CN104651329A - 一种含有丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶gpx2突变体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种含有丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体及其制备方法，属于生物技术领域。本发明以人GPX2为模板，通过计算机模拟和定点突变，得到一种新型的高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体，其由203个氨基酸组成，与人GPX2相比较，其不含有半胱氨酸，具有较高的GPX活力和更好的稳定性，其是将人GPX2中所有半胱氨酸突变成丝氨酸，但第40位仍然是硒代半胱氨酸(SeCys)；117位丙氨酸(Ala)突变为丝氨酸(Ser)，所形成的序列为SEQ ID No:2。其是用基因工程技术在哺乳动物细胞株或营养缺陷型原核表达***及其SPP低温表达***中直接表达具有高酶活性的GPX2突变体蛋白的方法。本方法不需化学修饰即可制备具有极高GPX活力的新型人工酶。本发明方法在生物制药方面具有广阔的应用前景。

Description

一种含有丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体及其制备方法

本专利申请是中国专利“高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体及其制备方法”的分案申请，原申请的申请日为：2014-02-18，原申请的申请号为：201410054696.6，原申请的公布号为：CN103756984A，公布日为：2014-04-30。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含有丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体及其制备方法。

背景技术

含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的底物是谷胱甘肽(GSH)，催化基团是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物体内，GPX同超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)一起构成了机体抗氧化防御体系。GPX在该体系中发挥着重要的作用，它以底物GSH为还原剂，分解体内的过氧化氢和各类氢过氧化物，因而能清除体内活性氧(ROS)，防止脂质过氧化，治疗由活性氧引起的各种疾病，如衰老、紫外线辐射、心脑血管疾病、白内障、肿瘤等。与其它抗氧化酶不同，GPX除了能清除ROS外，还能降解脂质过氧化物，防止细胞过氧化损伤，这种独特的保护细胞的功能使它在抗氧化酶体系中占有特别重要的位置。然而，由于天然GPX的来源相当有限、稳定性差，致使它的人工产物及其模拟物的研究备受关注。

小分子模拟物主要有PZ51(ebselen)、AL3823A、BXT系列产品，它们的弱点是活力低，仅为天然GPX的千分之一左右。大分子的模拟物主要有抗体酶(中国专利94102481.4和96112628.0)和以谷胱甘肽硫转移酶(GST)为蛋白模板制备的GPX模拟酶，其活力显著高于小分子模拟物。显然，以具有谷胱甘肽(GSH)结合部位的蛋白为模板制备的大分子GPX模拟酶收到了更好的效果，因此开发制备这些高活力的GPX模拟酶制备技术就成了学术界的研究热点，对于分子生物学、生物工程学及医学等领域具有广阔的应用前景。迄今已成功开发的方法有：用化学法(中国专利94102481.4，96112628.0)或营养缺陷型原核表达***(中国专利200810050556.6)在非GPX类模板蛋白中引入GPX的催化基团硒代半胱氨酸(SeCys)。

中国专利94102481.4，96112628.0，99104234.4，200810050556.6公开的各类含硒抗体酶的制备方法就是应用化学突变(修饰)法在抗体类模板蛋白中引入GPX的催化基团SeCys，有以下缺点：(1)在制备过程中，仅化学突变(修饰)这一步就会损失20-40％的酶蛋白，导致模拟酶产率显著下降；(2)制备模拟酶的周期长，操作繁琐，时间长；(3)在化学突变过程中需使用苯甲基磺酰氟、乙腈等，这些物质为有毒性的物质；(4)缺乏靶向性，对于大的蛋白分子而言，一次化学反应常在不同位点引入多个非特异性催化基团，因此化学突变引入催化基团无法达到基因突变法那样的专一性。

中国专利200810050556.6也公开了人源单链含硒抗体酶的另一种制备方法，是用营养缺陷型原核表达***(大肠杆菌)和基因突变法引入催化基团，但其仅限于人源单链含硒抗体酶的制备，不包括谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)突变体及其它GPX模拟酶的制备方法。具有GPX活性的谷胱甘肽硫转移酶(GST)的制备方法(Yu,H.J.,Liu,J.Q.,A.,Li,J.,Luo,G.M.,and Shen,J.C.J.Biol.Chem.2005,280,11930-11935)亦见报道，这种方法虽然也采用营养缺陷型原核表达***和基因突变法引入催化基团，但其仅限于以GST为模板蛋白制备GPX模拟酶，不包括以天然GPX为模板制备GPX突变体。用营养缺陷型原核表达***在非GPX类模板蛋白中引入催化基团制备模拟酶的方法是将催化基团引入到与GPX有相同底物GSH结合部位的它种蛋白中使其产生GPX活力。

