（PSA）电化学发光免疫传感器，其具体制备方法同上述具体实施例三，其区别在于：肿瘤标志物为***特异性抗原（PSA），不同浓度PSA的ECL信号(y)—浓度(x)对数线性关系如图7所示，线性方程为：y=-3338.80*logx+4993.87，相关系数R 2=0.9945，线性范围为0.01～10 ng/mL，检测限为3 pg/mL。线性良好，可用于检测待测样品中***特异性抗原的浓度。
具体实施例十一
将具体实施例三制备的基于多功能化氮化碳材料的糖类抗原125（CA125）电化学发光免疫传感器，分别测定10ng/mL的AFP、CEA、PSA和10 U/mL CA15-3、CA19-9，对应的电化学发光强度在7000以上，与空白值大致相当；而测定10-2 U/mL的CA125，对应的电化学发光强度明显降低，在3000左右，结果表明：选择性良好，常见其它肿瘤标志物无显著性干扰。
同理选取甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA)、糖类抗原15-3（CA15-3）、糖类抗原125（CA125）、糖类抗原19-9（CA19-9）或***特异性抗原（PSA）七种肿瘤标志物来验证上述具体实施例六-十的电化学发光免疫传感器均选择性良好，常见其它肿瘤标志物无显著性干扰。
具体实施例十二
取空白血清样品，采用标准加入法分别配制了不同浓度的肿瘤标志物溶液，按照发明具体实施例三、六、十中的具体实验步骤构建电化学发光传感器并对加标样品按具体实施例二方法进行了检测。检测结果如表1所示，
表1人血清中多种肿瘤标志物的检测结果
由表1检测结果可知，结果的相对标准偏差（RSD）小于7.5%，回收率为96.6～102%，表明本发明对于血清中多种肿瘤标志物的检测精密度高，结果准确可靠。
以上结果说明，本发明构建的检测肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器，灵敏度高、检测限低、选择性高、操作简单、结果准确可靠。只需改变本电化学发光免疫传感器中的抗体，即可实现对不同目标肿瘤标志物的高灵敏度、特异性检测。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）多功能化氮化碳材料的制备
a. 将三聚氰胺在500～600℃下加热3～5 h，真空干燥后得到氮化碳粉末；
b. 取0.8～1.5 g 氮化碳粉末加入到80～120 mL 4～6 mol/L HNO3中，于120～150℃下回流24～48小时后，自然冷却至室温，水洗涤至pH=7，离心，将沉淀在35～40℃下真空干燥12～20小时，得到羧基化的氮化碳；
c. 取0.2～0.5 g FeCl2·4H2O和0.6～1.0 g FeCl3·6H2O溶于50～100 mL除氧的二次水中，然后在氮气氛保护下逐滴加入到三口烧瓶中，磁力搅拌使其充分混合均匀，然后将25wt%～28wt%的氨水逐滴缓慢加入到三口烧瓶中直至溶液的pH为8.0～10.0，将三口烧瓶内的溶液加热到70～100℃后，于70～100℃搅拌回流1～3 h，然后停止加热在氮气氛保护下搅拌回流冷却至室温，得到黑色沉淀物纳米四氧化三铁；将纳米四氧化三铁用水清洗至中性，定容至50 mL，超声30 min～1 h后，加入0.1～0.2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌 6～8 h，得到氨基化的纳米四氧化三铁悬浊液；
d. 取150～250 µL 0.5～1.5 mg/mL羧基化的氮化碳加入150～250 µL偶联试剂后，用0.8～1.2 mol/L盐酸调pH为4.0～6.0，振摇 1～2 h，离心取沉淀加水洗涤后，再离心取沉淀加水洗涤，再次离心取沉淀加水洗涤后定容至200～300 µL，用0.1～0.2 mol/L NaOH溶液调pH为8.0～10.0，然后加入50～100 µL 0.1～1 µg/mL肿瘤标志物抗体溶液，摇床孵育1～2 h后再加入150～250 µL氨基化的纳米四氧化三铁悬浊液，继续孵育3～5 h，再加入50～100 µL 2%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2 h，用磁铁吸引分离，水清洗至中性后，定容至100～200 µL，即得到多功能化氮化碳材料溶液；
（2）电化学发光免疫传感器的组装
a. 将直径为3～5 mm的磁性玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3抛光粉在麂皮上抛光至镜面，超声清洗2 min，然后依次用乙醇水溶液、硝酸水溶液和蒸馏水超声清洗；
b. 取5～10 µL步骤（1）所得的多功能化氮化碳材料溶液，滴在磁性玻碳电极表面，多功能化氮化碳材料，即得到用于检测肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中得到，所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为10～100 mmol/L，所述的N-羟基琥珀酰亚胺摩尔浓度为1～10 mmol/L。
3.根据权利要求1所述的基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的肿瘤标志物为：甲胎蛋白、癌胚抗原、糖类抗原15-3、糖类抗原125、糖类抗原19-9或***特异性抗原。
4.根据权利要求1所述的基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的乙醇水溶液由乙醇和水按体积比1:1混合而成；所述的硝酸水溶液由硝酸和水按体积比1:1混合而成。
5.一种根据权利要求1-3中任一项所述的基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器用于检测肿瘤标志物的方法，其特征在于具体步骤如下：将用于检测肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器浸泡在不同浓度的肿瘤标志物溶液中，于37℃下温育1 h后取出，水清洗后，作为工作电极；采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极，构成三电极体系；将三电极体系放入缓冲溶液，启动电化学反应，测量电化学发光强度；获得一系列不同浓度的肿瘤标志物溶液对应的电化学发光强度值，建立电化学发光强度值与肿瘤标志物溶液浓度之间的定量关系；根据这个定量关系检测待测样品中肿瘤标志物的浓度。
6.根据权利要求5所述的基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器用于检测肿瘤标志物的方法，其特征在于所述的缓冲溶液为：pH = 7.5～8.5的磷酸盐缓冲溶液，含有10～30 mmol/L K2S2O8和80～100 mmol/L KCl。
7.根据权利要求5所述的基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器用于检测肿瘤标志物的方法，其特征在于所述的电化学反应的条件如下：电位阶跃计时电流法，脉冲宽度：0.25秒；脉冲间隔：30秒；初始电压：0V；脉冲电压：-1.1V。
8.根据权利要求5所述的基于多功能化氮化碳材料的肿瘤标志物电化学发光免疫传感器用于检测肿瘤标志物的方法，其特征在于所述的肿瘤标志物为：甲胎蛋白、癌胚抗原、糖类抗原15-3、糖类抗原125、糖类抗原19-9或***特异性抗原。
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