CN104630373A - 一种微流控芯片核酸快速并行检测方法及*** - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微流控芯片核酸快速并行检测方法及***，包括以下内容：设置一包括有微流控芯片、电机、激发光、双焦面成像透镜组、探测器、信号采集处理器和显示器的微流控芯片核酸检测***；微流控芯片包含一个以上的反应通道，微流控芯片周围设置有加热膜，微流控芯片与加热膜之间保持亚毫米的空气层；采用激发光照射微流控芯片，使核酸样品在激发光的激发下产生荧光，经双焦面成像透镜组汇聚荧光在探测器上产生模拟信号，探测器将产生的模拟信号发送到信号采集处理器生成实时荧光检测信号，并通过显示器显示实时荧光检测信号。本发明可以用于临床病原菌分子诊断、食品检验检疫、食物中毒病原菌检测、细菌学分类与流行病学调查等领域，具有较大的经济社会效益。

Description

一种微流控芯片核酸快速并行检测方法及***

技术领域

本发明涉及一种核酸检测方法及***，特别是关于一种微流控芯片核酸快速并行检测方法及***。

背景技术

微型全分析***(μTAS：Micro-separation in Miniaturized Total AnalysisSystem)是二十世纪末兴起的先进生物医学分析技术，它将样品制备、生化反应和结果检测等过程集成到一块小小的微流控芯片中，实现了从样本采集到结果报告的集成化、自动化、微型化。

样品制备是微型全分析***的第一个环节，由于原始样品的种类繁多，如血液、痰液、唾液、口腔试纸、尿液、粪便、生物组织细胞、病原菌及其感染的生物体等，因而导致样品制备实现起来相对比较复杂，缺少统一的标准，目前依然采用多种传统设备通过分立级联的方式来实现。

生化反应主要有变温扩增与等温扩增两大类型。变温扩增方法(Polymerase chainreaction，PCR)是最早的核酸扩增技术，通过正反两条特异引物完全匹配启动核酸扩增反应，以扩增周期为单位进行循环，每一个扩增周期大约90秒钟，包括变性阶段、退火阶段和延伸阶段，其中，变性阶段是在94℃高温下变性15秒钟，退火阶段是在60℃低温下退火30秒钟，延伸阶段是在72℃下通过酶的作用以引物为核酸合成起点沿模板方向延伸45秒钟。扩增过程就是由几十个或更多这样的扩增周期不断循环来完成。在变温扩增方法中，一个扩增周期只有在延伸阶段才进行核酸合成扩增，变性阶段和退火阶段只是在为核酸合成扩增做准备，因此，从时间上计算，变温扩增方法用于核酸扩增的有效时间仅占全部时间的50％。为了提高核酸扩增效率并改善温控条件，人们又先后研究了多种等温核酸扩增技术，如Walker GT等人在1992年报道的链置换扩增(Strand displacement amplification，SDA)方法、Liu D等人在1996年报道的滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)方法和Tsugunori Notomi等人在2000年报道的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法等。与变温扩增方法不同，等温扩增方法全程保持在一个固定的温度下，无需高温变性和低温退火过程，不存在温度变化引起的时间损耗，因此其扩增速度非常快，可以在较短的时间内将靶核酸扩增到10⁹-10¹⁰个拷贝。而且从时间上计算，等温扩增方法全部时间均在进行核酸扩增，时间利用率达到100％，所以等温扩增方法具有更高的核酸扩增效率。

