CN104630117A - 一株改善鸡肠道微生物群落结构的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株可以调节鸡肠道微生物群落结构并提高生产性能的植物乳杆菌及其应用。所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarumP-8)分离自酸牛奶中，具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.6312。饲喂该菌株可以提高42日龄鸡肠道中总细菌、乳杆菌族、链球菌族、梭杆菌亚种、双歧杆菌族和韦荣球菌亚种数量；同时可显著降低埃希氏菌属和脱硫弧菌属数量。从而达到改善肠道微生物菌群结构的效果。益生菌Lactobacillus plantarum P-8可以通过饮水或饲料添加应用于肉鸡养殖中，使用方便。

Description

一株改善鸡肠道微生物群落结构的植物乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株可以调节鸡肠道微生物群落结构并提高生产性能的益生菌及其在肉鸡养殖中的应用。饲喂该菌株可以提高42日龄鸡肠道中总细菌、乳杆菌族、链球菌族、梭杆菌亚种、双歧杆菌族和韦荣球菌亚种数量；同时可显著降低埃希氏菌属和脱硫弧菌属数量。从而达到改善肠道微生物菌群结构的效果。
背景技术
复杂的微生物群落及其自身对其各自所生存的外界环境中的大部分生化转化过程肩负着巨大责任。事实上，这些细菌存活于机体任何一个接触外界的身体表面，诸如口腔、皮肤还有消化道、泌尿生殖道以及呼吸道等。而在这些机体部位中消化道是最密集的细菌定值器官。这些经过胃肠道以及存活于胃肠道的庞大微生物群落被认定为肠道菌群。肠道菌群在机体代谢、营养、生理功能以及免疫反应过程中发挥着重要的作用，可以从不可消化的多糖类食物包括抗性淀粉以及纤维素中摄取能量以发挥重要的活性。这些代谢活性的发挥促使宿主代谢产生重要的营养物质，包括短链脂肪酸(SCFAs)、维生素(VK,VB12和叶酸)和氨基酸。另外，肠道菌群通过定值抵抗、分泌抗菌化合物等机制提供宿主对病原微生物的防御功能。肠道微生物还增强胃肠感觉、胃肠蠕动等功能的发育、成熟以及持续，肠道防御和免疫反应。
益生菌(Probiotics)一词早在1965年就由Lilley和Stillwell首次阐述为“由一种微生物分泌的刺激其他微生物生长的物质或组织提取物”。经过数十年的发展和完善，***粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)和欧洲食品与饲料菌种协会(EFFCA)于2002年将益生菌定义为“活的微生物，通过摄入充足的数量，对宿主产生一种或多种特殊且经过论证的功能性健康益 处”，这是目前为止最权威并被人们所接受的益生菌的定义。益生菌的微生物组成主要是双歧杆菌属和乳杆菌属。乳酸菌对人体健康具有有益作用，包括抑制病原微生物，如沙门氏菌、志贺菌、幽门螺旋杆菌等，可减少乳糖不耐症的发生，增加免疫反应等。植物乳杆菌是存在于人类肠道、传统及工业发酵食品中的一类重要的乳酸菌。它与人类日常生活关系密切，能够在胃肠道存活并定植于肠道发挥有益作用，对肠道微生物有重要影响。
胃肠道微生态***是机体内最大和最复杂的微生态***，刚出生时胃肠道是相对无菌的，随着与外界环境的接触，微生物在肠道内发生定植、繁殖和演替。而出生后的早期阶段是动物肠道菌群建立的关键时期，这也使得对动物肠道菌群的早期干预显得尤为重要。在雏鸡出壳后迅即进行益生菌处理，就能在其他菌种定植前比较容易地建立起有益菌群。随后，外源益生菌的摄入通过竞争排斥、微生物拮抗和免疫刺激来改善动物和人肠道微生物生态平衡，修复已失调的肠道菌群结构，从而减少肠道疾病的发生。
发明内容
本发明针对上述研究背景，通过动物实验证实L.plantarum P-8菌株可以提高鸡肠道中有益菌的数量，降低有害菌数量，改善肠道微生物群落结构，预防疾病的发生，促进动物健康。
本发明的目的是提供一种植物乳杆菌(L.plantarum P-8)的菌株及其菌体成分在改善鸡肠道微生物群落结构，促进动物健康等作用方面的应用。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一株改善鸡肠道微生物群落结构的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8)，分离自酸牛奶中，具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，该菌株已保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.6312。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8用于提高鸡肠道中总细 菌、乳杆菌族、链球菌族、梭杆菌亚种、双歧杆菌族和韦荣球菌亚种数量、提高鸡肠道中有益菌的数量、降低有害菌数量以及改善肠道微生物群落结构，预防疾病的发生，促进肉鸡健康成长的应用。
