CN103224915B - 用原核表达***制备重组谷胱甘肽过氧化物酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的基因工程法制备重组谷胱甘肽过氧化物酶属于生物技术的领域。先将靶基因组装到分泌型原核表达载体上，用基因突变法通过营养缺陷型原核表达***或营养缺陷型和SPP低温联合表达***，将GPX的催化基团SeCys引入到GPX的底物结合部位，结果赋予其高的GPX的活性；或者先将靶基因连同SeCys***序列组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上，再将SeCys***序列结合蛋白2组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上，将两种载体共转染同一哺乳细胞株，在***钠存在下用哺乳细胞合成GPX。本发明方法简单，重组GPX活力和产量高、稳定性好，避免包涵体复性造成的产率下降和失活，从而解决天然GPX来源有限和性质不稳定问题。

Description

用原核表达***制备重组谷胱甘肽过氧化物酶的方法

技术领域

本发明是一种应用基因工程法制备重组谷胱甘肽过氧化物酶的方法，属于生物技术领域，涉及基因重组技术、基因突变技术和重组蛋白表达技术。

背景技术

含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的底物是谷胱甘肽(GSH)，催化基团是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物体内，GPX同超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)一起构成了机体抗氧化防御体系。GPX在该体系中发挥着重要的作用，它以底物GSH为还原剂，分解体内的过氧化氢和各类氢过氧化物，因而能清除体内活性氧(ROS)，防止脂质过氧化，治疗由活性氧引起的各种疾病，如衰老、紫外线辐射、心脑血管疾病、白内障、肿瘤等。与其它抗氧化酶不同，GPX除了能清除ROS外，还能降解脂质过氧化物，防止细胞过氧化损伤，这种独特的保护细胞的功能使它在抗氧化酶体系中占有特别重要的位置。然而，由于天然GPX的来源相当有限、稳定性差，致使它的人工产物及其模拟物的研究备受关注。

小分子模拟物主要有PZ51(ebselen)，AL3823A，BXT系列产品，它们的弱点是活力低，仅为天然GPX的千分之一左右。大分子的模拟物主要有抗体酶(中国专利94102481.4和96112628.0)和以谷胱甘肽硫转移酶(GST)为蛋白模板制备的GPX模拟酶，其活力显著高于小分子模拟物。显然，以具有谷胱甘肽(GSH)结合部位的蛋白为模板制备的大分子GPX模拟酶收到了更好的效果，因此开发制备这些高活力的GPX模拟酶制备技术就成了学术界的研究热点，对于分子生物学，生物工程学及医学等领域具有广阔的应用前景。迄今已成功开发的方法有：用化学法(中国专利94102481.4，96112628.0)或缺陷型原核表达***(中国专利200810050556.6)在非GPX类模板蛋白中引入GPX的催化基团硒代半胱氨酸(SeCys)。

中国专利94102481.4，96112628.0，99104234.4，200810050556.6公开的各类含硒抗体酶的制备方法就是应用化学突变(修饰)法在抗体类模板蛋白中引入GPX的催化基团SeCys，有以下缺点：(1)在制备过程中，仅化学突变(修饰)这一步就会损失20-40％的酶蛋白，导致模拟酶产率显著下降；(2)制备模拟酶的周期长，操作繁琐，时间长；(3)在化学突变过程中需使用苯甲基磺酰氟、乙腈等，这些物质为有毒性的物质；(4)缺乏靶向性，对于大的蛋白分子而言，一次化学反应常在不同位点引入多个非特异性催化基团，因此化学突变引入催化基团无法达到基因突变法那样的专一性。

中国专利200810050556.6也公开了人源单链含硒抗体酶的另一种制备方法是用缺陷型原核表达***(大肠杆菌)和基因突变法引入催化基团，但其仅限于人源单链含硒抗体酶的制备，不包括重组谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)及其它GPX模拟酶的制备方法。另有报道：具有GPX活性的谷胱甘肽硫转移酶(GST)的制备方法。这种方法虽然也采用缺陷型原核表达***和基因突变法引入催化基团，但其仅限于以GST为模板蛋白制备GPX模拟酶，不包括以天然GPX为模板制备重组GPX。用缺陷型原核表达***在非GPX类模板蛋白中引入催化基团制备模拟酶的方法是将催化基团引入到与GPX有相同底物GSH结合部位的它种蛋白中使其产生GPX活力。然而由于这些模板蛋白不具备天然GPX自身的催化基团，因此很难找到理想而准确的催化基团的位置；同时由于这些模板蛋白中也没有象天然GPX那样理想的催化三联体，因此这类模拟酶的催化效率不高。如果以天然GPX为模板用基因工程方法来制备重组GPX则可克服这些缺点。