结果检测主要有荧光方法、浊度方法等，荧光方法的检测灵敏度通常比浊度方法高，其***也相对复杂一些。荧光方法中，实时荧光定量PCR仪就是其中重要的核酸扩增实时检测仪器,不过目前这类仪器主要使用Tube管，需要20μL以上反应体系，检测灵敏度通常在1000个核酸分子拷贝数以上，仪器价格也比较昂贵，一台仪器需要20～30万元。国内有多家单位围绕基于试管实时荧光定量PCR检测开展了检测方法的研究工作，如西安天隆科技有限公司(专利号ZL200410073432.1)、中山大学达安基因股份有限公司(专利号ZL200420102062.5)等，他们的发明点在于采用不同的光纤耦合方法对试管中PCR扩增反应产物进行实时荧光定量检测，达到简化光路***结构，降低整个仪器造价成本的目的。但是由于涉及到光纤的耦合与信号传输，荧光信号接收端的数值孔径不可能很高，荧光信号在光纤中传输时随着距离的增加其损耗明显增大，因此仪器的检测灵敏度受到较大的限制。为了提高检测灵敏度和减少样品与试剂的消耗，博奥生物有限公司发明了一种微纳升体系流体芯片检测***，采用12个镜片组成双焦面成像光学检测***结构，实现了微流控芯片核酸等温扩增分析，检测样品消耗达到10μL以下。不过，该***相对比较复杂，仪器体积比较大，进样依然需要使用外置的独立离心机，并且由于是开放式风扇散热，要求环境温度低于30℃，湿度不高于80％，主要适合在实验室环境中使用。为了满足家庭、社区医疗单位、户外、海上以及地震或台风灾区等特殊环境条件的使用要求，非常有必要发展一种小型便携式,对温度、盐雾和湿度要求更宽松，操作更简单，在网电中断或网电不通的边远山区也能使用的便携式病原菌快速并行检测仪器。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种能够对痕量样本实现快速、并行、准确、高效的病原菌核酸分析鉴定的微流控芯片核酸快速并行检测方法及***。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种微流控芯片核酸快速并行检测方法，包括以下步骤：1)设置一包括有微流控芯片、电机、激发光、双焦面成像透镜组、探测器、信号采集处理器、温度控制模块、运动控制模块和显示器的微流控芯片核酸检测***；其中，微流控芯片包含一个以上反应通道，微流控芯片周围设置有加热膜，微流控芯片与加热膜之间保持亚毫米的空气层；2)根据待检测的若干核酸指标，将相应的核酸检测用分子探针分别固定在微流控芯片的反应通道底部；3)将待分析的核酸样品溶入核酸检测用试剂中，采用移液器将已溶入了核酸样品的核酸检测用试剂从微流控芯片的各进样孔注入相应的微流控通道；4)信号采集处理器通过运动控制模块控制电机实现高速旋转离心与低速旋转扫描并存，信号采集处理器在进样阶段通过控制电机带动微流控芯片高速旋转，使微流控通道中的核酸样品通过高速旋转离心自动分别进入微流控芯片的反应通道内；完成进样后，信号采集处理器通过运动控制模块控制同一电机带动微流控芯片低速旋转扫描，实现对微流控芯片上的多个反应通道快速并行检测；同时信号采集处理器通过温度控制模块控制加热膜，对微流控芯片进行亚毫米薄层空气浴流动加热，微流控芯片同时在电机驱动下作旋转运动，带动空气流动，使得微流控芯片上反应通道之间的温度均匀；根据实际应用通过温度控制模块控制微流控芯片保持在40℃～90℃温度范围内的某一温度，使得微流控芯片内各反应通道的引物被释放出，并与核酸样品和核酸检测用试剂混合，在等温扩增条件下进行核酸扩增反应，实现痕量核酸样品分子诊断；5)采用激发光照射微流控芯片，使微流控芯片中的核酸样品在激发光的激发下产生荧光，通过双焦面成像透镜组使荧光收集效率达到光学衍射极限，经双焦面成像透镜组出射的荧光被汇聚在探测器上产生模拟信号，探测器将产生的模拟信号发送到信号采集处理器生成实时荧光检测信号，并通过显示器显示实时荧光检测信号。

所述步骤2)中核酸检测用分子探针通过表面吸附固定在微流控芯片上的反应通道底部，或者采用琼脂糖或低聚糖或熔点在40℃～90℃范围内的生物相溶性材料包埋固定在微流控芯片的反应通道底部。

所述核酸检测用分子探针由6段引物组成，针对不同的核酸指标检测，6段引物设计成不同A、T、G、C碱基序列顺序和长度的核酸片段；核酸检测用试剂主要由dNTPs，EvaGreen，DTT，BstDNA Polymerase Buffer，pH 8.8at 25℃的Tris-HCl，MgSO₄，M-MLV reverse transcriptase，RNasin Plus，BstDNA Polymerase和Betaine组成，总反应体系≤1.5μL。

所述步骤3)采用移液器将已溶入了核酸样品的核酸检测用试剂从微流控芯片的各进样孔注入相应的微流控通道的具体过程为：微流控芯片上的各进样孔与移液器枪头紧密配合，在进样过程中预置一段空气柱在移液器的顶端。

所述步骤4)中微流控芯片在电机驱动下高速旋转离心进样时的转速≥6000转/分钟；微流控芯片在同一个电机驱动下进行低速旋转扫描，低速旋转扫描的转速≤2转/分钟，角度定位精度偏差≤0.1°。

