CN104651529A

CN104651529A - 一种检测核酸分子缺失突变的方法

Info

Publication number: CN104651529A
Application number: CN201510128081.8A
Authority: CN
Inventors: 黄秋英; 李庆阁
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2015-03-24
Filing date: 2015-03-24
Publication date: 2015-05-27

Abstract

本发明涉及一种检测核酸分子缺失突变的方法，尤其涉及一种通过探针熔解曲线检测核酸分子缺失突变的方法，以及用于检测核酸分子缺失突变的反应体系和试剂盒。本发明提供的检测方法准确稳定、快速简便、无需PCR后处理，克服了现有技术中操作繁琐、耗时长、易污染及检测通量不能满足常规需求等缺点，具有很好的应用前景。

Description

一种检测核酸分子缺失突变的方法

技术领域

本发明涉及一种检测核酸分子缺失突变的方法，尤其涉及一种通过探针熔解曲线检测核酸分子缺失突变的方法，以及用于检测核酸分子缺失突变的反应体系和试剂盒。

背景技术

缺失突变是指染色体或DNA或RNA序列发生部分丢失的一种突变，可以造成遗传物质的丢失。缺失突变可以是不同数量的核苷酸的缺失，可以从只有单个碱基缺失到整个染色体片段的缺失。狭义的缺失突变指核酸分子较长片段的缺失，不包括单个碱基及少数几个碱基的缺失。缺失突变常造成遗传物质的丢失，往往直接导致所编码蛋白表达量及表达水平的变化，从而导致一系列生物学效应。缺失突变所导致的生物学效应，涉及到疾病发病机制分析、疾病诊断标志物、药物敏感性、药物治疗靶点等领域。

检测核酸分子缺失突变的方法已有很多，传统的包括Southern杂交法、荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization,FISH)，上述两种方法在早期对基因缺失的发现、缺失类型的鉴定等起了重要的作用，但是由于其具有操作步骤繁琐、费时费力、成本较高、对实验人员要求高等缺点，不适合用于临床上常规的缺失突变检测。目前用于检测缺失突变的主要技术是跨越断裂点PCR(gap-PCR)技术，该技术采用跨越断裂点的引物，通过PCR扩增之后琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的有无及片段长度的大小来判定是否含有缺失及缺失的类型。该技术在临床上得到比较广泛的应用，但需要PCR之后的电泳分析，操作步骤较多，且易造成PCR产物污染，造成假阳性的发生。近年来发展的MLPA(多重连接依赖的探针扩增，Multiplex ligation-dependent Probeamplification)技术，可在一个反应中同时检测多个核酸片段的缺失和重复，在临床上也得到较大的认可，但其检测成本高、操作繁琐、需要特殊的仪器设备等限制，不适合临床常规使用。因此，开发一种准确稳定、快速简便、无需PCR后处理的缺失突变检测技术，成为当前的迫切需要。

发明内容

本发明的发明人经过大量实验和反复摸索，开发出一种基于荧光探针熔解曲线分析技术的核酸分子缺失突变的检测方法，并进一步提供了基于该检测方法的反应体系和试剂盒，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及一种检测核酸分子是否存在缺失突变的方法，其包括以下1)～4)项：

1)根据核酸分子缺失的断裂点位置，设计荧光探针，使荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间的匹配程度具有差异,从而具有不同的熔点(Tm)值；

2)设计扩增核酸的引物组，该引物组既能扩增野生型核酸分子，又能扩增存在缺失突变的核酸分子，且扩增的产物包括核酸分子与荧光探针的结合区域；

3)以待检核酸样本为模板，利用步骤1)和2)设计的探针和引物组，进行PCR扩增和熔解曲线分析；

4)根据熔解曲线分析中是否有相应的熔解峰和/或熔点(Tm)值的高低来判定是否存在核酸缺失突变，以及任选地判断缺失突变的类型。

在本发明的实施方案中，其中所述核酸为核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。

在本发明的实施方案中，其中所述缺失突变是指15nt以上的寡核苷酸片段的缺失，例如是指100nt以上的寡核苷酸片段的缺失。

在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针选自自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标、只标记荧光基团的寡核苷酸探针(如HyBeacon探针)、荧光标记探针结合荧光嵌入染料、荧光标记探针结合荧光淬灭染料。

在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间的熔点(Tm)值相差2℃以上，例如为3℃以上，5℃以上，10℃以上，15℃以上。

在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间匹配程度具有差异,这种差异可以是在荧光探针5′末端与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间匹配程度有差异，或荧光探针3′末端与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间匹配程度有差异。

在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针为一种或多种。

在本发明的实施方案中，其中所述引物组的上、下游引物中有一种引物相对过量(上游引物过量或下游引物过量)。

在本发明的实施方案中，其中所述过量的引物与未过量的引物之间的数量比例为(2～100):1，例如为(4～50):1，例如为(5～20):1，例如为(5～10):1。

在本发明的实施方案中，其中所述引物组对野生型核酸分子和存在缺失突变的核酸分子扩增所得到的主要双链产物大小相近，例如为适合PCR扩增和/或检测的长度，例如为100-400bp。

在本发明的实施方案中，其中所述的引物组包含一种上游引物和一种下游引物。在本发明的实施方案中，当缺失突变的长度小于200bp～300bp时，可以采用这种引物设计方式。

在本发明的实施方案中，其中所述的引物组包含一种上游引物和两种下游引物，其中的一种下游引物位于缺失突变区域，即该引物可以和缺失突变区域结合；

或者所述的引物组包含两种上游引物和一种下游引物，其中的一种上游引物位于缺失突变区域，即该引物可以和缺失突变区域结合；

在本发明的实施方案中，当缺失突变的长度大于200bp～300bp时，可以采用这种多引物设计方式。

在本发明的实施方案中，所述方法还包含加入其它核酸扩增反应的必须组分的步骤，例如包括加入耐高温核酸聚合酶，单核苷酸，缓冲溶液，金属离子，合适酸度的缓冲液等的步骤。这些组分的选择、浓度的设定以及反应程序等均为本领域所公知。

