CN104630228B - 棉花热激转录因子基因GhHsf39的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明是基因工程与分子育种领域，公开了一种棉花热激转录因子基因GhHsf39的启动子及其应用；所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在植物受到非生物胁迫时，pghhsf39可以调控目的基因的表达。本发明从陆地棉中克隆的pghhsf39序列在受到不同的非生物胁迫刺激时，它可以上调GhHSF39基因的表达量。利用本发明的pghhsf39启动子与目的基因相连接形成表达盒，通过遗传转化，可以获得受逆境胁迫调控目的基因表达的转基因植物。pghhsf39的发明为研究植物抗逆、抗病等提供了重要的启动子元件，因而具有广泛的应用价值。

Description

棉花热激转录因子基因GhHsf39的启动子及其应用

技术领域

本发明涉及的是一个基因工程技术领域的基因启动子及其用途，属于生物技术领域，具体涉及一种棉花热激转录因子基因GhHsf39的启动子及其应用。

背景技术

绝大部分植物不能自主选择生长条件，因此需要根据不断变化的环境条件调整各种生理活动，以完成必要的生命过程。基因的表达调控主要是通过启动子来实现基因在转录水平上的变化，从而实现植物生长发育与代谢调节。启动子是位于基因上游的一段特定区域内的核苷酸序列，一般含多种顺式作用元件，这些顺式作用元件和各种反式作用因子协同作用，调控RNA聚合酶在特定的时间和空间上对基因进行不同水平的转录。

依据植物体内启动子启动基因转录的方式，可将其分为三种：组成型、组织或器官特异型、诱导型。前两种启动子启动基因的方式是持续性的，无条件的，RNA和蛋白质的表达是稳定的，因此这两类启动子在利用的时候存在一定的弊端。它们无法从时空上特异的调控基因的表达，会导致所启动的基因在植物体内持续表达，过度消耗细胞的物质和能量。例如烟草花叶病毒35S启动子(CaMV35)。它会驱动外源基因在植物的所有组织和器官中持续高水平表达，很可能会对植物的正常生长造成一定的危害。

诱导型启动子的特点是只在某些特定的物理化学或生物刺激出现的时候才启动或提高基因的表达，这类启动子可以快速有效地诱导目的基因的“开、关”，可根据需要在植物特定发育阶段、组织器官或生长环境下接受诱导信号，启动基因表达；也可以随着刺激的消除而解除诱导，停止基因的表达。这样不仅能有效地发挥基因的作用，又不会造成植物体内物质和能量的浪费，因此克隆各种不同的诱导型启动子对于植物基因工程育种具有重要意义。

目前，已经在不同植物中有关诱导表达启动子的报道。但是，在棉花上有关受到高温、干旱以及高浓度盐等逆境诱导表达的启动子还没有报道。本专利以棉花为材料克隆了pghhsf39启动子，该启动子在棉花植株遇到不同非生物逆境胁迫时可以快速启动或上调GhHSF39基因的表达。此外，本发明通过分子生物学手段建立了pghhsf39启动子与报告基因的表达盒，通过转基因的功能分析，证实其可以作为植物基因工程的有效启动子来控制不同的目的基因的表达，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一个受非生物逆境诱导的基因的启动子，具体为一种棉花热激转录因子基因GhHsf39的启动子及其应用，为植物抗逆基因工程育种提供支持。该启动子具有多个特点：(1)可以响应多个不同逆境因素，例如高温、干旱、高盐以及高pH；(2)启动子具有相应快速的特点：当棉花受到各种非生物逆境胁迫时，GhHSF39基因启动子会迅速上调目的基因的表达量；当胁迫消失时，目的基因的表达水平又会迅速降低，恢复到原来水平。由于pghhsf39启动子具有快速响应的特点，因而可以有效减少植物的能量消耗。

本发明是通过以下技术方案实现的，

第一方面，本发明涉及一种核苷酸pghhsf39，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明涉及一对用于扩增所述核苷酸pghhsf39的引物对，序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

第三方面，本发明涉及一种重组载体，包含所述核苷酸pghhsf39，如pMD19-T克隆载体、重组载体pEarleygate101-pghhsf39::GhHSF39-YFP等。