一种微流控芯片核酸快速并行检测***，其特征在于：它包括微流控芯片、弹簧卡片定位结构、带轮传动结构、电机、运动控制模块、加热膜、温控模块、显示器、电源、信号采集处理器、半导体制冷光源模块、聚光镜、激发滤光片、二向色镜、反射镜、物镜、成像透镜、发射滤光片、针孔光阑和探测器；所述微流控芯片通过所述弹簧卡片定位结构进行固定，所述弹簧卡片定位结构通过所述带轮传动结构连接所述电机，所述电机连接所述运动控制模块；所述微流控芯片周围设置所述加热膜，所述微流控芯片与所述加热膜之间保持亚毫米的空气层，所述加热膜连接所述温控模块；所述运动控制模块、温控模块和显示器均连接至所述信号采集处理器；所述信号采集处理器将运动控制信号发送至所述运动控制模块，所述运动控制模块根据接收到的运动控制信号控制所述电机，所述电机通过所述带轮传动结构带动所述微流控芯片转动；同时，所述信号采集处理器将温度控制信号输送至所述温控模块，所述温控模块根据接收到的温度控制信号控制所述加热膜，使所述微流控芯片达到生物样品反应要求的温度；所述电源用于为各个用单器件进行供电，所述电源ES采用网电、太阳能和电池兼容的供电方式；所述信号采集处理器控制所述半导体制冷光源模块发射激发光，所述半导体制冷光源模块将发射的激发光经所述聚光镜准直后发射到所述激发滤光片，所述激发滤光片将激发光过滤成准单色激发光后经所述二向色镜发射到反射镜，经所述反射镜反射的激发光通过所述物镜汇聚照射所述微流控芯片的反应通道，激发所述微流控芯片反应通道中生物样品产生荧光；所述荧光经所述物镜汇聚准直成平行光后发射到所述反射镜，经所述反射镜反射的荧光发射到所述二向色镜，经所述二向色镜反射的荧光发射到所述发射滤光片过滤去除荧光中的激发光后，经所述成像透镜汇聚到所述针孔光阑，经所述针孔光阑去除杂散光后的荧光被所述探测器接收，所述探测器将探测接收的信号发送到所述信号采集处理器生成实时荧光检测信号，并通过所述显示器显示实时荧光检测信号。

所述微流控芯片包括一底板，所述底板中心设置一定位圆孔，所述定位圆孔的边缘设置一定位凹槽；位于所述定位圆孔周围的底板上设置有一条以上的微流控通道，每条所述微流控通道均包括一微通道，每一所述微通道上设置有若干反应通道，每一所述微通道的一端设置一进样孔，每一所述微通道的另一端设置一出气孔，每一所述出气孔前的微通道上设置有缓冲池；其中，所述反应通道还包含阳性质控对照反应通道和阴性质控对照反应通道，所述阳性质控对照反应通道固定有能产生荧光信号的标准质控品指标核酸探针，所述阴性质控对照反应通道固定有不能产生荧光信号的标准质控品指标探针或者是空白探针。

所述弹簧卡片定位结构包括一定位座、一定位柱和三半球形压入式弹性锁紧轴；所述定位座中心设置一与所述带轮机构进行连接用的通孔，所述定位座一侧固定设置与所述定位凹槽进行配合使用的定位柱，所述定位座周围呈120°均分对称固定设置所述三半球形压入式弹性锁紧轴；使用时，所述定位柱与所述微流控芯片的定位凹槽配合起位置导向作用，三个所述半球形压入式弹性锁紧轴通过弹性作用对所述微流控芯片MC进行张紧。

所述物镜和成像透镜采用前后焦点共轭的对称结构或非对称的结构组成双焦面成像透镜组，所述物镜与成像透镜共由六个透镜片组成，所述物镜与成像透镜的组合如下：物镜由第一镜片、第二镜片和第三镜片组成；所述成像透镜由第四镜片、第五镜片和第六镜片组成；其中，所述第二镜片与第三镜片、所述第四镜片与第五镜片分别组成两个胶合透镜，各镜片的参数如表1所示：

