CN104630210A - Gli2基因作为猪初生重性状相关分子标记及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种GLI2基因作为猪初生重性状相关分子标记及制备方法和应用，其步骤：A、用猪序列为模板设计引物，提取猪基因组DNA。1）将猪的肌肉组织在液氮中磨碎；2）将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酚，冷冻；3）加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，转移另离心管中；4）加入等体积的氯仿/异戊醇，冷冻，离心；5）将上清液吸入标记好的离心管中，加入无水乙醇；6）用枪头将DNA沉淀挑出，加入纯水溶解DNA；7）在DNA浓度测定仪上测定其浓度，紫外灯下检测提取的DNA质量；B、设计引物，获得所示的核苷酸序列。结果可靠，它对目标基因的转移可在育种早期进行选择，大大缩短了育种周期，提高育种效率达2-3倍，具有明显的优越性。

Description

GLI2基因作为猪初生重性状相关分子标记及制备方法和应用

技术领域

本发明属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关分子标记，同时还涉及一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关分子标记的制备方法，还涉及一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关分子标记的用途。

背景技术

猪是重要的经济动物，猪肉由于其肉嫩味美长期以来广受消费者的青睐，是我国人民动物性蛋白的主要来源之一。近年来，人们对猪肉的消费量与日俱增，如何提高生产性能、降低生产成本成了猪育种工作者的工作重点之一。

分子生物学技术的迅速发展为此提供了重要的契机，凭借这一技术手段，科学家们发掘出了一大批与猪的初生重，断奶重，产仔数等重要繁殖性状显著关联的分子标记。这为提高猪的生产性能提供了理论依据，并从实质上使之得到了很大的提高。猪的初生重作为一个重要的繁殖性状，与猪出生后的生长速度及育成率有着不可分割的密切联系。最近有很多文献报道了初生重对生长速度的影响，卢伟（卢伟,刘充，于青云，刘珩，孔俊领，王子荣.不同初生重仔猪0～60日龄生长性能的比较.养猪[J].2010.6）研究发现提高仔猪初生重，有利于保证仔猪后期快速生长。李剑豪（李剑豪.长白猪初生重对生长速度及哺育率的影响.仔猪生产[J].2006.18）研究发现长白猪60日龄重与35日龄重均与初生重呈正相关且初生重与生长速度呈正相关。Beaulieu等（Beaulieu AD,Aalhus JL,Williams NH,Patience JF.Impact ofpiglet birth weight,birth order and litter size on subsequent growth performance,carcass quality,muscle composition and eating quality of pork[J].J Anim Sci.2010）研究发现，初生重较低的猪生长速度较慢，从而使其进入市场的时间增加。另有研究表明仔猪的初生重与育成率亦悉悉相关，初生重在1.0Kg以下时仔猪育成率随着初生重的增加而上升；初生重在1.0Kg以上时仔猪育成率没有明显的规律。初生重小于等于0.5Kg时仔猪育成率仅为55.56%（高建国.二花脸猪初生重对生长速度及育成率的影响[J].畜牧与兽医，1992，24（1）：26）。因此，对猪初生重相关基因的克隆和鉴定可为解释猪和其它哺乳动物胎儿生长发育的遗传机制提供重要线索，并为猪的繁殖性状遗传改良提供理论依据。