第四方面，本发明涉及一种转化体，包含权利要求1所述的核苷酸pghhsf39。

优选地，所述转化体采用的宿主为大肠杆菌或农杆菌。

第五方面，本发明涉及一种所述核苷酸pghhsf39作为启动子的用途；所述启动子连接的基因序列的来源可以是同一物种，也可以是不同物种。

优选地，所述用途具体为核苷酸pghhsf39作为启动子调控非生物逆境诱导基因表达中的应用。

优选地，所述用途具体为，以核苷酸pghhsf39作为启动子，调控基因的表达，进而实现调控植物抗逆性或调控抗病能力。

优选地，所述用途具体为核苷酸pghhsf39在非生物逆境中进行基因表达调控的应用，所述应用包括如下步骤：

步骤一，将pghhsf39启动子连接目的基因编码序列并连入表达载体，得重组载体；

步骤二，将所述重组载体转化农杆菌，得农杆菌工程菌；

步骤三，将所述农杆菌工程菌转化目标植物，即可实现启动子pghhsf39在非生物逆境中对基因表达的调控。

优选地，所述目标植物包括烟草。

优选地，所述用途具体为核苷酸pghhsf39作为启动子在植物育种中的用途。

优选地，所述用途具体为调控基因的表达具体为调控GhHSF39基因的表达量。

第六方面，本发明涉及一种所述核苷酸pghhsf39的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：从棉花基因组中克隆热激转录因子基因GhHsf39的启动子区域并转化大肠杆菌，筛选阳性克隆进行DNA测序，用测序所得序列减去GhHsf39基因的序列，即得所述启动子pghhsf39的核酸序列。

优选地，所述棉花为陆地棉。

本发明具有如下有益效果：本发明提供的GhHSF39基因启动子，可在植物受到非生物逆境时迅速启动目的基因的表达；当逆境胁迫消失时，目的基因的表达量又会迅速恢复，因此基本不会影响植物的整个生长发育过程，可以广泛应用于植物抗逆基因工程育种中。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是pghhsf39启动子的克隆的电泳图；

其中，1是棉花热激转录因子GhHSF39基因启动子克隆的PCR扩增产物；

图2是棉花受到不同的非生物逆境胁迫时，GhHSF39基因在启动子pghhsf39调控下的不同表达变化；

图3是瞬时转化重组载体pEarleygate101-pghhsf39::GhHSF39-YFP的烟草中GhHSF39-YFP的表达及热激后表达情况；

其中，A：热激之前，暗场；B：热激之前，明场；C：热激之前，暗明合并；D：热激之后，暗场；E：热激之后，明场；F：热激之后，暗明合并。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明涉及的农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开；质粒载体pEarleyGate101可通过公开市售的商业渠道取得。

实施例1热激转录因子GhHSF39基因的启动子克隆及序列分析

(1)PCR扩增目的片段

根据已经公布的雷蒙德棉(Gossypium raimondii)热激转录因子GhHSF39基因启动子区的序列设计引物，扩增产物大小为1711bp。

GhHSF39-pro F(SEQ ID NO.2)：5’-TAAAAATAAAATTCGGTTCGAGTAAATG-3’

GhHSF39-pro R(SEQ ID NO.3)：5’-AGTCAAGAACGGCGGCGGACCAACCTCG-3’

提取陆地棉(Gossypium hirsutum)基因DNA，并稀释至100ng/μl作为模板，利用上述引物进行PCR扩增。

(2)目的片段的回收和构建中间载体

通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段(图1)，采用康为世纪公司的快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，具体操作步骤见试剂盒说明书。

如图1所示，Marker：DL2000DNA Marker；1：棉花热激转录因子GhHSF39基因启动子克隆的PCR扩增产物。

将回收的目的DNA片段与TaKaRa公司的pMD19-T克隆载体连接，具体操作步骤见试剂盒说明书。将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，均匀涂布到含有羧苄青霉素的LB培养基平板上，37℃倒置培养16-20小时。挑取平板上的菌落，摇菌培养，取菌液做模板进行PCR阳性鉴定。

(3)测序验证

经过鉴定的阳性克隆，送交菌液到上海博尚生物技术有限公司进行DNA测序，将所得序列减去属于GhHSF39基因的部分，得到启动子序列，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为pghhsf39。