本发明第二方面涉及一种检测核酸分子是否存在缺失突变的反应体系，其含有至少一种待测核酸分子、至少一种荧光探针、和至少一对引物组，其中：

所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间具有不同的熔点(Tm)值，

所述引物组既能扩增野生型核酸分子，又能扩增存在缺失突变的核酸分子，且扩增的产物包括核酸分子与荧光探针的结合区域。

在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针选用自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标、只标记荧光基团的寡核苷酸探针(如HyBeacon探针)、荧光标记探针结合荧光嵌入染料、荧光标记探针结合荧光淬灭染料。

在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针为一种或多种。

在本发明的实施方案中，所述引物组对野生型核酸分子和存在缺失突变的核酸分子扩增所得到的主要双链产物大小相近，例如为适合PCR扩增和/或检测的长度，例如为100-400bp。

在本发明的实施方案中，其中所述的一对引物组包含一种上游引物和一种下游引物。

在本发明的实施方案中，其中所述的一对引物组包含一种上游引物和两种下游引物，其中的一种下游引物位于缺失突变区域，即该引物可以和缺失突变区域结合；

或者所述的引物组包含两种上游引物和一种下游引物，其中的一种上游引物位于缺失突变区域，即该引物可以和缺失突变区域结合。

在本发明的实施方案中，所述反应体系还包含任选的其它核酸扩增反应的必须组分，例如包括耐高温核酸聚合酶，单核苷酸，缓冲溶液，金属离子，合适酸度的缓冲液等。这些组分的选择、浓度的设定以及反应程序等均为本领域所公知。

本发明第三方面涉及一种检测核酸分子是否存在缺失突变的试剂盒，其含有至少一种荧光探针、和至少一对引物组，其中：

在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针为一种或多种。

在本发明的实施方案中，中所述引物组对野生型核酸分子和存在缺失突变的核酸分子扩增所得到的主要双链产物大小相近，例如为适合PCR扩增和/或检测的长度，例如为100-400bp。

在本发明的实施方案中，所述试剂盒还包含任选的其它核酸扩增反应的必须组分，例如包括耐高温核酸聚合酶，单核苷酸，缓冲溶液，金属离子，合适酸度的缓冲液等。这些组分的选择、浓度的设定等均为本领域所公知。

本发明还涉及本发明第二方面任一项的反应体系、或第三方面任一项的试剂盒用于检测核酸分子是否存在缺失突变的用途。

以下对本发明做进一步描述。

在本发明中，所述缺失突变是指较长核酸片段的缺失，不包括单个核苷酸或几个核苷酸的缺失，一般指15nt以上的寡核苷酸片段的缺失，尤其是100nt以上的寡核苷酸片段的缺失。在本发明的实施方案中，所述缺失突变包含了从十几个(16个)碱基到几万个(20.5k个)碱基的缺失突变。

在本发明中，所述核酸分子的缺失突变是指断裂点位置已知且相对固定的缺失突变；根据该已知缺失突变，设计相应的荧光探针和引物组。

在本发明中，所述断裂点位置是指缺失型核酸分子中所缺失序列的5’端第一个核苷酸和/或3’端最后一个核苷酸的位置，或者野生型核酸分子中与之相对应的位置。

在本发明中，所述断裂点位置已知的缺失突变既包括已知该缺失突变的确切的断裂点位置的情况，也包括已知该缺失突变的大概的断裂点位置的情况，可以围绕该大概的断裂点位置设计引物，进行扩增，并且扩增产物之间具有可识别的熔解峰和/或Tm值。

本发明的方法既可以用于检测纯合型缺失突变，也可以用于检测杂合型缺失突变，即可以用于基因分型。

如果适当的话，本文所用“核苷酸”或“碱基”可互换使用，可经过修饰或未经修饰。

在本发明中，所述熔解曲线分析，就是在PCR扩增程序后增加一个升温步骤(有时也可以是降温步骤)，通过记录荧光随着温度的变化，检测扩增产物信息。目前的熔解曲线分析包括了三种类型，分别是荧光染料法、荧光探针法和荧光染料联合荧光探针法。本发明提供的方法适用于荧光探针法和荧光染料联合荧光探针法这两种类型。

其中，荧光探针法就是使用荧光探针来检测特定位置的缺失突变，前提是荧光探针与靶序列杂交后可以产生特异的荧光信号，这类探针在实时PCR中有很多种，其中用于熔解曲线分析的探针包括自淬灭荧光探针(中国专利ZL 201080023112.9；美国专利，US 8,691,504 B2),荧光能量共振转移探针(FRET探针，又称LightCycler^TM探针、相邻探针)(美国专利,US 7,160,998 B2；美国专利,US 6,472,156 B1；美国专利,US 6,140,054)，其它使用包括单标记的寡核苷酸探针(美国专利,US 6,635,427 B2)、HyBeacon(美国专利,US 2008/0311579 A1)探针等。

荧光染料联合荧光探针法就是同时加入荧光增敏或者荧光淬灭染料和荧光探针的方法，利用其中的荧光探针来检测特定位置的缺失突变，比如所谓的诱导荧光能量共振转移iFRET技术(美国专利,US7,179,589 B2)，就是加入荧光嵌入染料的同时再加入单标记的荧光探针，荧光嵌入染料结合双链DNA发出的荧光通过能量转移的方式可以增加荧光标记探针的荧光，温度升高使得探针脱离靶序列，增敏荧光降低。Gupta等人(美国专利,US 2007/0020665 A1)公布了一种丙型肝炎病毒分型的方式，则是在PCR反应中同时加入荧光淬灭染料和荧光标记探针，杂交后发生荧光淬灭，温度升高使得探针脱离靶序列，淬灭的荧光得以恢复而会使荧光增加。

所述的熔解曲线分析一般可以包括，在核酸扩增后，与靶序列结合的探针，在温度升高过程中脱离靶序列并引起荧光强度变化，通过实时检测这一个过程中荧光强度随温度的变化，获得荧光强度变化速率为纵坐标，温度为横坐标的熔解曲线，利用该熔解曲线可以检测靶序列的缺失情况。上述熔解曲线分析也可以按另一种降温的方式获得，也就是从高温到低温，检测荧光的变化。通过数据处理进行熔解曲线分析。