GLI2是调节Hh(Hedgehog)信号通路的主要的转录激活子。Hedgehog(Hh)家族分泌信号分子在从果蝇到人类的多项胚胎结构的发育图式中起到重要的作用(reviewed by Ingham andMcMahon,2001)。Hh信号分子与Patched(Ptc)受体结合后抑制其功能,释放受其抑制的跨膜蛋白Smoothened(Smo),进而激活细胞内一系列信号级联反应。一个动物的体形大小通常反映出细胞数目的多少，也就是细胞增殖和细胞死亡的平衡（Raff,M.C.1996.Size control:theregulation of cell numbers in animal.Devel173-175）。之前的研究表明Hh信号活性的降低能够引起鼠的形态矮小。在多种组织中，Shh都具有促有丝***的作用，如原体节中胚层、视网膜和小脑。另一种Hh蛋白Ihh控制软骨的生长，Ihh缺陷小鼠呈现短肢侏儒表型（Chuang,P.T.and McMahon,A.P.1999.Vertebrate Hedgehog signaling modulated by induction ofHedgehog-binding protein.Nature397:617-621）。从而影响胎儿发育，进而影响仔猪的初生重。因此本发明拟探讨GLI2基因与猪初生重的关系，寻求获得一种与猪初生重性状相关的分子标记。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关分子标记，DNA标记辅助育种是利用与目标性状基因紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择的一种现代育种，该方法是对基因型进行直接选择，与通过表现型间接对基因型进行选择的传统育种方法相比较，它不受环境影响，不受等位基因显隐关系干扰，结果可靠；此外，它对目标基因的转移可在育种早期进行选择，从而大大缩短了育种周期，与常规育种相比可提高育种效率达2-3倍，具有明显的优越性。

本发明的另一个目的是在于提供了一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关分子标记的制备方法，CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites)CAPs技术又称为PCR-RFLP，限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术。是用特异设计的PCR引物扩增目标材料时，由于特定位点的碱基突变、***或缺失数很少，以至无多态出现，往往需要对相应PCR扩增片段进行酶切处理，以检测其多态性。CAPs标记在二倍体植物研究中可发挥巨大的作用，是PCR标记的有力补充。这种方法与RFLP相比，不同的是以扩增替代了酶切，避免了RFLP繁琐的DNA酶切、转移、杂交等步骤。本发明是Gli2基因在序列表SEQ ID NO：1的第446bp处有一个G446-A446的碱基突变，导致NcoI-RFLP多态性，为提供了一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关分子标记的制备方法。

本发明的再一个目的是在于提供了一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关分子标记的应用，DNA分子标记在动物体内广泛存在，具有个体、种属及品种各层次的特异性，呈简单孟德尔遗传，不受杂交方式的制约，标记的非等位基因之间无副作用，标记间无干扰，结果稳定可靠，重复性强，可广泛应用到现实育种工作中。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

申请人从报道猪基因GLI2克隆得到与猪初生重性状相关基因的部分DNA序列，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和图2所述。在序列表SEQ ID NO：1的第446bp处有一个G446-A446的碱基突变，导致NcoI-RFLP多态性。这个碱基突变位于GLI2基因第8外显子中。

一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关分子标记的制备方法，其步骤是：

A、用猪序列（ensemble收录号：ENSSSCG00000015733）为模板设计引物，提取猪基因组DNA。

1）将大白猪（来自湖北省武汉市华中农业大学精品猪场，为常规推广的外来血缘的瘦肉型猪种）的肌肉组织在液氮中磨碎，加入等体积1×SET溶液（1ml），蛋白酶K（10mg/mL）至终浓度200μg/mL，十二烷基硫酸钠（即SDS，10％）至终浓度0.5%，摇匀。55℃水浴摇床中温育过夜消化。

2）将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管15min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，注意标上相应的记号。

3）加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（体积比25：24：1），缓慢颠倒离心管10min，于低温（-9℃到+40℃）离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。

4）加入等体积的氯仿/异戊醇（体积比24：1）缓慢颠倒离心管10min，于低温（-9℃到+40℃）冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min。

5）将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，即可以看到白色絮状DNA。

6）用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温（20－25℃，以下相同）下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水（一般300ul左右）溶解DNA。

7）在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在（1％，m/V）琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测提取的DNA质量。

B、设计引物，一般原则如下：序列选取应在基因的保守区段；避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构；典型的引物18到24个核苷长，引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量；Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%；引物之间的TM相差避免超过2℃；引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