实施例2：pghhsf39启动子驱动的GhHSF39基因在棉花中受不同胁迫时的表达分析

2.1棉花幼苗的逆境胁迫处理和RNA抽提

(1)不同逆境处理棉花幼苗

取五叶期的陆地棉Coker312，用42℃环境模拟热胁迫，处理整个植株一小时，然后于30℃下恢复四小时，分时间段收集叶片；用200mM甘露醇溶液、pH为8.8的MS培养基、100mM氯化钠溶液分别模拟干旱胁迫、碱胁迫、盐胁迫，持续处理三小时，分时间段收集根部。所有收集的材料立刻放入液氮保存，用于RNA的抽提。

(2)抽提上述材料RNA

取对照组和各种不同实验组的组织材料，采用天根生化科技(北京)有限公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取RNA，具体操作步骤见试剂盒说明书。

2.2一链cDNA的合成和荧光定量PCR分析

(1)将RNA反转录为一链的cDNA

采用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒将RNA反转成一链的cDNA，具体操作步骤见试剂盒说明书。

(2)荧光定量PCR分析

根据GhHSF39基因的编码序列(coding sequence，CDS)设计特异性引物用于荧光定量PCR，序列如下：

GhHSF39RT F(SEQ ID NO.4)：5’-GCCTTTACTCAATGAGCACCAGATGATG-3’

GhHSF39RT R(SEQ ID NO.5)：5’-TTAATTGAGCAGCAGCTGTTGACAGACTAGA-3’

采用ubiquitin基因作为内参，根据ubiquitin基因序列设计特异性引物，序列如下：

ubiquitin F(SEQ ID NO.6)：5’-CCAGAAGGAATCCACTTTGC-3’

ubiquitin R(SEQ ID NO.7)：5’-CCAGCTCACATCAGCATACG-3’

采用TaKaRa公司的Premix Ex TaqTM II试剂盒进行荧光定量PCR，具体操作步骤见试剂盒说明书。使用EXCEL软件进行数据分析，分析采用方法为2(-ΔΔCt)。

结果表明，如图2，热激胁迫一小时之后，在启动子pghhsf39的控制下，GhHSF39基因的表达量提高了400倍以上，环境温度恢复正常后，表达量迅速降低到热激之前水平；在干旱胁迫和碱胁迫下，GhHSF39基因的表达量随时间推移逐渐提高，但提高幅度只有约1-3倍；植株受到盐胁迫时，GhHSF39的表达水平呈现先升后降的情况，处理至1小时时，表达量逐渐上升，1-3小时时表达量逐渐下降。基因GhHSF39的这些表达变化说明启动子pghhsf39是胁迫诱导型的，特别是对热胁迫具有强烈的反应，并且当热胁迫消失后，能够迅速降低基因的表达量。

实施例3：重组载体pEarleygate101-pghhsf39::GhHSF39-YFP构建及烟草瞬时转 化分析

3.1重组载体pEarleygate101-pghhsf39::GhHSF39-YFP构建

(1)连接启动子pghhsf39和基因GhHSF39的CDS序列

根据启动子pghhsf39和基因GhHSF39的CDS序列，设计引物：

pghhsf39FStuⅠ(SEQ ID NO.8)5’-AAAAGGCCTTTTTAAAAATAAAATTCGGTTCGAGTAAATG-3’

pghhsf39R(SEQ ID NO.9)5’-CCGGAATTCCGGTTGAGACTTCGTTTTCACTTCAC-3’

GhHSF39CDS F(SEQ ID NO.10)5’-CCGGAATTCCGGATGGAAGGAGTTGTAGTAAAAGAAGAG-3’

GhHSF39CDS R SpeⅠ(SEQ ID NO.11)5’-CGGACTAGTCCGTGGATTTGACCTGAGATAACCC-3’

使用GhHSF39CDS F、GhHSF39CDS R SpeⅠ从棉花cDNA中将基因GhHSF39的CDS克隆出来，具体方法参考实施例1。然后利用重叠PCR方法，使用引物pghhsf39F StuⅠ，pghhsf39R，GhHSF39F，GhHSF39R SpeⅠ，连接pghhsf39和GhHSF39的CDS，获得两端带有酶切位点StuⅠ和SpeⅠ的pghhsf39-GhHSF39的PCR产物。