表1物镜与成像透镜组合中各镜片参数

所述半导体制冷光源模块采用半导体制冷LED结构和导光器件，所述半导体制冷LED结构包括LED发光芯片、第一散热片、半导体制冷器、第二散热片和风扇；所述导光器件连接所述LED发光芯片，所述LED发光芯片连接所述第一散热片，所述半导体制冷器的制冷端通过导热硅脂与所述第一散热片SH1紧密接触，所述半导体制冷器的散热端通过导热硅脂与所述第二散热片紧密接触，所述第二散热片连接所述风扇；其中，对所述半导体制冷器正向供电可满足高温环境下LED芯片在0～25℃正常工作条件的温度要求，对所述半导体制冷器反向供电则满足低温环境下LED芯片0～25℃正常工作条件的温度要求；所述导光器件采用导光棒、光纤、镜片或反射镜。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明由于采用由6段引物组成的核酸检测用分子探针，针对不同的核酸指标检测，6段引物设计成不同A、T、G、C碱基序列顺序和长度的核酸片段，因此具有对不同种属的病原菌、病毒、微生物、真菌等的特异性检测识别功能。2、本发明由于采用核酸检测用试剂与被分析的核酸样品混合，能够在微流控芯片MC上实现痕量核酸样品分子诊断应用，实现单指标核酸检测的反应体系≤1.5μL，检测限达到10个核酸分子拷贝以内。3、本发明由于采用亚毫米薄层空气浴流动加热方式对微流控芯片进行加热，通过电机驱动微流控芯片旋转运动带动空气流动，使加热温度场变得均匀，保证微流控芯片上反应通道之间的温度具有良好的一致性。4、本发明由于采用精密步进电机驱动带轮传动结构，通过优化驱动电流、传动比和采用弹簧卡片定位结构装载固定微流控芯片，实现了微流控芯片在高速旋转离心时的转速≥6000转/分钟和在高精度低速旋转扫描时的转速≤2转/分钟并存，满足微流控芯片自动进样要求，并采用数字细分方法，通过归零校正，实现高精度低速2转/分钟旋转扫描检测。5、本发明由于采用弹簧卡片定位结构承载固定微流控芯片，保证微流控芯片在高速旋转离心≥6000转/分钟过程中不脱落飞出。6、本发明由于采用物镜与成像透镜为等焦距对称双焦面成像结构，在满足较高分辨率和荧光收集效率达到***的光学衍射极限的前提下，简化了***结构，压缩了物像距离。7、本发明由于采用半导体制冷LED结构，实现了高温环境(≤65℃)或低温环境(≥-48℃)下维持LED芯片正常工作温度0～25℃，从而保证LED光源在高低温环境下发光稳定。8、本发明由于采用网电、太阳能和电池兼容的供电方式，不仅适合临床医院、家庭、社区医疗单位使用，而且满足海上、海岛、自然灾害区、室外、边远山区等网电中断或网电不通的特殊环境使用要求。9、本发明由于采用壳体主动式散热密封防潮结构，并对其表面进行耐盐雾腐蚀处理，使其具有防潮湿、耐盐雾腐蚀的功能，满足湿度95％、盐雾5mg/m³的海洋气候条件和自然灾害区环境条件的使用要求。综上所述，本发明可以广泛应用于户外、海上、网电不通的边远山区以及地震或台风灾区等特殊环境条件下的核酸检测。

附图说明

图1是本发明的微流控芯片核酸并行检测***结构示意图；

图2是本发明的微流控芯片的结构示意图；

图3(a)是本发明的弹簧卡片定位结构示意图，图3(b)是本发明的弹簧卡片定位结构固定微流控芯片的状态示意图；

图4是本发明的双焦面成像透镜组的结构示意图；

图5是本发明的电机通过带轮传动结构控制微流控芯片运动的状态示意图；

图6是本发明的半导体制冷LED结构示意图；

图7是本发明的太阳能供电结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”等仅仅是用于描述的目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

如图1所示，本发明的微流控芯片核酸并行检测***包括微流控芯片MC、弹簧卡片定位结构DW、带轮传动结构PD、电机M、运动控制模块MD、加热膜HF、温度控制模块PID、显示器LS、电源ES、信号采集处理器Pro、半导体制冷光源模块PLED、聚光镜L3、激发滤光片F1、二向色镜D、反射镜R、物镜L1、成像透镜L2、发射滤光片F2、针孔光阑PH和探测器PMT。

微流控芯片MC通过弹簧卡片定位结构DW进行固定，弹簧卡片定位结构DW通过带轮传动结构PD连接电机M，电机M连接运动控制模块MD；微流控芯片MC周围设置加热膜HF，微流控芯片MC与加热膜HF之间保持亚毫米的空气层，加热膜HF连接温度控制模块PID；运动控制模块MD、温度控制模块PID和显示器LS均连接至信号采集处理器Pro。信号采集处理器Pro将运动控制信号发送至运动控制模块MD，运动控制模块MD根据接收到的运动控制信号控制电机M，电机M通过带轮传动结构PD带动微流控芯片MC转动；同时，信号采集处理器Pro将温度控制信号输送至温度控制模块PID，温度控制模块PID根据接收到的温度控制信号控制加热膜HF的温度。电源ES用于为微流控芯片核酸检测***中的各个用单器件进行供电。

信号采集处理器Pro控制半导体制冷光源模块PLED发射激发光，半导体制冷光源模块PLED将发射的激发光经聚光镜L3准直后发射到激发滤光片F1，激发滤光片F1将激发光过滤成准单色激发光后经二向色镜D发射到反射镜R，经反射镜R反射的激发光通过物镜L1汇聚照射微流控芯片MC的反应通道，激发微流控芯片MC反应通道中生物样品产生荧光。荧光经物镜L1汇聚准直成平行光后发射到反射镜R，经反射镜R反射的荧光发射到二向色镜D，经二向色镜D反射的荧光发射到发射滤光片F2，过滤去除荧光中的激发光后，经成像透镜L2汇聚到针孔光阑PH，经针孔光阑PH去除杂散光后的荧光被探测器PMT接收，探测器PMT将接收的信号发送到信号采集处理器Pro生成实时荧光检测信号，并通过显示器LS显示实时荧光检测信号。