然而由于这些模板蛋白不具备天然GPX自身的催化基团，因此很难找到理想而准确的催化基团的位置；同时由于这些模板蛋白中也没有象天然GPX那样理想的催化三联体，因此这类模拟酶的催化效率不高。如果以天然GPX为模板用基因工程方法来制备GPX突变体则可克服这些缺点。由于编码GPX的催化基团SeCys的密码子UGA是终止密码子，在普通原核表达***中，需在GPX基因的开放阅读框内、紧邻SeCys的密码子UGA下游引入颈环结构才能将UGA翻译成SeCys而不是终止密码子，而开放阅读框内颈环的引入必然会引起GPX空间构象的改变，进而影响酶活性。因此普通原核表达***不适于直接表达具有GPX活性的含硒蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体及其制备方法。

应用基因工程技术、细胞培养技术、营养缺陷型原核表达技术和SPP(Single protein production,单一蛋白生产)***低温表达技术制备具有极高GPX活力的GPX2突变体，是用基因工程技术在哺乳动物细胞株或营养缺陷型原核表达***及其SPP低温表达***中直接表达具有高酶活性的GPX2突变体蛋白的方法。本方法不需化学修饰即可制备具有极高GPX活力的新型人工酶。本发明方法在生物制药方面具有广阔的应用前景。

本发明以人GPX2(参见NCBI,NM_002083.3)为模板，通过计算机模拟和定点突变，得到一种新型的高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体，其由203个氨基酸组成，与人GPX2相比较，其不含有半胱氨酸，具有更高的GPX活力和更好的稳定性，其是将人GPX2中所有半胱氨酸突变成丝氨酸，但第40位仍然是硒代半胱氨酸(SeCys，单字母缩写为U，序列表中写成Xaa)。所述的GPX2突变体的氨基酸序列(SEQ ID No:1)如下所示：

MAFIAKSFYDLSAISLDGEKVDFNTFRGRAVLIENVASLUGTTTRDFTQLNELQSRFPRRLVVLGFPSNQFGHQENSQNEEILNSLKYVRPGGGYQPTFTLVQKSEVNGQNEHPVFAYLKDKLPYPYDDPFSLMTDPKLIIWSPVRRSDVAWNFEKFLIGPEGEPFRRYSRTFPTINIEPDIKRLLKVAI

进一步，所述的GPX2突变体的具体氨基酸序列还包括，将上述氨基酸序列中任何一个或多个丙氨酸(Ala)突变为丝氨酸(Ser)所形成的任何一个新型GPX2突变体。比如将117位丙氨酸(Ala)突变为丝氨酸(Ser)，所形成的序列为SEQ ID No:2(实施例2)。

进一步，所述的GPX2突变体的具体氨基酸序列还包括，由于使用了便于靶蛋白纯化的pColdI(TAKARA公司)等分泌型原核或真核表达载体而在上述氨基酸序列的氨基端或羧基端引入该分泌型原核或真核表达载体上的组氨酸纯化标签和其它的氨基酸等所形成的任何一个新型GPX2突变体。比如在序列SEQ ID No:2的氨基端引入pColdI(TAKARA公司)原核表达载体的组氨酸纯化标签和凝血因子Xa切割位点的氨基酸后所形成的序列SEQ ID No:3(实施例3)。

本发明所述的制备含有丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体的方法，是先在生物公司用DNA合成仪人工合成能够表达本发明所述的GPX2突变体蛋白的基因，确保基因中不含ACA序列，再用单一蛋白生产***和营养缺陷型原核表达***联合制备GPX2突变体蛋白，具体步骤如下：

1)、表达载体的构建：根据本发明所述GPX2突变体的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在营养缺陷型菌株中表达GPX2突变体蛋白的基因，确保靶基因的5′端含有起始密码子(ATG)，3′端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点，确保靶基因的40位硒代半胱氨酸(SeCys)的编码序列替换为半胱氨酸(Cys)的密码子(可以是TGC等)，且基因全长不含有ACA序列；具体的基因序列可以是将GPX2基因(参见NCBI,NM_002083.3)中第55、68、77和105位的半胱氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子，第40位硒代半胱氨酸的密码子替换为半胱氨酸的密码子，第117位丙氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子，并根据密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，将基因中所有的ACA序列全部替换为非ACA序列所得到的编码基因；也可以是其它任何一种能在营养缺陷型菌株中表达GPX2突变体蛋白，且全长不含有ACA序列的编码基因(由于密码子的简并性，同一氨基酸序列可以有多种不同的编码基因)；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPX2突变体基因和分泌型原核表达载体(如pCold系列等)，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX2突变体基因组装到分泌型原核表达载体上；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而GPX2突变体基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：

用步骤1)中构建的含有GPX2突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；再将含有表达核酸内切酶MazF的pMazF(TAKARA,Cat#3367)质粒转化阳性菌株，用含双抗性的M9固体培养基筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里，经IPTG低温4-25℃诱导表达，营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密码子合成SeCys，直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的GPX2突变体，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，透析冻干后即得GPX2突变体蛋白纯品。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Westernblot)鉴定目标蛋白。