该引物的DNA序列如下所示：正向引物5'-ATGTCCTAAGGAACCAAGCT-3'，反向引物5'-TCCTGCCTTCTTTTGCTC-3'；

C、通过PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO：1和图2所示的核苷酸序列。

一、PCR扩增：反应总体积为10μl，其中上述制备得到的猪DNA模板0.5μl，双蒸水7.0μl，buffer1μl，Mg²⁺0.6μl，10mM正向引物和反向引物各0.3μl，dNTP0.2μl，Taq酶0.1μl（10U/μl）。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，循环35次94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸25s，最后72℃延伸5min。PCR产物经（2％，m/V）琼脂糖凝胶电泳检测。

程序：94摄氏度预变性5min

72摄氏度延伸5min

15摄氏度保存3min

二、PCR产物纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒（购自天根生化科技(北京)有限公司，按照该试剂盒的说明书操作）纯化PCR产物，具体步骤是向胶块中加入等倍体积PC溶液，置50℃温育10min，使琼脂糖胶块完全溶化，每两分钟颠倒混匀一次；将溶化的胶液转入到离心吸附柱，并将离心吸附柱置于废液收集管中，12000rpm离心60s，弃去废液；将离心吸附柱置回废液收集管中，加入600μl漂洗液PW于离心吸附柱中，12000rpm离心60s，弃滤液。以同样的方法再用600μl漂洗液PW洗涤一次；将离心吸附柱置会废液收集管中，最高速度离心2min；小心取出离心吸附柱，将其套入一个无菌的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30μl双蒸水，室温静置2-10min后，最高速度离心1min；取出离心吸附柱，将1.5ml离心管（DNA溶液）置于-20℃保存备用。

三、DNA序列测定：序列测定由北京擎科新业生物技术有限公司完成，基因片段测正反两个反应。

一种分子标记（SEQ ID NO：1）在猪繁殖性状关联分析中的应用，其步骤是：

1、应用常规的PCR-RFLP的方法对序列SEQ ID NO：1和图2所示的第446位碱基突变进行了检测。

（1）PCR-RFLP引物序列（该引物也是扩增GLI2基因第8外显子的引物），该引物对的序列如下：

GLI2SNP：正向引物5'-ATGTCCTAAGGAACCAAGCT-3'，（对应于图2所示序列的第1-20位），

反向引物5'-TCCTGCCTTCTTTTGCTC-3'。（对应于图2所示序列的第702-719位）；

该引物扩增片段长度为719bp（见图2和序列表SEQ ID NO:1）。

（2）PCR扩增条件：

PCR反应总体积10μl，其中上述制备的猪基因组DNA模板1μl，双蒸水7.1μl，10×缓冲液1μl，10mM正向引物和反向引物各0.3μl，dNTP0.2μl，Taq酶0.1μl（5U/μl）。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，循环35次94℃变性20s、57℃退火30s、72℃延伸20s，最后72℃延伸5min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。

（3）RFLP检测：

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中PCR产物4μl，双蒸水4.9μl，10×缓冲液1μl，限制性内切酶NcoI为0.1μl(10U/μl)，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置4h，用4%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

（4）基因分型：酶切产生三种基因型，AA基因型有164bp和555bp两条带，GG基因型有164bp，277bp和278bp三条带，由于277bp与278bp只相差1bp，琼脂糖凝胶电泳不能将其分辨，因此可以识别的只有164bp和277bp左右的两条带，杂合子AG基因型有164bp，277bp,278bp和555bp的四条带，但同理能分辨出三条带，即164bp，555bp和277bp左右，如图3所述。