在一个优选的实施例中，如图2所示，微流控芯片MC包括一底板，底板中心设置一定位圆孔DC，定位圆孔DC的边缘设置一定位凹槽DL。位于定位圆孔DC的周围的底板上设置有一条以上的微流控通道，每条微流控通道均包括一微通道TL，每一微通道TL上设置有若干反应通道T，每一微通道TL的一端设置进样孔TH，每一微通道TL的另一端设置出气孔EH，每一出气孔EH前的微通道TL上设置有一缓冲池BC，用于收集多余液体，保证出气孔EH在进样中没有液体泄露，有利于出气孔的密封。微流控芯片的反应通道还包含阳性质控对照反应通道和阴性质控对照反应通道，对核酸特异性检测识别结果进行有效性指示。阳性质控对照反应通道固定有能产生荧光信号的标准质控品指标核酸探针，阴性质控对照反应通道固定有不能产生荧光信号的标准质控品指标探针或者是空白探针。

在一个优选的实施例中，如图3(a)所示，弹簧卡片定位结构DE包括一定位座XZ、一定位柱DWX和三半球形压入式弹性锁紧轴HPD。定位座XZ中心设置一与带轮传动机构PD进行连接用的通孔XZK，定位座XZ一侧固定设置与定位凹槽DL进行配合使用的定位柱DWX，定位座XZ周围呈120°均分对称固定设置三半球形压入式弹性锁紧轴HPD。如图3(b)所示，弹簧卡片定位结构DW用于承载固定微流控芯片MC，使用时，定位柱DWX与微流控芯片MC的定位凹槽DL配合起位置导向作用，三个半球形压入式弹性锁紧轴HPD通过弹性作用对微流控芯片MC进行张紧，保证微流控芯片在高速旋转离心≥6000转/分钟过程中不脱落飞出。

在一个优选的实施例中，物镜L1与成像透镜L2采用双焦面成像探测方式，物镜L1和成像透镜L2采用前后焦点共轭的对称结构或非对称的结构组成双焦面成像透镜组，使荧光收集效率接近***的光学衍射极限，中间为平行光传输或有限发散角传输。如图4所示，物镜L1与成像透镜L2共由6个透镜片组成，使荧光收集效率接近***的光学衍射极限，中间为平行光传输或有限发散角传输。物镜L1与成像透镜L2的组合如下：物镜L1由第一镜片L11、第二镜片L12和第三镜片L13组成；成像透镜L2由第四镜片L14、第五镜片L15和第六镜片L16组成。其中，第二镜片L12与第三镜片L13、第四镜片L14与第五镜片L15分别组成两个胶合透镜，各镜片的参数如表1所示。物镜L1和成像透镜L2通过光学冷加工和光学镀膜制作完成，其精度误差范围为±1.0mm，物镜L1与成像透镜L2组合的荧光收集效率达到***的光学衍射极限，检测灵敏度≥10个核酸分子拷贝/指标。

表1物镜L1与成像透镜L2组合中各镜片参数

在一个优选的实施例中，如图5所示，电机M可以采用现有技术中的步进电机DJ，带轮传动机构PD可以采用现有器件；其中，步进电机DJ的输出轴固定连接驱动轮DL，驱动轮DL通过齿性带PDD连接与被动轮BL，被动轮BL固定设置在弹簧卡片定位结构DW的定位座XZ上。工作时，运动控制模块MD根据接收到的运动控制信号控制电机M驱动微流控芯片MC，实现高速旋转离心≥6000转/分钟和高精度低速旋转扫描≤2转/分钟，满足微流控芯片MC自动进样和实时荧光信号检测的使用要求，其中，运动控制模块MD为现有技术的成熟器件，在此不再赘述；另外，电机M并不局限于步进电机，还可以采用侍服电机或直流电机。

在一个优选的实施例中，如图6所示，半导体制冷光源模块PLED采用半导体制冷LED结构和导光棒GB，半导体制冷LED结构包括LED发光芯片LC、第一散热片SH1、半导体制冷器PWT、第二散热片SH2、风扇FAN。导光棒GB连接LED发光芯片LC，LED发光芯片LC连接第一散热片SH1，半导体制冷器PWT的制冷端通过导热硅脂与第一散热片SH1紧密接触，半导体制冷器PWT的散热端通过导热硅脂与第二散热片SH2紧密接触，第二散热片SH2连接风扇FAN。对半导体制冷器PWT正向供电可以满足高温环境(≤65℃)下LED芯片在0～25℃正常工作条件的温度要求，如果对半导体制冷器PWT反向供电则可以满足低温环境(≥-48℃)下LED芯片0～25℃正常工作条件的温度要求。其中，也可以采用光纤或镜片或反射镜等导光器件代替导光棒GB，进行远距离隔离传光，降低环境温度对LED发光芯片的热辐射影响，提高光源的稳定性，满足-48℃～65℃范围的高低温环境的使用要求。