该方法通过低温下诱导营养缺陷型原核表达***在GPX2突变体的底物结合部位引入了催化基团，因而产生高活力的GPX2突变体。

所述的用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。

所述的将液体低温离心，可以在4℃，8000-12000g离心15-30min。

进一步，使用便于靶蛋白纯化的pColdI(TAKARA公司)等分泌型原核或真核表达载体而在靶蛋白的氨基端或羧基端引入该载体上的组氨酸纯化标签和其它的氨基酸等所形成的任何一个新型GPX2突变体。比如在序列SEQ ID No:2的氨基端引入pColdI(TAKARA公司)原核表达载体的组氨酸纯化标签和凝血因子Xa切割位点的氨基酸后所形成的序列SEQ ID No:3。

本发明具有以下特点：

⑴本发明使用简单的基因合成或扩增、基因突变和表达等基因工程技术，制备方法简单。

⑵本发明方法制备的GPX2突变体蛋白活力高，已达到天然GPX活力的同一个数量级，细胞生物学实验已证实对过氧化氢损伤的心肌细胞有更强的保护作用。

⑶本发明所述的GPX2突变体蛋白具有超强的稳定性，不易失活，这一特性弥补了天然GPX的缺陷。

⑷本发明使用的分泌型表达载体，能将GPX2突变体蛋白以可溶性形式表达并分泌到大肠杆菌的周质腔或哺乳类细胞的体外，引导蛋白分泌表达的前导信号肽由菌体或细胞自动切除，所表达的蛋白为可溶性，具有天然蛋白的空间构象和更高的活性，不需复性，可避免包涵体复性过程造成的产率下降和失活，因而生产周期短。

⑸本发明使用的SPP低温表达***能利用MazF蛋白酶特异性识别并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌体只能合成编码基因中无ACA序列的蛋白质，因此新合成的蛋白主要是外源蛋白,从而提高产率和Cys向SeCys的转化率，因此具有活力高、产率高的双重优势。

⑹本发明所用的真核表达直接使用GPX自身的硒代半胱氨酸***序列(SECIS)，不需另外引入SECIS进入表达载体，因而操作简单且可用常规真核表达载体实施。

这些优点均有利于大规模生产，为今后的实际应用打下了坚实的基础，解决了天然GPX来源不足、性质不稳定和活力低的问题，在生物制药方面有广阔的应用前景。

附图说明

图1：纯化得到的GPX2突变体蛋白的SDS-PAGE(上)和Western blot(下)结果：其中M是蛋白分子量Marker，1、2、3泳道是实施例1、2、3制备的靶蛋白。

具体实施方式

实施例1：用合成的基因联合SPP和营养缺陷型原核表达***制备基因工程人GPX2突变体蛋白

根据本发明序列1(SEQ ID No:1)所述的GPX2突变体的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在营养缺陷型菌株中表达序列1(SEQ ID No:1)所述的GPX2突变体蛋白的基因，确保GPX2突变体基因的5′端含有起始密码子(ATG)和Nde I酶切位点，3′端含有终止密码子和Hind III酶切位点，GPX2突变体基因的第40号SeCys的编码序列TGA替换为Cys的密码子(TGC)，且基因全长不含有ACA序列；具体的靶基因序列是将GPX2基因(参见NCBI,NM_002083.3)中第55、68、77和105位的半胱氨酸的密码子替换为丝氨酸的编码序列(依次是：AGC、AGC、AGT、AGT)，第40位硒代半胱氨酸的密码子替换为半胱氨酸的编码序列(TGC)，再根据密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，将GPX2基因中所有ACA序列突变掉，获得无ACA序列的GPX2突变体基因，确保该基因能编码本发明序列1(SEQ ID No:1)所述的GPX2突变体蛋白，且靶基因的5′端含有起始密码子(ATG)和Nde I酶切位点，3′端含有终止密码子和Hind III酶切位点；用限制性核酸内切酶Nde I和Hind III双酶切后，连接到同样酶切的pCold III(TAKARA,Cat.#3369)载体上。