由于编码GPX的催化基团SeCys的密码子UGA是终止密码子，在普通原核表达***中，需在GPX基因的开放阅读框内、紧邻SeCys的密码子UGA下游引入颈环结构才能将UGA翻译成SeCys而不是终止密码子，而开放阅读框内颈环的引入必然会引起GPX空间构象的改变，进而影响酶活性。因此普通原核表达***不适于直接表达具有GPX活性的含硒蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用基因工程法制备谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的方法。应用基因工程技术、细胞培养技术、营养缺陷型原核表达技术和SPP(Single protein production,单一蛋白生产)***低温表达技术制备具有高GPX活力的人工重组GPX。是用基因工程技术在哺乳动物细胞株或营养缺陷型原核表达***及其SPP低温表达***中直接表达具有高酶活性的重组GPX的方法。本方法不需化学修饰即可制备具有较高GPX活力的人工酶。本发明方法在生物制药方面具有广阔的应用前景。

本发明的制备重组谷胱甘肽过氧化物酶的方法，先将靶基因组装到分泌型原核表达载体上，用基因突变(或氨基酸替换)法，通过营养缺陷型原核表达***或通过营养缺陷型原核和SPP低温联合表达***，将GPX的催化基团硒代半胱氨酸(SeCys)引入到GPX的底物结合部位，因而在该蛋白上既有GPX的底物结合部位，又有催化基团，结果赋予其高的GPX的活性，就产生了高活力的重组谷胱甘肽过氧化物酶。或先将靶基因连同硒代半胱氨酸***序列组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上，再将硒代半胱氨酸***序列结合蛋白2(SBP2)组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上，将两种载体共转染同一哺乳细胞株，然后用筛选得到的同时含有GPX和SBP2两种基因的阳性细胞株制备各型重组GPX，就在体外产生了高活力的基因工程重组谷胱甘肽过氧化物酶，从而解决天然GPX来源有限的问题。

本发明的具体制备步骤：

本发明的第一种方法是用营养缺陷型原核表达***制备重组GPX。

1、表达载体的构建：

在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中GPX基因(见NCBI)序列设计引物扩增或直接合成其编码基因，确保GPX基因的5′端含有起始密码子(ATG)，3′端含有终止密码子；用多克隆位点将GPX基因组装到分泌型原核表达载体上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据要突变为半胱氨酸(Cys)的SeCys的位置和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以突变氨基酸的密码子为中心，引物长35-50bp；用定点突变引物和快速定点突变试剂盒(Invitrogen公司，按试剂盒说明书操作)，将构建在原核表达载体上的GPX基因中的SeCys的编码序列突变成Cys的密码子(比如TGC)；同样将GPX基因中的其它Cys突变成丝氨酸(Ser)；通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生；所述的多克隆位点，是载体上固有的由多个核酸限制性内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：

将含有突变的GPX基因的载体转化营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密码子合成SeCys，最后直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的GPX，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX，透析冻干后即得酶蛋白纯品。

该方法通过基因突变和营养缺陷型原核表达***在GPX的底物结合部位引入了催化基团，因而产生高活力的重组GPX。

所述的用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。

所述的将液体低温离心，可以在4℃，8000-12000g离心15-30min。

本发明的第二种方法是用SPP***和营养缺陷型原核表达***联合制备重组GPX。

1、表达载体的构建：

在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中GPX的基因序列直接合成其编码基因，确保GPX基因的5′端含有起始密码子(ATG)，3′端含有终止密码子，GPX基因的SeCys的编码序列替换为Cys的密码子(可以是TGC等)，GPX基因中其它所有Cys的密码子替换为丝氨酸(Ser)的密码子，且GPX基因全长不含有ACA序列；用多克隆位点将GPX基因组装到分泌型原核表达载体上；所述的多克隆位点，是载体上固有的由多个核酸限制性内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：