本发明的基本原理如下：

尽管下文描述了本发明假设的原理，但是，本发明的范围并不受到这些原理的限制。

在核酸分子(例如DNA)热变性过程中，有50％核酸分子(例如DNA)变性解链时的温度称为双链DNA的解链温度，又称熔解温度或熔点(Tm)。在溶剂固定的前提下，双链核酸分子(例如DNA)的Tm值是固定不变的。当核酸分子(例如DNA)双链完全互补时，形成的双链结构较为稳定，使核酸分子(例如DNA)双链解开所需温度较高，故Tm值也较高；核酸分子(例如DNA)双链不完全互补时，形成的双链结构较不稳定，使双链解开所需温度较低，故Tm值也较低，而且Tm值降低的程度也是依赖不完全互补的具体序列的。

基于上述理论，探针与靶杂交形成双链结构，与完全匹配的靶杂交，则形成的双链结构的Tm值较高，若与不完全匹配的靶杂交时，形成的双链结构Tm值较低。因此，若能检测到探针Tm值的变化，就能判断靶核酸序列是否存在缺失突变，乃至缺失突变的具体类型。

荧光标记的探针要用于核酸序列缺失突变检测优选需要满足以下三个条件：一是探针与靶序列杂交前后必须有荧光强度的变化；二是探针在扩增过程中必须保持完整，以用于扩增后的熔解曲线分析；三是探针不能有过强的特异性，否则含有不匹配序列的核酸序列不易与探针杂交。

对荧光探针在熔解曲线分析过程中进行荧光信号的检测，就能观察到探针与靶的杂交和解离过程，形成荧光强度随着温度变化而变化的曲线，即探针的熔解曲线，对熔解曲线求导分析，就可以找到荧光变化最强的点，对应的温度即是探针的Tm值。探针与完全匹配的靶杂交时形成的双链结构Tm值最高，与具有不同缺失突变的靶杂交时形成的双链Tm较低，不同的缺失突变类型则可以形成不同的Tm值。

因此，根据本发明，采用熔解曲线，可以获得探针与待测核酸之间杂交体的熔点，根据该熔点，可以检测待测核酸的缺失突变。

或者，优选地，根据本发明，采用熔解曲线，可以获得探针与待测核酸之间杂交体以及探针与参照核酸之间杂交体的熔点，根据这两个熔点的差异，可以检测待测核酸的缺失突变。参照核酸可以是例如野生型核酸。

在本发明的实施方案中，可以在反应体系或试剂盒中加入野生型或缺失突变型核酸分子的参照序列。当与野生型核酸分子具有相同的Tm值或熔解峰时，则认定其为野生型序列；当与缺失突变型核酸分子具有相同的Tm值或熔解峰时，则认定其为纯合型缺失突变型序列；当同时含有上述两种熔解峰和两个Tm值时，认定其为杂合型缺失突变。

或者在不含有上述参照序列时，也可以根据实验前预测得到的Tm值和熔解峰的位置对结果进行判定。

所述的熔点(Tm值)或退火温度可以在实验前利用本领域公知的方法预测获得，例如通过DNAMAN、TM Utility、Primer 5.0等软件计算得到。

在本发明中，所述荧光探针优选与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，其包括但不限于自淬灭探针(例如参见中国发明专利ZL 201080023112.9)、相邻探针(例如参见Bernard P.S.,et al,American Journal of Pathology,1998；153(4):1055-1061.)、容忍型分子信标(例如参见Hiyam H.EI-Hajj,et al,Journal of ClinicalMicrobiology,2009；47(4):1190-1198.)、只标记荧光基团的寡核苷酸探针如HyBeacon探针(例如参见French D.J.,et al,Molecular and CellularProbes,2001；15(6):363-374.)、荧光标记探针结合荧光嵌入染料、荧光标记探针结合荧光淬灭染料(例如参见Gupta A.P.et al,US patentapplication,US 2007/0020664 A1.)。

在本发明的实施方案中，所述荧光探针为自淬灭探针。

所述的自淬灭探针一般指的是，探针的一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团的寡核苷酸探针。该探针和靶核酸序列杂交时荧光强度增加。可在所述探针的5'末端标记荧光基团而在3'末端标记淬灭基团，或可在所述探针的3'末端标记荧光基团而在5'末端标记淬灭基团。当所述探针单独存在时，所述荧光基团与所述淬灭基团彼此接近而相互作用致所述荧光基团发出的荧光被所述淬灭基团吸收而使探针荧光减弱，而当所述探针与其靶核酸序列杂交时，所述荧光基团与所述淬灭基团相互分离致所述荧光基团发出的荧光不能被所述淬灭基团吸收而使探针荧光增强。

本发明所用探针的序列包含如下序列：该序列既可以与野生型核酸分子杂交，也可以与发生缺失突变的核酸分子杂交，但两者形成的双链杂交体之间具有可区分的熔点差异(例如熔点差异在2℃以上，例如在3℃以上，例如在4℃以上，例如在5℃以上，例如在10℃以上，例如在15℃以上)。

所述探针的序列例如可以为野生型靶核酸序列的完全互补序列，或，与野生型靶核酸序列的完全互补序列相比有若干(例如1－10个，1-5个，1-4个，1-3个，1-2个，1个或2个)错配，例如具有一个或多个(例如1－10个，1-5个，1-4个，1-3个，1-2个，1个或2个)单碱基的转换、颠换、***和/或缺失的序列。在本发明的实施方案中，所述探针的序列在其5’端或3’端有若干个(例如1－10个，1-5个，1-4个，1-3个，1-2个，1个或2个)碱基与具有缺失突变的核酸分子序列不互补，这种不互补可以导致熔点的差异。

或者所述探针的序列也可以设计为与具有缺失突变的靶核酸序列完全互补的序列，或与具有缺失突变的靶核酸序列的完全互补序列相比有若干(例如1－10个，1-5个，1-4个，1-3个，1-2个，1个或2个)错配，例如具有一个或多个(例如1－10个，1-5个，1-4个，1-3个，1-2个，1个或2个)单碱基的转换、颠换、***和/或缺失的序列。在本发明的实施方案中，所述探针的序列在其5’端或3’端有若干个(例如1－10个，1-5个，1-4个，1-3个，1-2个，1个或2个)碱基与具有野生型的核酸分子序列不互补，这种不互补可以导致熔点的差异。