基因型与猪初生重性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

所述的一种引物在猪猪初生重性状关联分析中的应用，其步骤是：

（1）PCR-RFLP引物序列（该引物也是扩增GLI2基因第8外显子的引物），该引物对的序列如下：

GLI2SNP：正向引物5'-ATGTCCTAAGGAACCAAGCT-3'，（对应于图2所示序列的第1-20位），

反向引物5'-TCCTGCCTTCTTTTGCTC-3'。（对应于图2所示序列的第702-719位）；

该引物扩增片段长度为719bp（见图2和序列表SEQ ID NO:1）。

（2）PCR扩增条件：

PCR反应总体积10μl，其中上述制备的猪基因组DNA模板1μl，双蒸水7.1μl，10×缓冲液1μl，10mM正向引物和反向引物各0.3μl，dNTP0.2μl，Taq酶0.1μl（5U/μl）。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，循环35次94℃变性20s、57℃退火30s、72℃延伸20s，最后72℃延伸5min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。

（3）RFLP检测：

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中PCR产物4μl，双蒸水4.9μl，10×缓冲液1μl，限制性内切酶NcoI为0.1μl(10U/μl)，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置4h，用4%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

（4）基因分型：酶切产生三种基因型，AA基因型有164bp和555bp两条带，GG基因型有164bp，277bp和278bp三条带，由于277bp与278bp只相差1bp，琼脂糖凝胶电泳不能将其分辨，因此可以识别的只有164bp和277bp左右的两条带，杂合子AG基因型有164bp，277bp,278bp和555bp的四条带，但同理能分辨出三条带，即164bp，555bp和277bp左右，如图3所述。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

该方法是对基因型进行直接选择，与通过表现型间接对基因型进行选择的传统育种方法相比较，它不受环境影响，不受等位基因显隐关系干扰，结果可靠；此外，它对目标基因的转移可在育种早期进行选择，从而大大缩短了育种周期，与常规育种相比可提高育种效率达2-3倍，具有明显的优越性。

表3.GLI2基因NCOI-RFLP基因型与部分免疫性状和初生重性状的关联分析结果（p<0.05）

注：^**表示P<0.01，^*表示P<0.05。

附图说明

图1为一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关分子标记的制备方法的流程图。

图2为一种克隆猪GLI2基因的DNA序列（与序列表1所示的序列对应）。

在图2所示序列的446bp处存在一个等位基因的突变，记为“R”,“R”之后的括号即(G/A)为突变位点（用标有下划线的加粗斜体字显示），该扩增片段的首尾显示的引物序列用斜体加粗及阴影显示。

图3为一种猪GLI2基因第8外显子中的NcoI-RFLP的三种基因型(AA AG GG)和基因组扩增电泳结果(P)示意图。

图中M：DNA分子量标准（DL2000ladder）。

图4为一种猪GLI2基因正向测序发现的G-A突变示意图。

具体实施方式

实施例1：

一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关分子标记的制备方法，其步骤是：

（1）利用苯酚抽提法提取大白猪（长白猪）肌肉组织总DNA：

1）将大白猪（来自湖北省武汉市华中农业大学精品猪场，为常规推广的外来血缘的瘦肉型猪种）的肌肉组织在液氮中磨碎，加入等体积1×SET溶液（1ml），蛋白酶K（10mg/mL）至终浓度200μg/mL，十二烷基硫酸钠（即SDS，10％）至终浓度0.5%，摇匀。55℃水浴摇床中温育过夜消化。

2）将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管15min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，注意标上相应的记号。

3）加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（体积比25：24：1），缓慢颠倒离心管10min，于低温离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。

4）加入等体积的氯仿/异戊醇（体积比24：1）缓慢颠倒离心管10min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min。

5）将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，即可以看到白色絮状DNA。

6）用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温（20－25℃，以下相同）下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水（一般300ul左右）溶解DNA。

7）在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在（1％，m/V）琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测提取的DNA质量。

（2）引物设计：

以报道的猪基因组序列（ensemble收录号：ENSSSCG00000015733）为模板，利用生物学引物设计软件Primer Premier5.0，设计扩增GLI2基因第8外显子的引物，该引物对的DNA序列如下：