用装有GPX2突变体基因的载体(pCold III-GPX2突)转化营养缺陷型大肠杆菌BL21(DE3)Cys，涂含有Cys的营养琼脂平板，筛选阳性菌株。再将表达核酸内切酶MazF的质粒pMazF(TAKARA,Cat.#3369)转化到该阳性菌株中。将菌液均匀涂布在含100μg/mL Amp、25μg/mLKana和25μg/mL的M9-CAA固体培养基中筛选阳性转化子。将阳性转化子接种于1.2L M9缺陷表达培养基(在M9培养基中加入100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素、50μg/ml Cys和除了Cys之外的19种氨基酸各100μg/ml)中至OD600为0.5。将菌液置于-20℃冰箱中5min，使菌液迅速冷却，之后将菌液置于15℃中继续振荡培养45min。15℃5000rpm离心5min，弃上清。用0.9％NaCl重悬菌体沉淀，15℃5000rpm离心5min，弃上清，重复该步骤。然后用生产培养基(在M9培养基中加入除了Cys之外的19种氨基酸各50-400μg/ml)重悬菌体，加入终浓度为1mmol/L IPTG和终浓度为200μg/mL SeCys，15℃振荡培养16-72h，使GPX2突变体蛋白以可溶性形式表达在菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达。收集菌体(6000rpm，10min)并用等体积的bufferT(50mM Tris buffer，pH7.5，含1mM EDTA)洗涤两次。用BufferT重悬菌体沉淀，加入终浓度1mM的PMSF(苯甲基磺酰氟)，超声破碎菌体，4℃，12000rpm离心30min，收集上清。按说明书处理GSH亲合柱，应用缓冲液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡,将上清液加入GSH亲合柱上,用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，用10mmol/L GSH洗脱目的蛋白。将洗脱液透析并冻干，即得人GPX2突变体蛋白。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定靶蛋白，其分子量为20.9kDa，且与抗GPX2抗体特异性结合，证明成功获得了目标蛋白，见图1的第1泳道。其GPX活力为2636U/μmol，达到天然GPX同一个数量级。

本实施例使用的SPP低温表达***能利用MazF蛋白酶特异性识别并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌体只能合成编码基因中无ACA序列的蛋白质，因此新合成的蛋白主要是外源重组蛋白,从而提高产率和Cys向SeCys的转化率，因此具有高活高产双重优势。

实施例2：

与实施例1制备方法完全相同，只是合成GPX2突变体的编码基因时将第117位丙氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子(TCC)，最后获得的GPX2突变体蛋白的第117位是丝氨酸，而不是丙氨酸，其它氨基酸序列与第一种方法完全相同，即本发明序列2(SEQ ID No:2)所述的GPX2突变体蛋白。该突变体分子量仅有微小的变化，在SDS-PAGE和Western Blot结果上没有区别，见图1的第9泳道。但其GPX活力为2417U/μmol，略高于实施例1，达到天然GPX同一个数量级。

实施例3：

除将实施例1所用的表达载体pCold III(TAKARA,Cat.#3369)换成带组氨酸纯化标签的pColdI(TAKARA,Cat.#3367)，其余与实施例1完全相同，即最终将获得本发明序列3(SEQ ID No:3)所述的GPX2突变体蛋白。该突变体在氨基端引入了载体上包括6个组氨酸在内的16个外源氨基酸，因此分子量有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot结果上可以看到，见图1的第11泳道，其优点是也可以用镍亲和层系纯化靶蛋白。其GPX活力为2336U/μmol，略低于实施例2，证明纯化标签对蛋白的活力没有明显影响，活力达到天然GPX同一个数量级。

Claims (4)

1.一种含有丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQID No:2所示。

2.如权利要求1所述的一种含有丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。

3.权利要求1所述的一种含有丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体的制备方法，其步骤如下：

1)、表达载体的构建：根据本发明所述GPX2突变体的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在营养缺陷型菌株中表达GPX2突变体蛋白的基因，确保靶基因的5′端含有起始密码子ATG，3′端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点，确保靶基因的40位硒代半胱氨酸SeCys的编码序列替换为半胱氨酸Cys的密码子中第55、68、77和105位的半胱氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子，第40位硒代半胱氨酸的密码子替换为半胱氨酸的密码子，第117位丙氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子，并根据密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，将基因中所有的ACA序列全部替换为非ACA序列所得到的编码基因；或其它任何一种能在营养缺陷型菌株中表达GPX2突变体蛋白，且全长不含有ACA序列的编码基因；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPX2突变体基因和分泌型原核表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX2突变体基因组装到分泌型原核表达载体上；所述的特定的酶切位点是表达载体的多克隆位点中含有的而GPX2突变体基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：

用步骤1)中构建的含有GPX2突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；再将含有表达核酸内切酶MazF的pMazF质粒转化阳性菌株，用含双抗性的M9固体培养基筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里，经IPTG低温4-25℃诱导表达，营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密码子合成SeCys，直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的GPX2突变体，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，透析冻干后即得GPX2突变体蛋白纯品；所述的用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白；所述的将液体低温离心，是在4℃，8000-12000g离心15-30min。

4.权利要求2所述的一种含有丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体的制备方法，其特征在于：是在序列SEQ ID No:2的氨基端引入pColdI原核表达载体的组氨酸纯化标签和凝血因子Xa切割位点的氨基酸后形成序列SEQ ID No:3。