将含有合成的GPX基因的载体转化营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；再将含有表达核酸内切酶MazF的pMazF(TAKARA,Cat#3367)质粒转化阳性菌株，用含双抗性的M9固体培养基筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里，经IPTG低温4-25℃诱导表达，营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密码子合成SeCys，直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的重组GPX，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX，透析冻干后即得酶蛋白纯品。

该方法通过低温下诱导营养缺陷型原核表达***在GPX的底物结合部位引入了催化基团，因而产生高活力的重组GPX。

所述的用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。

所述的将液体低温离心，可以在4℃，8000-12000g离心15-30min。

第三种方法：用哺乳类细胞制备重组谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)。

1.表达载体的构建：

在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中GPX基因序列设计引物扩增或直接合成GPX的编码基因，确保GPX基因的5′端含有起始密码子(ATG)和期望的酶切位点，3′端在终止密码子下游引入硒代半胱氨酸***序列(SECIS)和期望的酶切位点；用多克隆位点将GPX基因连同硒代半胱氨酸***序列组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上；在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中硒代半胱氨酸***序列结合蛋白2(SBP2，见NCBI，NM_024077.3)C端的512个氨基酸(343-854aa)的基因序列设计引物扩增或直接合成其编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子(ATG)和期望的酶切位点，3′端含有终止密码子和期望的酶切位点，用多克隆位点将SBP2基因组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上；所述的多克隆位点，是载体上固有的由多个核酸限制性内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2.阳性细胞株的筛选：

用含有SBP2和GPX基因的载体在转染试剂的介导下共转染哺乳类细胞，用两个载体上的抗性基因通过抗生素浓度从高到低逐级递减法筛选兼具两种抗性的阳性细胞克隆，再用多孔培养板逐级放大培养阳性克隆，最终获得同时稳定表达SBP2和GPX两种外源蛋白的阳性细胞株；检测GPX蛋白的表达量并筛选靶蛋白表达量高的细胞株；

3.靶蛋白的表达与纯化：

在摇瓶中将同时表达两种外源蛋白的细胞株放大培养，在含有***钠的培养基里用哺乳类细胞表达重组GPX，酶蛋白以可溶性形式分泌到培养基里，用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化重组GPX，透析冻干后即得酶蛋白纯品。

所述的检测GPX蛋白的表达量，可以用每种靶蛋白的抗体和ELISA或GPX活力测定技术进行检测；

所述的用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化重组GPX，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。

本发明的第四种方法是分步用含有SBP2基因的载体和含有GPX基因的载体转染同一哺乳类细胞。

1.表达载体的构建：

在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中GPX的基因序列设计引物扩增或直接合成GPX的编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子(ATG)和期望的酶切位点，3′端在终止密码子下游引入硒代半胱氨酸***序列(SECIS)和期望的酶切位点；用多克隆位点将GPX基因连同硒代半胱氨酸***序列组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上；在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中SBP2(见NCBI，NM_024077.3)C端的512个氨基酸(343-854aa)的基因序列设计引物扩增或直接合成其编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子(ATG)和期望的酶切位点，3′端含有终止密码子和期望的酶切位点，用多克隆位点将SBP2基因组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上；所述的多克隆位点，是载体上固有的由多个核酸限制性内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2.阳性细胞株的筛选：

先用含有SBP2基因的载体转染哺乳类细胞，通过该载体上的抗性基因筛选稳定表达SBP2的细胞株。再用含有GPX基因的载体转染稳定表达SBP2的细胞株，用两个载体上的抗性基因筛选同时稳定表达SBP2和GPX两种外源蛋白的细胞株；检测GPX蛋白的表达量并筛选靶蛋白表达量高的细胞株；

3.靶蛋白的表达与纯化：

在摇瓶中将同时表达两种外源蛋白的细胞株放大培养，在含有***钠的培养基里用哺乳类细胞表达重组GPX，酶蛋白以可溶性形式分泌到培养基里；用谷胱甘肽亲和层析纯化重组GPX，透析冻干后即得酶蛋白纯品。

在阳性细胞株的筛选中，所述的阳性细胞株的筛选，也可先转染GPX基因，后转染SBP2基因，再用两个载体上的抗性基因筛选同时稳定表达SBP2和GPX两种外源蛋白的细胞株。所述的检测GPX蛋白的表达量，可以用每种靶蛋白的抗体和ELISA或GPX活力测定技术进行检测。