GLI2：正向引物：5'-ATGTCCTAAGGAACCAAGCT-3'，（对应于序列表SEQ ID NO：1的第1-20位），

反向引物：5'-TCCTGCCTTCTTTTGCTC-3'（对应于序列表SEQ ID NO：1的第702-719位）；

该引物的DNA序列扩增片段长度为719bp。

（3）PCR扩增反应：

PCR反应：反应总体积为10μl，其中上述制备得到的猪DNA模板0.5μl，双蒸水7.0μl，buffer1μl，Mg²⁺0.6μl，10mM正向引物和反向引物各0.3μl，dNTP0.2μl，Taq酶0.1μl（10U/μl）。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，循环35次94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸25s，最后72℃延伸5min。PCR产物经（2％，m/V）琼脂糖凝胶电泳检测。

（4）PCR产物的纯化和测序

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒（购自天根生化科技(北京)有限公司，按照该试剂盒的说明书操作）纯化PCR产物，具体步骤是向胶块中加入等倍体积PC溶液，置50℃温育10min，使琼脂糖胶块完全溶化，每两分钟颠倒混匀一次；将溶化的胶液转入到离心吸附柱，并将离心吸附柱置于废液收集管中，12000rpm离心60s，弃去废液；将离心吸附柱置回废液收集管中，加入600μl漂洗液PW于离心吸附柱中，12000rpm离心60s，弃滤液。以同样的方法再用600μl漂洗液PW洗涤一次；将离心吸附柱置会废液收集管中，最高速度离心2min；小心取出离心吸附柱，将其套入一个无菌的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30μl双蒸水，室温静置2-10min后，最高速度离心1min；取出离心吸附柱，将1.5ml离心管（DNA溶液）置于-20℃保存备用。

（5）DNA序列测定：序列测定由北京擎科新业生物技术有限公司完成，基因片段测正反两个反应。

实施例2：

PCR-RFLP检测方法建立：

（1）PCR-RFLP引物序列（该引物也是扩增GLI2基因第8外显子的引物），该引物对的序列如下：

GLI2SNP：正向引物5'-ATGTCCTAAGGAACCAAGCT-3'，（对应于图2所示序列的第1-20位），

反向引物5'-TCCTGCCTTCTTTTGCTC-3'。（对应于图2所示序列的第702-719位）；

该引物扩增片段长度为719bp（见图2和序列表SEQ ID NO:1）。

（2）PCR扩增条件：

PCR反应总体积10μl，其中上述制备的猪基因组DNA模板1μl，双蒸水7.1μl，10×缓冲液1μl，10mM正向引物和反向引物各0.3μl，dNTP0.2μl，Taq酶0.1μl（5U/μl）。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，循环35次94℃变性20s、57℃退火30s、72℃延伸20s，最后72℃延伸5min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。

（3）RFLP检测：

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中PCR产物4μl，双蒸水4.9μl，10×缓冲液1μl，限制性内切酶NcoI为0.1μl(10U/μl)，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置4h，用4%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

用引物扩增猪基因组DNA得到了719bp特异性扩增片段，测序结果发现该片段在第446位存在一个G-A转换，位于第8外显子区（如图4所示），造成一个NcoI酶切位点（CATGG）的多态性，另外该片段164bp处，始终存在1个NcoI酶切位点。因此，酶切产生三种基因型，AA基因型有164bp和555bp两条带，GG基因型有164bp，277bp和278bp三条带，由于277bp与278bp只相差1bp，琼脂糖凝胶电泳不能将其分辨，因此可以识别的只有164bp和277bp左右的两条带，杂合子AG基因型有164bp，277bp,278bp和555bp的四条带，但同理能分辨出三条带，即164bp，555bp和277bp左右，如图3所述。其它实施步骤与实施例1相同。