在一个优选的实施例中，电源ES可以采用网电、太阳能和电池兼容的供电方式。网电可以通过电源适配器连接使用；电池可以采用锂电池或化学电池；如图7所示，太阳能供电***包括蓄电池CL、充电调压控制器CD和太阳能电池板SB，蓄电池CL通过充电调压控制器CD和太阳能电池板SB连接。

在一个优选的实施例中，微流控芯片核酸快速并行检测***可以采用耐盐雾腐蚀表面处理和壳体主动式散热密封防潮结构。

在一个优选的实施例中，加热膜HF与温度控制模块PID负责保证微流控芯片MC的温度满足核酸扩增反应的条件要求，温度控制模块PID为现有技术成熟器件，在此不再赘述。

在一个优选的实施例中，信号采集处理器Pro可以将检测结果通过有线或无线通讯的方式进行数据传输，有线通讯方式包括并口、串口、USB、以太网或1394等，无线通讯包括蓝牙、WIFI或Zigbee等。

综上所述，本发明提供的微流控芯片核酸快速并行检测方法，包括以下步骤：

1、根据待检测的若干核酸指标，将相应的核酸检测用分子探针分别固定在微流控芯片的反应通道底部。

其中，核酸检测用分子探针由6段引物组成，固定在微流控芯片MC的反应通道底部，针对不同的核酸指标检测，6段引物被设计成不同A、T、G、C碱基序列顺序和长度的核酸片段，具有对不同种属的病原菌、病毒、微生物、真菌等的特异性检测识别功能；

核酸检测用分子探针可以用其他低聚糖或低熔点生物相融性材料包埋在微流控芯片MC的反应通道底部，如糖醇、麦芽糖等，通过便携式检测***加热在40℃～90℃温度范围内熔化释放出引物，与被测样品和反应试剂混合，进行核酸扩增反应。

核酸检测用分子探针的6段引物适合核酸等温扩增分子诊断分析，其用于检测大肠杆菌的一组特异核酸片段序列设计结果为：

引物No.1-GGCATCGTGG TGATTGATGA；

引物No.2-GGTTCGTTGG CAATACTCCA；

引物No.3-TCTTTCGGCT TGTTGCCCGC CTGCTGTCGG CTTTAACCTC；

引物No.4-TACAGCGAAG AGGCAGTCAA CGGGTTTTTG TCACGCGCTA TC；

引物No.5-TTCGAAACCA ATGCCTAAAG A；

引物No.6-GCGCACTTAC AGGCGATT。

2、将待分析的核酸样品溶入核酸检测用试剂中,采用移液器将已溶入了核酸样品的核酸检测用试剂从微流控芯片的各进样孔注入相应的微流控通道，具体实施过程中，微流控芯片MC的进样孔与移液器枪头紧密配合，在进样过程中通过预置一段空气柱在移液器顶端，来保证微流控芯片加样结束拔出移液器枪头后，其进样孔没有液体泄露，有利于进样孔的密封。

其中，核酸检测用试剂主要由dNTPs，EvaGreen，DTT，BstDNA Polymerase Buffer，Tris-HCl(pH 8.8at 25℃)，MgSO₄，M-MLV reverse transcriptase，RNasin Plus，BstDNA Polymerase，Betaine组成，能够在微流控芯片上实现痕量核酸样品分子诊断应用，单指标核酸检测的反应体系≤1.5μL，检测限达到10个核酸分子拷贝以内。

3、信号采集处理器Pro通过控制电机MC实现高速旋转离心与低速旋转扫描并存，信号采集处理器Pro在进样阶段通过运动控制模块MD控制电机M带动微流控芯片MC高速旋转，使微流控通道中的核酸样品通过高速旋转离心自动进入微流控芯片MC的反应通道内，完成进样后，信号采集处理器Pro通过控制同一个电机M带动微流控芯片MC低速旋转扫描，实现对微流控芯片上的多个反应通道快速并行检测；信号采集处理器Pro通过温度控制模块PID控制加热膜HF，对微流控芯片MC进行亚毫米薄层空气浴流动加热，微流控芯片MC同时在电机M驱动下作旋转运动，带动空气流动，使得微流控芯片上反应通道之间的温度均匀；根据实际应用通过温度控制模块PID控制微流控芯片MC持在40℃～90℃温度范围内的某一温度，使得微流控芯片MC内各反应通道的引物被释放出，并与核酸样品和核酸检测用试剂混合，在等温扩增条件下进行核酸扩增反应，实现痕量核酸样品分子诊断。