所述的用谷胱甘肽亲和层析纯化重组GPX，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。

本发明具有以下特点：

⑴本发明使用简单的基因合成或扩增、基因突变和表达等基因工程技术，制备方法简单。

⑵本发明方法制备的重组GPX活力高，已达到天然GPX活力的数量级水平，细胞生物学实验已证实对过氧化氢损伤的心肌细胞有防护作用。

⑶本发明使用的分泌型表达载体，能将GPX以可溶性形式表达并分泌到大肠杆菌的周质腔或哺乳类细胞的体外，引导蛋白分泌表达的前导信号肽由菌体或细胞自动切除，所表达的蛋白为可溶性，具有天然蛋白的空间构象和活性，不需复性，可避免包涵体复性过程造成的产率下降和失活，因而生产周期短。

⑷本发明使用的SPP低温表达***能利用MazF蛋白酶特异性识别并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌体只能合成编码基因中无ACA序列的蛋白质，因此新合成的蛋白主要是外源重组蛋白,从而提高产率和Cys向SeCys的转化率。

⑸本发明使用的营养缺陷型原核表达***及其与SPP低温表达***联合制备的重组GPX具有超强的稳定性，不易失活，这一特性明显优于天然GPX。

⑹本发明所用的真核表达直接使用GPX自身的硒代半胱氨酸***序列(SECIS)，不需另外引入SECIS进入表达载体，因而操作简单且可用常规真核表达载体实施。

这些优点均有利于大规模生产，为今后的实际应用打下了坚实的基础，解决天然GPX来源不足和性质不稳定的问题，在生物制药方面有广阔的应用前景。

具体实施方式：

实施例1：用营养缺陷型原核表达***制备基因工程人GPX1

在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中公开的GPX1的基因(参见NCBI,NM_000581.2)序列设计引物扩增或直接合成其编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子(ATG)和Nde I酶切位点，3′端含有终止密码子和Hind III酶切位点。用限制性内切酶Nde I和Hind III双酶切后，连接到同样酶切的pColdIII(TAKARA,Cat.#3369)载体上。在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据49号SeCys比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，引物长35-50bp，以49号SeCys的密码子(TGA)为中心。用这两条完全互补的引物和快速定点突变试剂盒(Invitrogen公司，按试剂盒说明书操作)，将构建在原核表达载体pCold III上的GPX1基因的第49号SeCys的编码序列TGA突变成Cys的密码子(TGC)，通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生,用同样方法将GPX1基因中其它所有Cys的密码子突变成Ser的密码子(TCA)。

用装有突变的GPX1基因的载体(pCold III-GPX1)转化营养缺陷型大肠杆菌BL21(DE3)Cys，涂含有Cys的营养琼脂平板，筛选阳性转化子。将阳性转化子接种于1.2L M9缺陷表达培养基(在M9培养基中加入100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素、50μg/ml Cys和除了Cys之外的19种氨基酸各100μg/ml)中至OD600为0.1，培养至OD600约为0.3-1，加入终浓度0.1-1mM的IPTG，10min后加入终浓度10μg/ml的氯霉素。加入氯霉素五分钟后培养液离心，低温6000rpm离心5分钟，用冰浴的生理盐溶液洗两次，每次用1.2L，然后用生产培养基(在M9培养基中加入除了Cys之外的19种氨基酸各50-400μg/ml)重悬，并向培养基中补充终浓度400μg的利福平和600μM SeCys。继续培养2-12h，使GPX1以可溶性形式表达在菌体的周质腔里。收集菌体(6000rpm，10min)并用等体积的bufferT(50mM Tris buffer，pH7.5，含1mM EDTA)洗涤两次。用BufferT重悬菌体沉淀，加入终浓度1mM的PMSF(苯甲基磺酰氟)，超声破碎菌体，4℃，12000rpm离心30min，收集上清。按说明书处理GSH亲合柱，应用缓冲液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡,将上清液加入GSH亲合柱上,用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，用10mmol/L GSH洗脱目的蛋白。将洗脱液透析并冻干，即得人源GPX1。其GPX活力为2865U/μmol，达到天然GPX的数量级水平。