实施例3：

本实施例猪群来自湖北金林原种畜牧有限公司原种猪场的纯种大白猪（为常规推广应用的品种）群，子代出生0天测定体重。

根据采集样品的群体结构，申请人运用混合模型来统计分析GLI2基因第8外显子区G/A多态性位点的基因型效应及其与初生重性状的关系，其中固定效应包括性别效应、胎次效应、线别效应、候选基因的基因型效应，随机效应包括公畜效应、公畜内母畜效应；采用SAS(Version8.0)软件中MIXED MODELS程序进行最小二乘均数估计（Breslow,N.E.;Clayton,D.G.Approximate Inference in Generalized Linear Mixed Models[J].Journal of theAmerican Statistical Association,1993,88(421):9–25）与统计分析。

对猪GLI2基因第7内含子区NcoI-RFLP多态性位点与初生重性状进行关联分析，具体结果见表1。由表1可知：在湖北金林原种畜牧有限公司原种猪场的纯种大白猪群的329个个体中AA基因型有10个，AG基因型有136个，GG基因型有183个，说明在该群体中G等位基因占优势。不同基因型之间性状差异显著性的结果显示猪GLI2基因第7内含子区NcoI-RFLP多态性位点各基因型与大白猪初生重、白细胞数目、淋巴细胞比率和嗜碱性粒细胞比率呈显著关联(P<0.05)。通过对AA、AG和GG基因型个体的最小二乘均数值进行两两比较，结果表明AG基因型个体的初生重显著高于GG型个体（P=0.005）。

表3.GLI2基因NCOI-RFLP基因型与部分免疫性状和初生重性状的关联分析结果（p<0.05）

注：^**表示P<0.01，^*表示P<0.05。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华中农业大学

 

<120>  GLI2基因作为猪初生重性状相关分子标记及制备方法和应用

 

<130>  r是a或g

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  719

<212>  DNA

<213>  猪

 

<400>  1

atgtcctaag gaaccaagct tttctgtcct gctccctggg ctgaccaggc cctgttatcc     60

 

ttagacccag agccagccct gccctggagg gctgaggttg agaccactga gtcaggagtg    120

 

aggggcccca gtatttctct aagagagggt cccacttcat ctccatggaa gtgggggctg    180

 

ctcctgtgag agggaggcgc tgatcagcag agctccgggc tctctcctgg ccatgcccct    240

 

ggccagagga ccaagcaagg ggactcattt tctgaaactg cagcacaagc gttggcccag    300

 

acggtctatg tgggaagagt cccagaggta aagtcccaat ttggggtgtc cctgtctgcc    360

 

cccatgtgat gactcccccc catgctcctt tctcccagaa caagcagagc agcgagtcag    420

 

ccgtgagcag caccatcaac cccatrgtca ttcacaagcg cagcaaggtc aagacagagg    480

 

ctgagggcct gcggccagcc tccccactga ctctgacaca ggtaacttgt cagctctccc    540

 

caccgcggct ctccggctag gactggggcc cggccgcgac tcctgggtca gctgcctagg    600

 

ggccttgacc ttgttggcgg atggatgaca gcctgcgtgt gtgaatgagc gaatgatggc    660

 

gtgagagaat gatggagcgc acatgctcct caaccactgc cgagcaaaag aaggcagga     719

 

 

Claims (4)

1.一种GLI2基因作为猪初生重性状相关分子标记，其特征在于：与猪初生重性状相关的分子标记，其序列为SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的一种GLI2基因作为猪初生重性状相关分子标记，其特征在于：分子标记的引物对，其核苷酸序列如下所示：

    正向引物：5＇- ATGTCCTAAGGAACCAAGCT- 3＇，

    反向引物：5＇- TCCTGCCTTCTTTTGCTC - 3＇。

3.权利要求1所述的一种GLI2基因作为猪初生重性状相关分子标记在猪初生重性状关联分析中的应用。

4.权利要求2所述一种GLI2基因作为猪初生重性状相关分子标记，其特征在于：分子标记的引物对在猪猪初生重性状关联分析中的应用。