本发明所用探针的序列可以完全是或者包含有与其靶序列的互补序列，或可以是与所述靶核酸序列的完全互补序列相比具有一个或多个单碱基的转换、颠换、***或缺失的序列。

本发明所用的荧光探针既可以根据断裂点位置的5’端设计，也可以根据断裂点位置的3’端设计。即荧光探针既可以设计为与断裂点位置5’端附近的序列杂交，也可以设计为与断裂点位置3’端附近的序列杂交。

所说的自淬灭探针是一条寡核苷酸探针或DNA类似物探针，其本身的熔点应该不低于引物熔点，长度一般为10-100个碱基，优选的是20-60个碱基。

所说的自淬灭探针在结构上可以是单链线性的，但也可以包含二级结构尤其是发夹结构，发夹结构既可以是天然发夹结构探针也可以是人工发夹结构，但多数是人工发夹结构探针，即通过在探针末端人为添加靶序列无关碱基形成人工发夹结构。添加这种靶序列无关碱基的规则是，所形成的发夹结构中的臂序列中有部分或者全部碱基与靶列互补，并且形成的臂长一般优选在2-15个碱基，优选3-7个碱基之间，更优选的是4－7个或4-6个碱基之间。这样做的目的是保证发夹结构与靶序列之间杂交有足够高的效率，使之可以有效用地于熔解曲线分析。使用发夹探针进行熔解曲线分析的好处是，在多数情况下，同样的反应条件下，发夹探针比线性探针更好地耐受酶切，而且发夹探针的背景信号比线性探针更低。

所说的荧光基团包括目前各种荧光标记物，如ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXASRED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705等。

所说的淬灭基团包括目前各种淬灭剂，如DABCYL、BHQ类(如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA等。

所说的自淬灭探针一般由普通碱基组成，但是其中也可以包含特殊修饰的碱基。这些特殊修饰的碱基可以帮助调节探针的结合能力，例如增强探针结合能力或者削弱结合能力，增加熔解曲线分析的灵活性。比如能够增强探针结合能力的特殊修饰碱基如锁定核酸(即lockednucleic acids，缩写为LNA)碱基等，能够削弱结合能力的通用结合碱基I等。因此，在一个实施方案中，本发明的探针可由未经修饰的碱基组成。在一个优选实施方案中，对探针的碱基进行修饰。在一个优选实施方案中，本发明的探针包含能增强或减弱探针结合能力的碱基。又在一个优选实施方案中，所述能增强探针结合能力的碱基包括锁定核酸碱基。还在一个优选实施方案中，所述能减弱探针结合能力的碱基包括通用结合碱基I。

在优选实施方案中，所说的自淬灭探针在使用具有5′→3′核酸外切酶活性的DNA聚合酶进行PCR扩增时，探针可以进行抵抗DNA聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性的修饰；在使用具有3′→5′核酸外切活性的DNA聚合酶进行PCR扩增时，探针可以进行抵抗DNA聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性的修饰。这样在整个扩增反应中，探针的完整性得以保持，可以发生后续的杂交反应和熔解曲线分析。

所说的能够抵抗DNA聚合酶5′→3′核酸外切酶活性的修饰，优选的方式是使探针的5′端能抗核酸聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性，修饰方式包括修饰5′端碱基之间的连接，采用修饰的碱基衍生物(如使用锁定核酸LNA)或者是增加化学功能团等。一种优选的方式是修饰5′端碱基之间的连接，例如采用硫代磷酸化(phosphorothioate)连接，甲基磷酸键(methylphosphonate)连接，硼酸磷酸(boranophosphate)化连接，肽核酸(peptide nucleic acid)连接等抗核酸外切活性的连接。优选的方式是采用硫代磷酸化连接修饰，这种修饰位于于5′端的第一个碱基和第二个碱基之间。

所说能够抵抗DNA聚合酶5′→3′核酸外切酶活性的修饰，优选的方式是使探针的3′端能抗核酸聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性，修饰方式包括修饰3′端碱基之间的连接，采用修饰的碱基衍生物(如使用锁定核酸)，或者是增加化学功能团等。一种优选的方式是修饰3′端碱基之间的连接，例如采用硫代磷酸化连接，甲基磷酸键连接，硼酸磷酸化连接,肽核酸连接等抗核酸外切活性的连接。优选的方式是采用硫代磷酸化连接修饰，而且这种修饰位于3′端的第一个碱基和第二个碱基之间。

在本发明的实施方案中，采用有利于实现熔解曲线分析的扩增条件，优选包括如下的一种或者几种：

1)使用不对称PCR，即反应过程中，一种引物相对过量，它所延伸产生的链与探针杂交；其延伸产物与探针杂交的引物一般是另一条引物的2-100之间，优选的是2-50倍之间；

2)保证扩增后探针得以完整保存的条件，因为探针都是在扩增之前预先加入到反应管内，例如PCR扩增使用没有外切活性或者外切活性很低的耐热核酸聚合酶；探针本身带有能够抵抗DNA聚合酶的核酸外切酶活性的化学修饰；

比如，在探针本身不具备抵抗酶的5’-外切酶和3’-外切酶活性的能力时，就可以采用不具备5′-外切酶和3′-外切酶活性的耐热核酸聚合酶，如KlentTaq,或者采用5′-外切酶活性很低并且缺乏3′-外切酶活性的耐热核酸聚合酶，如TaqFS。具备上述性质的酶很多，具体实验都可以参考上述要求加以选择；

和/或

4)探针采用发夹结构，既可以是天然发夹结构探针也可以是人工发夹结构，但多数是人工发夹结构探针，即通过在探针末端人为添加靶序列无关碱基形成人工发夹结构。添加这种靶序列无关碱基的规则是，所形成的发夹结构中的臂序列中有部分或者全部碱基与靶列互补，并且形成的臂长一般优选在2-15个碱基，优选3-7个碱基之间，更优选的是4－7个或4-6个碱基之间。

本发明的探针的长度一般是5－100个碱基，例如10－100个，10-50个，15到50个，20到50个，10－40个碱基，再例如10－20，20－30，30－40，15－30，20－40个，15－25个。