4、采用激发光照射微流控芯片，使微流控芯片中的核酸样品在激发光的激发下产生荧光；通过双焦面成像光学***结构使荧光收集效率达到光学衍射极限；荧光被汇聚在探测器上产生模拟信号，探测器将产生的模拟信号发送到信号采集处理器Pro生成实时荧光检测信号，并通过显示器LS显示实时荧光检测信号曲线。

上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式和制作工艺等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。

Claims (10)

1.一种微流控芯片核酸快速并行检测方法，包括以下步骤：

1)设置一包括有微流控芯片、电机、激发光、双焦面成像透镜组、探测器、信号采集处理器、温度控制模块、运动控制模块和显示器的微流控芯片核酸检测***；其中，微流控芯片包含一个以上反应通道，微流控芯片周围设置有加热膜，微流控芯片与加热膜之间保持亚毫米的空气层；

2)根据待检测的若干核酸指标，将相应的核酸检测用分子探针分别固定在微流控芯片的反应通道底部；

3)将待分析的核酸样品溶入核酸检测用试剂中，采用移液器将已溶入了核酸样品的核酸检测用试剂从微流控芯片的各进样孔注入相应的微流控通道；

4)信号采集处理器通过运动控制模块控制电机实现高速旋转离心与低速旋转扫描并存，信号采集处理器在进样阶段通过控制电机带动微流控芯片高速旋转，使微流控通道中的核酸样品通过高速旋转离心自动分别进入微流控芯片的反应通道内；完成进样后，信号采集处理器通过运动控制模块控制同一电机带动微流控芯片低速旋转扫描，实现对微流控芯片上的多个反应通道快速并行检测；同时信号采集处理器通过温度控制模块控制加热膜，对微流控芯片进行亚毫米薄层空气浴流动加热，微流控芯片同时在电机驱动下作旋转运动，带动空气流动，使得微流控芯片上反应通道之间的温度均匀；根据实际应用通过温度控制模块控制微流控芯片保持在40℃～90℃温度范围内的某一温度，使得微流控芯片内各反应通道的引物被释放出，并与核酸样品和核酸检测用试剂混合，在等温扩增条件下进行核酸扩增反应，实现痕量核酸样品分子诊断；

5)采用激发光照射微流控芯片，使微流控芯片中的核酸样品在激发光的激发下产生荧光，通过双焦面成像透镜组使荧光收集效率达到光学衍射极限，经双焦面成像透镜组出射的荧光被汇聚在探测器上产生模拟信号，探测器将产生的模拟信号发送到信号采集处理器生成实时荧光检测信号，并通过显示器显示实时荧光检测信号。

2.如权利要求1所述的一种微流控芯片核酸快速并行检测方法，其特征在于：所述步骤2)中核酸检测用分子探针通过表面吸附固定在微流控芯片上的反应通道底部，或者采用琼脂糖或低聚糖或熔点在40℃～90℃范围内的生物相溶性材料包埋固定在微流控芯片的反应通道底部。

3.如权利要求1～2任一项所述的一种微流控芯片核酸快速并行检测方法，其特征在于：核酸检测用分子探针由6段引物组成，针对不同的核酸指标检测，6段引物设计成不同A、T、G、C碱基序列顺序和长度的核酸片段；核酸检测用试剂主要由dNTPs，EvaGreen，DTT，BstDNA Polymerase Buffer，pH 8.8at 25℃的Tris-HCl，MgSO₄，M-MLV reverse transcriptase，RNasin Plus，BstDNA Polymerase和Betaine组成，总反应体系≤1.5μL。

4.如权利要求1～3任一项所述的一种微流控芯片核酸快速并行检测方法，其特征在于：所述步骤3)采用移液器将已溶入了核酸样品的核酸检测用试剂从微流控芯片的各进样孔注入相应的微流控通道的具体过程为：微流控芯片上的各进样孔与移液器枪头紧密配合，在进样过程中预置一段空气柱在移液器的顶端。

5.如权利要求1～4任一项所述的一种微流控芯片核酸快速并行检测方法，其特征在于：所述步骤4)中微流控芯片在电机驱动下高速旋转离心进样时的转速≥6000转/分钟；微流控芯片在同一个电机驱动下进行低速旋转扫描，低速旋转扫描的转速≤2转/分钟，角度定位精度偏差≤0.1°。