营养缺陷型大肠杆菌BL21(DE3)Cys来源于题目为“Structure of theCathelicidin Motif of Protegrin-3Precursor:Structural Insights into the ActivationMechanism of an Antimicrobial Protein”的文章，2002年发表在Structure第10卷，1363–1370页。该菌种的获取可以由文章作者或August Bock教授赠予。

实施例2：用SPP***和营养缺陷型原核表达***联合制备基因工程人GPX1

在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中公开的GPX1的基因(参见NCBI,NM_000581.2)序列直接合成其编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子(ATG)和Nde I酶切位点，3′端含有终止密码子和Hind III酶切位点，GPX1基因的第49号SeCys的编码序列TGA替换为Cys的密码子(TGC)，GPX1基因中其它所有Cys的密码子替换为Ser的密码子，且基因全长不含有ACA序列。用限制性内切酶Nde I和Hind III双酶切后，连接到同样酶切的pCold III(TAKARA,Cat.#3369)载体上。

用装有GPX1基因的载体(pCold III-GPX1)转化营养缺陷型大肠杆菌BL21(DE3)Cys，涂含有Cys的营养琼脂平板，筛选阳性菌株。再将表达核酸内切酶MazF的质粒pMazF(TAKARA,Cat.#3369)转化到该阳性菌株中。将菌液均匀涂布在含100μg/mL Amp、25μg/mL Kana和25μg/mL的M9-CAA固体培养基中筛选阳性转化子。将阳性转化子接种于1.2L M9缺陷表达培养基(在M9培养基中加入100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素、50μg/ml Cys和除了Cys之外的19种氨基酸各100μg/ml)中至OD600为0.5。将菌液置于-20℃冰箱中5min，使菌液迅速冷却，之后将菌液置于15℃中继续振荡培养45min。15℃5000rpm离心5min，弃上清。0.9％NaCl重悬菌体沉淀，15℃5000rpm离心5min，弃上清，重复该步骤。然后用生产培养基(在M9培养基中加入除了Cys之外的19种氨基酸各50-400μg/ml)重悬菌体，加入终浓度为1mmol/L IPTG和终浓度为200μg/mL SeCys，15℃振荡培养16-48h，使GPX1以可溶性形式表达在菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达。收集菌体(6000rpm，10min)并用等体积的bufferT(50mM Tris buffer，pH7.5，含1mM EDTA)洗涤两次。用BufferT重悬菌体沉淀，加入终浓度1mM的PMSF(苯甲基磺酰氟)，超声破碎菌体，4℃，12000rpm离心30min，收集上清。按说明书处理GSH亲合柱，应用缓冲液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡,将上清液加入GSH亲合柱上,用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，用10mmol/L GSH洗脱目的蛋白。将洗脱液透析并冻干，即得人GPX1。其GPX活力为3305U/μmol，达到天然GPX的数量级水平。

本实施例使用的SPP低温表达***能利用MazF蛋白酶特异性识别并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌体只能合成编码基因中无ACA序列的蛋白质，因此新合成的蛋白主要是外源重组蛋白,从而提高产率和Cys向SeCys的转化率。

实施例3：用真核表达***一步转染制备基因工程人GPX4

1.人GPX4表达载体的构建：用mRNA小量提取试剂盒(Sigma,Cat#MRN-10)从HepG-2(DSMZ#ACC180)肝癌细胞中提取mRNA，在逆转录酶(AMV RT,Promega,Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通过RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)将其转录成双链cDNA。在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中公开的人GPX4(NCBI,NM_002085.3)的基因序列设计引物扩增GPX4的编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子(ATG)和EcoRI酶切位点，3′端引物选在GPX4mRNA的多聚寡核苷酸A前一个碱基后***NotI酶切位点，确保在GPX4终止密码子下游含有硒代半胱氨酸***序列(从GPX4的终止密码子到多聚寡核苷酸A之前的全部碱基序列)。用EcoRI/NotI酶切位点将GPX4基因连同硒代半胱氨酸***序列连接到同样酶切的哺乳类细胞表达载体pSecTag2A(Invitrogen公司)上；同理在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中人硒代半胱氨酸***序列结合蛋白2(SBP2，NCBI，NM_024077.3)C端的512个氨基酸(343-854aa)的基因序列设计引物扩增其编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子(ATG)和XbaI酶切位点，3′端含有终止密码子和EcoRI酶切位点。用多克隆位点将SBP2的C端(343-854aa)基因组装到同样酶切的胞内型哺乳类细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His A(Invitrogen公司)上。