本发明既可以用于待测样本单一位点的核酸缺失突变的检测，也可以用于待测样本多位点多个缺失突变的的同时检测。当用于检测具有多位点多个缺失突变的样本或者具有不同种突变的不同来源的样本时，可以采用两个或两个以上的探针，即针对每个缺失突变区域设计并制备相应的探针及引物组，并对每条探针标记不同的荧光基团，而实现各自探针的彼此区分；也可通过使用相同的荧光标记基团进行标记，并利用其与待检等位位点核酸序列杂交后的熔点差异来实现各自探针的彼此区分；也可通过在使用不同的荧光标记基团的同时结合使用不同的熔点来实现各自探针的彼此区分，从而达到增加检测区段数目的目的。

优选地，用同一个扩增反应获得探针与待测核酸和参照核酸杂交体的熔点，或者，用同一个熔解曲线测定反应物获得探针与待测核酸和参照核酸杂交体的熔点。更优选地，同一个扩增反应中包含至少一个探针、至少一个参照核酸和多个待测核酸，由此检测多个核酸的缺失突变。更优选地，同一个扩增反应中包含多个探针、至少一个参照核酸和多个待测核酸，由此检测多个待测核酸中存在的多个缺失突变。优选地，所述多个探针标记不同的荧光基团。所述多个探针可以是至少2、3、5、7、10、15或者20个，并且最多10个、15个、20个、30或者50个或者更多，例如2－5个、2－10个，2－20个、5－10个或者5－20个。所述多个待测核酸可是例如至少2、3、5、7、10、15、或者20个，并且最多10个、20个、50个或者100个或者更多，例如2－10个、2－20个，2－50个。所述多个缺失突变可是例如至少2、3、5、7、10、15、20、30、50、或者个100，并且最多10、20、50、100、或者200个或者更多，例如5－10个，5－20个，5－50个，10－50个，10－100个，或者10－200个。

在本发明中，所述上游引物是指位于被扩增的目的序列的5’端的引物，其与目的序列的负链序列互补，与目的序列的正链序列相同，即上游引物扩增得到的是正链序列。

在本发明中，所述下游引物是指位于被扩增的目的序列的3’端的引物，其与目的序列的正链序列互补，与目的序列的负链序列相同，即下游引物扩增得到的是负链序列。

在本发明中，为了有利于熔解曲线分析，使用不对称PCR，即反应过程中，一种引物相对过量，它所延伸产生的链与探针杂交；并且其延伸产物与探针杂交的引物一般是另一条引物的2-100之间，优选的是2-50倍之间，更优选是5-20倍之间。而优选的探针的加入量是在两条引物的量之间(即过量和未过量之间)，以保证在扩增结束后仍有足够的探针与过量引物的延伸产物结合，以进行熔解曲线分析。

在本发明的实施方案中，可以为上游引物过量，也可以为下游引物过量。所述探针的序列能够与过量引物的延伸产物杂交。

当缺失突变的长度小于200bp～300bp时，可以使用一条上游引物和一条下游引物；当缺失突变的长度大于200bp～300bp时，可以使用多条上游引物或多条下游引物，例如一个上游引物和两个下游引物，或两个上游引物和一个下游引物。并且上、下游引物扩增的产物包括核酸分子与荧光探针的结合区域。

当采用两个上游引物(或下游引物)时，其中一个上游引物(或下游引物)设计在缺失突变区域，以使不论出现哪种类型的核酸分子(如野生型、纯合突变型或杂合突变型)时，都能得到扩增效率相近的扩增产物，例如得到大小为100～400bp的扩增产物(最有利于PCR扩增和检测分析)。

本发明通过PCR产物与探针杂交形成的双链杂交体熔解曲线熔点值(Tm)的差异来判断核酸分子缺失突变的有无以及缺失类型，并可进一步地采用不同标记的荧光探针实现对多种缺失突变的同时检测。该方法属于均相检测***，PCR扩增完成后只需要进行简单的熔解曲线分析就可以完成检测，整个过程可以无需开盖，既可以在同一台荧光PCR仪上完成，也可以在普通扩增仪上扩增后再转移到荧光PCR仪器进行熔解曲线分析，因此操作简便、灵活，而且由于整个过程闭管操作，不易造成PCR产物污染，克服了现有技术中操作繁琐、耗时长、易污染及检测通量不能满足常规需求等缺点，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为当基因缺失片段小于200bp时，本发明的一种优选的引物组和探针的设计方式；

图2为当基因缺失片段小于200bp时，本发明的另一种优选的引物组和探针的设计方式；

图3为当基因缺失片段大于200bp时，本发明的一种优选的引物组和探针的设计方式；

图4为当基因缺失片段大于200bp时，本发明的另一种优选的引物组和探针的设计方式；

图5为本发明实施例1中的不同样本GJB2基因的c.176-191位点16bp基因缺失的检测结果；

图6为本发明实施例2中的不同样本HBB基因的619bp基因缺失的检测结果；

图7为本发明实施例3中的不同样本α-珠蛋白基因簇的东南亚基因缺失的检测结果；

图8为本发明实施例4中的不同样本FAM通道的检测结果；

图9为本发明实施例4中的不同样本HEX通道的检测结果；

图10为本发明实施例4中的不同样本ROX通道的检测结果；

图11为本发明实施例4中的不同样本CY5通道的检测结果。

图12为本发明实施例5中的不同样本ACE基因缺失的检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。任何在相关领域具备经验的人，都可以按照本发明的原理，利用其它类似材料或反应条件实现本发明所描述的方法对基因缺失进行检测，这些并不脱离本发明描述的基本概念。

以上实施中的探针和引物在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例1：自淬灭荧光探针熔解曲线分析法用于短片段(几十个碱基)基因缺失的检测。

本实施例以缝隙连接蛋白编码基因(GJB2基因)(NCBI序列号为NC_000013.11)16bp缺失c.176-191del16的检测为例，针对该基因缺失设计一条荧光探针P1和一对引物F1和R1，荧光探针与缺失前后基因片段杂交形成的双链杂交体可形成不同的熔点(探针3′末端有4个碱基与野生型核酸分子互补，与存在缺失突变的核酸分子不互补)，据此就可以判断样本的基因型。所用的探针和引物序列为:

P1:5′-HEX-CAGCAACACCCTGCAGCCAGGCTG-BHQ1-3′(SEQ ID NO：1),其中的下划线部分表示匹配有差异的4个碱基；

F1:5′-AACCGCCCAGAGTAGAAG-3′(SEQ ID NO：2)；

R1:5′-GGGTTTTGATCTCC-TCGATG-3′(SEQ ID NO：3)。

检测过程包括PCR扩增和熔解曲线分析，具体如下：

在25μL PCR反应体系内含50ng人基因组DNA模板(所检测的人基因组DNA样本类型包括野生型、纯合缺失型、杂合缺失型)，67mMTris-HCl(pH＝8.5)，16mM(NH₄)₂SO₄，0.01％(w/v)Tween 20，1U TaqHS DNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)，200μM dNTPs，2mM MgCl₂，0.08μM F1，0.8μM R1，0.2μM P1。其中阴性质控(NTC)不加DNA模板。反应程序为：95℃ 3min；95℃ 15s，55℃ 15s，76℃ 20s，50个循环；95℃ 1min；35℃ 3min；随后按0.4℃/step的升温速率从40℃递增至85℃进行熔解曲线分析，并采集HEX通道的荧光信号。该实验在Bio-Rad CFX96实时PCR仪上进行。

如图5所示，没有基因缺失的(野生型)样本只有野生型熔解峰，c.176-191del16纯合缺失型对应只有缺失型熔解峰，而c.176-191del16杂合缺失型同时具有野生型熔解峰和缺失型熔解峰。本实施例说明，短片段基因缺失型可以通过本发明所说的荧光探针熔解曲线分析方法进行检测和基因分型。

实施例2：自淬灭荧光探针熔解曲线分析法用于中等片段长度(几百个碱基)基因缺失的检测。

本实施例以β-珠蛋白基因(HBB基因，NCBI参考序列号为NG_000007.3)619bp长度基因缺失Del619(缺失位置为g.71609-72227)为例，针对该类型基因缺失设计一条荧光探针P2和引物组F2、R2和R3，荧光探针与缺失前后基因片段杂交形成的双链杂交体可形成不同的熔点(探针3′末端有6个碱基与野生型核酸分子互补，与存在缺失突变的核酸分子不互补)，据此就可以判断样本的基因型。所用的探针和引物序列为:

P2：5′-ROX-CCGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTGG-BHQ2-3′(SEQ ID NO：4),其中的下划线部分表示匹配有差异的6个碱基；

F2：5′-CAGTGATAATTTCTGGGTTAAG-3′(SEQ ID NO：5)；

R2：5′-GCCTAGCTTGGACTCAG-3′(SEQ ID NO：6)；

R3：5′-GTAATGTAAAATACAGCATAGCA-3′(SEQ ID NO：7)。

检测过程包括PCR扩增和熔解曲线分析，具体如下：

在25μL反应体系内含50ng人基因组DNA模板(所检测的人基因组DNA样本类型包括野生型、纯合缺失型、杂合缺失型)，67mMTis-HCl(pH＝8.5)，16mM(NH₄)₂SO₄，0.01％(w/v)Tween 20，1U TaqHS DNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)，200μM dNTPs，3mM MgCl₂，0.08μM F2，0.8μM R2，0.8μM R3，0.2μM P2。其中阴性质控(NTC)不加DNA模板。反应程序为：95℃ 3min；95℃ 15s，55℃ 15s，76℃ 20s，50个循环；95℃ 1min；35℃ 3min；随后按0.4℃/step的升温速率从40℃递增至80℃进行熔解曲线分析，并采集ROX通道的荧光信号。该实验在Bio-Rad CFX96实时PCR仪上进行。

如图6所示，没有基因缺失的样本只有野生型熔解峰，Del619纯合缺失型对应只有缺失型的熔解峰，而Del619杂合缺失型同时具有野生型的熔解峰和缺失型的熔解峰。本实施例说明，中等片段长度基因缺失型可以通过本发明所说的荧光探针熔解曲线分析方法进行检测和基因分型。

实施例3：自淬灭荧光探针熔解曲线分析法用于大片段基因缺失。

本实施例以α-珠蛋白基因簇(NCBI序列号为NG_000006.1)长约20.5kb基因缺失东南亚缺失型(--^SEA)(缺失位置为g.26264-45564)为例，针对该类型基因缺失设计一条荧光探针P3和引物组F3、R4和R5，荧光探针与缺失前后基因片段杂交形成的双链杂交体可形成不同的熔点(探针3′末端有4个碱基与野生型核酸分子互补，与存在缺失突变的核酸分子不互补)，据此就可以判断样本的基因型。

所用的探针和引物序列为:

P3:5′-FAM-CGCCTTGGGGAGGTTCTAGC-BHQ1-3′(SEQ IDNO：8),其中的下划线部分表示匹配有差异的4个碱基；

F3：5′-CCGTCCGACTCAAGGAC-3′(SEQ ID NO：9)；

R4：5′-CCGTCCGACTCAAGGAC-3′(SEQ ID NO：10)；

R5：5′-TGCAGCCTTGAACTCCTG-3′(SEQ ID NO：11)。

检测过程包括PCR扩增和熔解曲线分析，具体如下：

25μL反应体系内含50ng人基因组DNA模板(所检测的人基因组DNA样本类型包括野生型、纯合缺失型、杂合缺失型)，67mMTis-HCl(pH＝8.5)，16mM(NH₄)₂SO₄，0.01％(w/v)Tween 20，1U TaqHS DNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)，200μM dNTPs，3mM MgCl₂，0.05μM F3，0.5μM R4，0.5μM R5，0.2μM P3。其中阴性质控(NTC)不加DNA模板。反应程序为：95℃ 3min；95℃ 15s，55℃ 15s，76℃ 20s，50个循环；95℃ 1min；35℃ 3min；随后按0.4℃/step的升温速率从40℃递增至85℃进行熔解曲线分析，并采集FAM通道的荧光信号。该实验在Bio-Rad CFX96实时PCR仪上进行。

如图7所示，没有东南亚缺失型(αα/αα)的样本只有野生型熔解峰，东南亚缺失纯合型(--^SEA/--^SEA)的样本对应只有缺失型的熔解峰，而东南亚缺失杂合型(--^SEA/αα)的样本同时具有野生型的熔解峰和缺失型的熔解峰。本实施例说明，大片段基因缺失可以通过本发明所说的荧光探针熔解曲线分析方法进行检测和基因分型。