(2)使用限制性内切酶酶切

对PCR产物进行电泳，回收纯化目的片段。用StuⅠ和SpeⅠ对回收片段进行酶切，用StuⅠ和AvrⅡ对植物表达载体pEarleygate101进行酶切，回收酶切产物。

(3)使用连接酶连接上述酶切产物

使用T4连接酶将上述酶切产物连接，得到重组载体pEarleygate101-pghhsf39::GhHSF39-YFP，此载体的基因表达产物带有黄色荧光蛋白标签。

3.2瞬时转化烟草和热激分析

(1)将重组载体转化农杆菌

用冻融法将重组载体pEarleygate101-pghhsf39::GhHSF39-YFP转化到农杆菌EHA105中，挑取平板上的农杆菌单克隆，接种到1ml液体抗性培养基中，在28℃摇床中培养24小时。

(2)瞬时转化烟草

将菌液转接到10ml液体培养基中(含有10mM的MES和40uM的AS)，在28℃摇床中培养16小时。离心菌液收集菌体，用10mM的MgCl₂溶液重悬菌体至OD600＝1，最后加入AS至终浓度为200uM并静置3小时。取三周龄烟草，用除去针头的注射器紧贴烟草叶背将上述菌液注射到叶肉中。

(3)观察基因表达情况及热激处理

上述烟草暗培养三天后，剪取小块叶片，在激光共聚焦显微镜下观察基因表达情况。将烟草植株放在42℃环境中，热激一小时，之后立刻再用激光共聚焦显微镜观察基因表达情况，如图3。上述烟草暗培养三天后，剪取小块叶片，在激光共聚焦显微镜下观察基因表达情况。将烟草植株放在42℃环境中，热激一小时，之后立刻再用激光共聚焦显微镜观察基因表达情况。如图所示：热激之后基因表达量明显高于热激之前，说明在逆境刺激时，启动子pghhsf39的确可以上调基因的表达量。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种核苷酸pghhsf39，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述的核苷酸pghhsf39。

3.一种转化体，其特征在于，包含权利要求1所述的核苷酸pghhsf39。

4.一种如权利要求1所述的核苷酸pghhsf39作为启动子的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用途具体为核苷酸pghhsf39在非生物逆境中进行基因表达调控的应用，所述应用包括如下步骤：

步骤一，将pghhsf39启动子连接目的基因编码序列并连入表达载体，得重组载体；

步骤二，将所述重组载体转化农杆菌，得农杆菌工程菌；

步骤三，将所述农杆菌工程菌转化目标植物，即可实现启动子pghhsf39在非生物逆境中对基因表达的调控。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用途具体为核苷酸pghhsf39作为启动子在植物育种中的用途。

7.一种制备如权利要求1所述核苷酸pghhsf39的方法，其特征在于，包括如下步骤：从棉花基因组中克隆热激转录因子基因GhHsf39的启动子区域并转化大肠杆菌，筛选阳性克隆进行DNA测序，用测序所得序列减去GhHsf39基因的序列，即得所述启动子pghhsf39的核酸序列；具体方法如下：

(1)PCR扩增目的片段

根据已经公布的雷蒙德棉热激转录因子GhHSF39基因启动子区的序列设计引物，扩增产物大小为1711bp；

GhHSF39-pro F(SEQ ID NO.2)：5’-TAAAAATAAAATTCGGTTCGAGTAAATG-3’

GhHSF39-pro R(SEQ ID NO.3)：5’-AGTCAAGAACGGCGGCGGACCAACCTCG-3’

提取陆地棉基因DNA，并稀释至100ng/μl作为模板，利用上述引物进行PCR扩增；

(2)目的片段的回收和构建中间载体

通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，采用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒；

将回收的目的DNA片段与pMD19-T克隆载体连接；将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，均匀涂布到含有羧苄青霉素的LB培养基平板上，37℃倒置培养16-20小时；挑取平板上的菌落，摇菌培养，取菌液做模板进行PCR阳性鉴定；

(3)测序验证

经过鉴定的阳性克隆，送交菌液进行DNA测序，将所得序列减去属于GhHSF39基因的部分，得到启动子序列，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为pghhsf39。