2.人GPX4阳性细胞株的筛选：当细胞生长到1×10⁶/ml的密度时，用含有SBP2和GPX4基因的表达载体在Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen，按说明书使用)介导下共转染293F细胞(Invitrogen，R79007)，转染后72小时将细胞转入培养皿中开始贴壁培养，贴壁培养48(通常2-50)小时后换含有G418和Zeocin的培养液，筛选具有两种抗性即同时稳定表达SBP2和GPX1两种外源蛋白的阳性细胞克隆，期间G418和Zeocin浓度分别从800-200μg/ml和400-100μg/ml逐步递减，每次分别减200μg/ml和100μg/ml，每个浓度使用5天，2-3天换一次培养液，筛选培养20天后将阳性细胞克隆用96、48、24、12和6孔培养板逐级放大培养。用抗GPX4抗体和ELISA技术检测GPX4蛋白的表达量，挑选靶蛋白表达量高的细胞株用于扩培养和冻存。

3.人GPX4的表达与纯化：在大容量含有1-10μM***钠的293F表达培养基中扩培养2中筛选获得的同时稳定表达SBP2和GPX4两种外源蛋白的细胞株。在SBP2、SECIS和293细胞中其它蛋白因子的共同参与下，GPX4以可溶性形式表达并分泌于培养基中，每48小时收集一次培养液。培养液经10KDa分子量超滤膜浓缩20倍后，用GSH亲和层析柱纯化GPX4，收集含有GPX4的洗脱液，透析除去小分子物质，冻干即得人GPX4。其GPX活力为3050U/μmol，达到天然GPX的数量级水平。

实施例4：用真核表达***分步转染制备基因工程人GPX4

1.人GPX4表达载体的构建：用mRNA小量提取试剂盒(Sigma,Cat#MRN-10)从HepG-2(DSMZ#ACC180)肝癌细胞中提取mRNA，在逆转录酶(AMV RT,Promega,Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通过RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)将其转录成双链cDNA。在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中公开的人GPX4(NCBI,NM_002085.3)的基因序列设计引物扩增GPX4的编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子(ATG)和EcoRI酶切位点，3′端引物选在GPX4mRNA的多聚寡核苷酸A前一个碱基后***NotI酶切位点，确保在GPX4终止密码子下游含有硒代半胱氨酸***序列(从GPX4的终止密码子到多聚寡核苷酸A之前的全部碱基序列)。用EcoRI/NotI酶切位点将GPX4基因连同硒代半胱氨酸***序列连接到同样酶切的哺乳类细胞表达载体pSecTag2A(Invitrogen公司)上；同理在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中人硒代半胱氨酸***序列结合蛋白2(SBP2，NCBI，NM_024077.3)C端的512个氨基酸(343-854aa)的基因序列设计引物扩增其编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子(ATG)和XbaI酶切位点，3′端含有终止密码子和EcoRI酶切位点。用多克隆位点将SBP2的C端(343-854aa)基因组装到同样酶切的胞内型哺乳类细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His A(Invitrogen公司)上。

2.人GPX4阳性细胞株的筛选：当细胞生长到1×10⁶/ml的密度时，用含有SBP2基因的表达载体在Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen，按说明书使用)介导下转染293F细胞(Invitrogen，R79007)，转染后72小时将细胞转入培养皿中开始贴壁培养，贴壁培养48(通常2-50)小时后换含有G418的培养液，筛选具有G418抗性即稳定表达SBP2的阳性细胞克隆，期间G418浓度从800μg/ml逐步递减到200μg/ml，每次减200μg/ml，每个浓度使用5天，2-3天换一次培养液，筛选培养20天后将阳性细胞克隆用96、48、24、12和6孔培养板逐级放大培养。再用含有GPX4基因的表达载体在lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen，按说明书使用)介导下转染稳定表达SBP2的293F细胞(Invitrogen，R79007)，转染后72小时将细胞转入培养皿中开始贴壁培养，贴壁培养48(通常2-50)小时后换含有G418和Zeocin的培养液筛选具有两种抗性即同时稳定表达SBP2和GPX1两种外源蛋白的阳性细胞克隆，期间G418浓度维持在200μg/ml，Zeocin浓度从400μg/ml逐步递减到100μg/ml，每次减100μg/ml，每个浓度使用5天，2-3天换一次培养液，筛选培养20天后将具有两种抗性的阳性细胞克隆用96、48、24、12和6孔培养板逐级放大培养。用抗GPX4抗体和ELISA技术检测GPX4蛋白的表达量，挑选靶蛋白表达量高的细胞株用于扩培养和冻存。