6.一种实现如权利要求1～5任一项所述微流控芯片核酸快速并行检测方法的***，其特征在于：它包括微流控芯片、弹簧卡片定位结构、带轮传动结构、电机、运动控制模块、加热膜、温控模块、显示器、电源、信号采集处理器、半导体制冷光源模块、聚光镜、激发滤光片、二向色镜、反射镜、物镜、成像透镜、发射滤光片、针孔光阑和探测器；所述微流控芯片通过所述弹簧卡片定位结构进行固定，所述弹簧卡片定位结构通过所述带轮传动结构连接所述电机，所述电机连接所述运动控制模块；所述微流控芯片周围设置所述加热膜，所述微流控芯片与所述加热膜之间保持亚毫米的空气层，所述加热膜连接所述温控模块；所述运动控制模块、温控模块和显示器均连接至所述信号采集处理器；所述信号采集处理器将运动控制信号发送至所述运动控制模块，所述运动控制模块根据接收到的运动控制信号控制所述电机，所述电机通过所述带轮传动结构带动所述微流控芯片转动；同时，所述信号采集处理器将温度控制信号输送至所述温控模块，所述温控模块根据接收到的温度控制信号控制所述加热膜，使所述微流控芯片达到生物样品反应要求的温度；所述电源用于为各个用单器件进行供电，所述电源ES采用网电、太阳能和电池兼容的供电方式；

所述信号采集处理器控制所述半导体制冷光源模块发射激发光，所述半导体制冷光源模块将发射的激发光经所述聚光镜准直后发射到所述激发滤光片，所述激发滤光片将激发光过滤成准单色激发光后经所述二向色镜发射到反射镜，经所述反射镜反射的激发光通过所述物镜汇聚照射所述微流控芯片的反应通道，激发所述微流控芯片反应通道中生物样品产生荧光；所述荧光经所述物镜汇聚准直成平行光后发射到所述反射镜，经所述反射镜反射的荧光发射到所述二向色镜，经所述二向色镜反射的荧光发射到所述发射滤光片过滤去除荧光中的激发光后，经所述成像透镜汇聚到所述针孔光阑，经所述针孔光阑去除杂散光后的荧光被所述探测器接收，所述探测器将探测接收的信号发送到所述信号采集处理器生成实时荧光检测信号，并通过所述显示器显示实时荧光检测信号。

7.如权利要求6所述的一种微流控芯片核酸快速并行检测***，其特征在于：所述微流控芯片包括一底板，所述底板中心设置一定位圆孔，所述定位圆孔的边缘设置一定位凹槽；位于所述定位圆孔周围的底板上设置有一条以上的微流控通道，每条所述微流控通道均包括一微通道，每一所述微通道上设置有若干反应通道，每一所述微通道的一端设置一进样孔，每一所述微通道的另一端设置一出气孔，每一所述出气孔前的微通道上设置有缓冲池；其中，所述反应通道还包含阳性质控对照反应通道和阴性质控对照反应通道，所述阳性质控对照反应通道固定有能产生荧光信号的标准质控品指标核酸探针，所述阴性质控对照反应通道固定有不能产生荧光信号的标准质控品指标探针或者是空白探针。

8.如权利要求7所述的一种微流控芯片核酸快速并行检测***，其特征在于：所述弹簧卡片定位结构包括一定位座、一定位柱和三半球形压入式弹性锁紧轴；所述定位座中心设置一与所述带轮机构进行连接用的通孔，所述定位座一侧固定设置与所述定位凹槽进行配合使用的定位柱，所述定位座周围呈120°均分对称固定设置所述三半球形压入式弹性锁紧轴；使用时，所述定位柱与所述微流控芯片的定位凹槽配合起位置导向作用，三个所述半球形压入式弹性锁紧轴通过弹性作用对所述微流控芯片MC进行张紧。

9.如权利要求6～8任一项所述的一种微流控芯片核酸快速并行检测***，其特征在于：所述物镜和成像透镜采用前后焦点共轭的对称结构或非对称的结构组成双焦面成像透镜组，所述物镜与成像透镜共由六个透镜片组成，所述物镜与成像透镜的组合如下：物镜由第一镜片、第二镜片和第三镜片组成；所述成像透镜由第四镜片、第五镜片和第六镜片组成；其中，所述第二镜片与第三镜片、所述第四镜片与第五镜片分别组成两个胶合透镜，各镜片的参数如表1所示：

表1 物镜与成像透镜组合中各镜片参数

10.如权利要求6～9任一项所述的一种微流控芯片核酸快速并行检测***，其特征在于：所述半导体制冷光源模块采用半导体制冷LED结构和导光器件，所述半导体制冷LED结构包括LED发光芯片、第一散热片、半导体制冷器、第二散热片和风扇；所述导光器件连接所述LED发光芯片，所述LED发光芯片连接所述第一散热片，所述半导体制冷器的制冷端通过导热硅脂与所述第一散热片SH1紧密接触，所述半导体制冷器的散热端通过导热硅脂与所述第二散热片紧密接触，所述第二散热片连接所述风扇；其中，对所述半导体制冷器正向供电可满足高温环境下LED芯片在0～25℃正常工作条件的温度要求，对所述半导体制冷器反向供电则满足低温环境下LED芯片0～25℃正常工作条件的温度要求；所述导光器件采用导光棒、光纤、镜片或反射镜。