实施例4：多色荧光探针熔解曲线分析法单管同时检测多个不同基因位点的不同基因缺失类型。

前面的实施例表明，自淬灭荧光探针熔解曲线分析法可以实现对各种不同长度的基因缺失片段进行检测和基因分型，本实施例以多种不同基因缺失类型同时检测为例，说明采用不同颜色标记的荧光探针，利用多色荧光探针熔解曲线分析法可以在单个PCR反应中进行多个不同基因缺失类型的同时检测。以α-珠蛋白基因簇长约20.5kb基因缺失东南亚缺失型(--^SEA)、缝隙连接蛋白编码基因(GJB2基因)16bp缺失c.176-191del16、β-珠蛋白基因(HBB基因)619bp长度基因缺失Del619，以及血管紧张素转换酶基因(ACE基因，UCSC参考序列号NM_000789.3)的16内含子的一段289bp的***或缺失(I/D)序列(缺失位置为g.58919646-58919935)同时检测为例，分别设计标记不同荧光基团的荧光探针P3，P1，P2和P4(探针3′末端有7个碱基与野生型核酸分子不互补，与存在缺失突变的核酸分子互补)，以及对应的扩增引物组，使各探针与对应的缺失前后基因片段杂交形成的双链杂交体可形成不同的熔点，根据荧光检测通道的类型以及熔点的情况就可以判定各基因检测位点的基因型。所用的探针和引物序列为:

P1:5′-HEX-CAGCAACACCCTGCAGCCAGGCTG-BHQ1-3′(SEQ ID NO：1)；

F1:5′-AACCGCCCAGAGTAGAAG-3′(SEQ ID NO：2)；

R1:5′-GGGTTTTGATCTCC-TCGATG-3′(SEQ ID NO：3)；

P2:5′-ROX-CCGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTG-ATGTGG-BHQ2-3′(SEQ ID NO：4)；

F2:5′-CAGTGATAATTTCTGGGTTAAG-3′(SEQ ID NO：5)；

R2:5′-GCCTAGCTTGGACTCAG-3′(SEQ ID NO：6)；

R3:5′-GTAATGTAAAATACAGCATAGCA-3′(SEQ ID NO：7)；

P3:5′-FAM-CGCCTTGGGGAGGTTCTAGC-BHQ1-3′(SEQ IDNO：8)；

F3:5′-CCGTCCGACTCAAGGAC-3′(SEQ ID NO：9)；

R4:5′-CCGTCCGACTCAAGGAC-3′(SEQ ID NO：10)；

R5:5′-TGCAGCCTTGAACTCCTG-3′(SEQ ID NO：11)；

P4:

5′-CY5-ACCTGCTGCCTATACAGTCACTTTTATGTGGT-BHQ2-3′(SEQ ID NO：12),其中的下划线部分表示匹配有差异的7个碱基；

F4:5′-GTAAGCCACTGCTGGAGAG-3′(SEQ ID NO：13)；

R6:5′-TAGGGGTTTGAATGCCTTG-3′(SEQ ID NO：14)；

R7:5′-TTGCAGTGAGCCGAGAT-3′(SEQ ID NO：15)。

本实施例以5份未知基因型样本检测为例，检测过程包括PCR扩增和熔解曲线分析，具体如下：

25μL反应体系内含50ng人基因组DNA模板，67mM Tis-HCl(pH＝8.5)，16mM(NH₄)₂SO₄，0.01％(w/v)Tween 20，2U Taq HS DNA聚合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司)，400μM dNTPs，3mM MgCl₂，0.04μM F1，0.4μM R1，0.2μM P1，0.04μM F2，0.4μMR2，0.4μM R3，0.2μM P2，0.05μM F3，0.5μM R4，0.5μM R5，0.2μM P3，0.08μM F4，0.2μM R6，0.5μM R7，0.1μM P4。其中阴性质控(NTC)不加DNA模板。反应程序为：95℃ 3min；95℃ 15s，55℃ 15s，76℃ 20s，50个循环；95℃ 1min；35℃ 3min；随后按0.4℃/step的升温速率从40℃递增至85℃进行熔解曲线分析，并采集FAM，HEX，ROX，CY5通道的荧光信号。该实验在Bio-Rad CFX96实时PCR仪上进行。

检测结果如图8-11所示，各样本的各基因型的检测结果如表1所示，各样本检测结果符合预期。此实施例说明，利用多色荧光探针熔解曲线分析法单个反应中可同时检测多个不同基因位点的不同基因缺失类型。

表1

实施例5：相邻探针熔解曲线分析法检测ACE基因缺失。

本实施例以血管紧张素转换酶基因(ACE基因，UCSC参考序列号NM_000789.3)的16内含子的一段289bp的***或缺失(I/D)序列(缺失位置为g.58919646-58919935)检测为例，说明采用相邻探针，使用本发明所述的方法可用于核酸分子缺失检测。针对该类型基因缺失设计一条相邻探针，其中的检测探针(Sensor probe，该探针5′末端有6个碱基与野生型核酸分子不互补，与存在缺失突变的核酸分子互补)为P5，锚定探针(Anchor probe，该探针与缺失扩增片段和野生型扩增片段均完全互补)为P6，引物组为F4，R6，R7，相邻探针中的检测探针与缺失前后基因片段杂交形成的双链杂交体可形成不同的熔点，据此就可以判断样本的基因型。

所用的探针和引物序列为:

P5:5′-CCACATAAAAGTGACTGTATAGGCA-FAM-3′(SEQ IDNO：16),其中的下划线部分表示匹配有差异的6个碱基；

P6:5′-ROX-GGTCTAGAGAAATGGGAGAAAGGATGGG-3′(SEQ ID NO：17)；

F4:5′-GTAAGCCACTGCTGGAGAG-3′(SEQ ID NO：13)；

R6:5′-TAGGGGTTTGAATGCCTTG-3′(SEQ ID NO：14)；

R7:5′-TTGCAGTGAGCCGAGAT-3′(SEQ ID NO：15)。

检测过程包括PCR扩增和熔解曲线分析，具体如下：

25μL反应体系内含50ng人基因组DNA模板(所检测的人基因组DNA样本类型包括野生型、纯合缺失型、杂合缺失型)，67mMTis-HCl(pH＝8.5)，16mM(NH₄)₂SO₄，0.01％(w/v)Tween 20，1U TaqHS DNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)，200μM dNTPs，3mM MgCl₂，0.5μM F4，0.2μM R6，0.1μM R7，0.1μM P5，0.2μM P6。其中阴性质控(NTC)不加DNA模板。反应程序为：95℃ 3min；95℃ 15s，52℃ 15s，74℃ 20s，50个循环；95℃ 1min；36℃ 1min；随后按1℃/step的升温速率从38℃递增至75℃进行熔解曲线分析，并采集相应的荧光信号(其中激发波长采用470nm，检测波长为610nm)。该实验在Rotor-gene 6000实时PCR仪上进行。

如图12所示，无289bp缺失的样本(I/I)只有I型熔解峰，有289bp缺失的缺失型样本(D/D)只有D型熔解峰，而杂合型样本(I/D)同时具有I型的熔解峰和D型的熔解峰。本实施例说明，采用相邻探针，使用本发明所述的荧光探针熔解曲线分析方法可用于核酸分子缺失检测和基因分型。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.一种检测核酸分子是否存在缺失突变的方法，其包括以下1)～4)项：

1)根据核酸分子缺失的断裂点位置，设计荧光探针，使荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间具有不同的熔点(Tm)值；

4)根据熔解曲线分析中是否有相应的熔解峰和/或熔点(Tm)值的大小来判定是否存在核酸缺失突变，以及任选地判断缺失突变的类型。

2.权利要求1的方法，其中所述核酸为核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。

3.权利要求1的方法，其中所述缺失突变是指15nt以上的寡核苷酸片段的缺失，例如是指100nt以上的寡核苷酸片段的缺失。

4.权利要求1的方法，其中所述荧光探针选自自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标、只标记荧光基团的寡核苷酸探针(如HyBeacon探针)、荧光标记探针结合荧光嵌入染料、荧光标记探针结合荧光淬灭染料。

5.权利要求1的方法，其中所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间的熔点(Tm)值相差2℃以上。

6.权利要求1的方法，其中所述荧光探针为一种或多种。

7.权利要求1的方法，其中所述引物组的上、下游引物中有一种引物相对过量(上游引物过量或下游引物过量)。

8.权利要求7的方法，其中所述过量的引物与未过量的引物之间的数量比例为(2～100):1，例如为(4～50):1，例如为(5～20):1，例如为(5～10):1。

9.权利要求1的方法，其中所述引物组对野生型核酸分子和存在缺失突变的核酸分子扩增所得到的主要双链产物大小相近，例如为100-400bp。

10.权利要求1的方法，其中所述的引物组选自以下(1)～(3)项：

(1)所述的引物组包含一种上游引物和一种下游引物；

(2)所述的引物组包含一种上游引物和两种下游引物，其中的一种下游引物位于缺失突变区域；

(3)所述的引物组包含两种上游引物和一种下游引物，其中的一种上游引物位于缺失突变区域。

11.一种检测核酸分子是否存在缺失突变的反应体系，其含有至少一种待测核酸分子、至少一种荧光探针、和至少一对引物组，其中：

12.权利要求11的反应体系，其中所述核酸为核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。

13.权利要求11的反应体系，其中所述缺失突变是指15nt以上的寡核苷酸片段的缺失，例如是指100nt以上的寡核苷酸片段的缺失。

14.权利要求11的反应体系，其中所述荧光探针选自自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标、只标记荧光基团的寡核苷酸探针(如HyBeacon探针)、荧光标记探针结合荧光嵌入染料、荧光标记探针结合荧光淬灭染料。

15.权利要求11的反应体系，其中所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间的熔点(Tm)值相差2℃以上。

16.权利要求11的反应体系，其中所述引物组的上、下游引物中有一种引物相对过量(上游引物过量或下游引物过量)。

17.权利要求16的反应体系，其中所述过量的引物与未过量的引物之间的数量比例为(2～100):1，例如为(4～50):1，例如为(5～20):1，例如为(5～10):1。

18.权利要求11的反应体系，其中所述引物组对野生型核酸分子和存在缺失突变的核酸分子扩增所得到的主要双链产物大小相近，例如为100-400bp。

19.权利要求12的反应体系，其中所述的一对引物组选自以下(1)～(3)项：

(1)所述的一对引物组包含一种上游引物和一种下游引物；

(2)所述的一对引物组包含一种上游引物和两种下游引物，其中的一种下游引物位于缺失突变区域；

(3)所述的一对引物组包含两种上游引物和一种下游引物，其中的一种上游引物位于缺失突变区域。

20.一种检测核酸分子是否存在缺失突变的试剂盒，其含有至少一种荧光探针、和至少一对引物组，其中：

21.权利要求20的试剂盒，其中所述缺失突变是指15nt以上的寡核苷酸片段的缺失，例如是指100nt以上的寡核苷酸片段的缺失。

22.权利要求20的试剂盒，其中所述荧光探针选自自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标、只标记荧光基团的寡核苷酸探针(如HyBeacon探针)、荧光标记探针结合荧光嵌入染料、荧光标记探针结合荧光淬灭染料。

23.权利要求20的试剂盒，其中所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间的熔点(Tm)值相差2℃以上。

24.权利要求20的试剂盒，其中所述引物组的上、下游引物中有一种引物相对过量(上游引物过量或下游引物过量)。

25.权利要求24的试剂盒，其中所述过量的引物与未过量的引物之间的数量比例为(2～100):1，例如为(4～50):1，例如为(5～20):1，例如为(5～10):1。

26.权利要求20的试剂盒，中所述引物组对野生型核酸分子和存在缺失突变的核酸分子扩增所得到的主要双链产物大小相近，例如为100-400bp。

27.权利要求20的试剂盒，其中所述的一对引物组选自以下(1)～(3)项：

(1)所述的一对引物组包含一种上游引物和一种下游引物；

(2)其中所述的一对引物组包含一种上游引物和两种下游引物，其中的一种下游引物位于缺失突变区域；

28.权利要求11-19任一项的反应体系、或权利要求20-27任一项的试剂盒用于检测核酸分子是否存在缺失突变的用途。