上述方法也可以先转染GPX4基因，后转染SBP2基因。

3.人GPX4的表达与纯化：在大容量含有1-10μM***钠的293F表达培养基中扩培养2中筛选获得的同时稳定表达SBP2和GPX4两种外源蛋白的细胞株。在SBP2、SECIS和293F细胞中其它蛋白因子的共同参与下，GPX4以可溶性形式表达并分泌于培养基中，每48小时收集一次培养液。培养液经10KDa分子量超滤膜浓缩20倍后，用GSH亲和层析柱纯化GPX4，收集含有GPX4的洗脱液，透析除去小分子物质，冻干即得人源GPX4。其GPX活力为3050U/μmol，达到天然GPX的数量级水平。

Claims (4)

1.一种用原核表达***制备重组谷胱甘肽过氧化物酶的方法，是用营养缺陷型原核表达***制备重组GPX，具体过程是，

1)表达载体的构建：

在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中GPX基因序列设计引物扩增或直接合成其编码基因，确保GPX基因的5′端含有起始密码子，3′端含有终止密码子；用多克隆位点将GPX基因组装到分泌型原核表达载体上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据要突变为半胱氨酸的硒代半胱氨酸的位置和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以突变氨基酸的密码子为中心，引物长35-50bp，用定点突变引物和快速定点突变试剂盒，将构建在原核表达载体上的GPX基因中的硒代半胱氨酸的编码序列突变成半胱氨酸的密码子；同样将GPX基因中的其它半胱氨酸突变成丝氨酸；通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生；所述的多克隆位点，是载体上固有的由多个核酸限制性内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2)阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：

将含有突变的GPX基因的载体转化营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受态细胞，涂含半胱氨酸的营养琼脂平板，筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有硒代半胱氨酸、必需生长因子和营养素的培养基里，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导，营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用半胱氨酸的密码子合成硒代半胱氨酸，最后直接表达出在底物谷胱甘肽的结合部位含有硒代半胱氨酸的GPX，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽亲和层析纯化GPX，透析冻干后即得酶蛋白纯品。

2.根据权利要求1所述的用原核表达***制备重组谷胱甘肽过氧化物酶的方法，其特征是，所述的用谷胱甘肽亲和层析纯化GPX，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L谷胱甘肽的缓冲液洗脱目的蛋白。

3.一种用原核表达***制备重组谷胱甘肽过氧化物酶的方法，是用单一蛋白生产***和营养缺陷型原核表达***联合制备重组GPX，具体过程是，

1)表达载体的构建：

在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中GPX的基因序列直接合成其编码基因，确保GPX基因的5′端含有起始密码子，3′端含有终止密码子，GPX基因的硒代半胱氨酸的编码序列替换为半胱氨酸的密码子，GPX基因中其它所有半胱氨酸的密码子替换为丝氨酸的密码子，且GPX基因全长不含有ACA序列；用多克隆位点将GPX基因组装到分泌型原核表达载体上；所述的多克隆位点，是载体上固有的由多个核酸限制性内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2)阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：

将含有合成的GPX基因的载体转化营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受态细胞，涂含半胱氨酸的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；再将表达核酸内切酶MazF的质粒pMazF转化阳性菌株，用含双抗性的M9固体培养基筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有硒代半胱氨酸、必需生长因子和营养素的培养基里，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷低温4-25℃诱导表达，营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用半胱氨酸的密码子合成硒代半胱氨酸，直接表达出在底物谷胱甘肽的结合部位含有硒代半胱氨酸的重组GPX，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽亲和层析纯化GPX，透析冻干后即得酶蛋白纯品。

4.根据权利要求3所述的用原核表达***制备重组谷胱甘肽过氧化物酶的方法，其特征是，所述的用谷胱甘肽亲和层析纯化GPX，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L谷胱甘肽的缓冲液洗脱目的蛋白。