所述植物乳杆菌通过饮水或饲料添加应用于肉鸡养殖，生产使用方便。
本发明的效果是：Lactobacillus plantarum P-8是自102株植物乳杆菌中筛选出的1株益生性能优异的乳杆菌。该菌株具有免疫调节特性，已经用于乳制品和发酵剂的工业化生产，并作为活疫苗在医学上提供更广泛的应用。本发明饮水投喂肉鸡Lactobacillus plantarum P-8(CGMCC 6312)通过测定不同阶段鸡粪样中其它优势菌属的含量来探究Lactobacillus plantarum P-8对鸡肠道共生菌群的数量的调节，从而是否可以促进畜禽肠道微生物群落结构的改善效果。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
附图说明
图1为肉鸡肠道RT-qPCR扩增体系图；
图2为7日与42日龄肉鸡肠道内目标菌数量在两组间的差异图。
具体实施方式
一株改善鸡肠道微生物群落结构的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8)，分离自酸牛奶中，具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.6312。
植物乳杆菌植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8用于提高鸡肠道中总细菌、乳杆菌族、链球菌族、梭杆菌亚种、双歧杆菌族和韦荣球菌亚种数量、提高鸡肠道中有益菌的数量、降低有害菌数量以及改善肠道微生物群落结构，预防疾病的发生，促进肉鸡健康成长的应用。
所述植物乳杆菌通过饮水或饲料添加应用于肉鸡养殖，生产使用方便。 1.基础日粮组成
根据中国肉鸡饲养标准(2004)以玉米和豆粕为主要原料，按照肉鸡生长发育，分0～3周龄和4～6周龄两阶段配置日粮，营养成分均满足肉鸡的生长需要，其配方和营养水平详见表1。
表1基础日粮组成及营养水平(风干基础％)
Table.1Composition and nutrit ional levels of basal diets(air-dry basis,％)
2.饲养管理
试验期共6周。试验前对周边环境、鸡舍、用具进行消毒处理。试验鸡采用涂塑肉鸡笼单层笼养，每一处理的6个重复组按鸡笼的位置不同分开排 列，以消除环境因素的影响。鸡笼均采用红外线加热装置自动控温，试验期内保持23h/d恒定光照和机械通风制度，在前3d内舍温保持33℃，之后每周降低3℃，直至降到24℃后保持恒定不变。试验期内每天人工清粪一次。每天观察鸡群精神状态，其余管理同肉鸡常规饲养管理。
3.试验菌株
对照组肉鸡不饲喂乳酸杆菌，试验组通过饮水饲喂L.plantarum P-8，添加剂量：饮水中的添加量为2×106CFU/ml
本研究选取1日龄科宝500(cobb500)肉仔鸡，随机分为2组，每组6个重复，每个重复15只鸡，共180只。对照组饲喂玉米豆粕型基础日粮；试验组饲喂相同的玉米豆粕型基础日粮，饮水投喂Lactobacillus plantarum P-8(CGMCC 6312，2×106CFU/ml)，试验期为42天。期间采集7天和42天肉鸡粪便，随机选取12只肉鸡粪便进行肠道菌群试验。应用肠道菌群特异性引物对7、42日龄鸡肠道内总细菌、乳杆菌族、链球菌族、梭杆菌亚种、双歧杆菌族和韦荣球菌亚种、埃希氏菌属、脱硫弧菌属数量进行检测，RT-qPCR定量结果表明：每日饮水饲喂该菌株可以提高鸡肠道中有益菌的数量，降低有害菌数量，改善肠道微生物群落结构，预防疾病的发生，促进动物健康。
试验过程如下：
1.试验样品采集 
选取1日龄科宝500(cobb500)肉仔鸡，随机分为2组，每组6个重复，每个重复15只鸡，共180只。试验1组为对照组，饲喂基础日粮；试验2组为益生菌组，饲喂基础日粮(饮水投喂L.plantarumP-8，2×106CFU/ml)。试验期为42天。饲养试验期间，采集7和42日龄鸡粪便，于-80℃冰箱保存备用，并在48小时内完成粪便样品宏基因组DNA的提取。
2.肠道菌群宏基因组DNA的提取和分析 
将采集到的肉鸡粪便作为试验样品，参照试剂盒QIAamp DNA Stool Mini Kit(QIAGEN，德国)的说明书进行粪便总DNA的提取。DNA的质量和浓度分别用1％的琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度仪测定(OD A260/280约为2.0)。
荧光定量PCR(RT-qPCR)
(1)标准品的制备：
对已提取的优势菌属质粒进行浓度测定后依据以下公式计算拷贝数，然后作为外标准品为后续试验中的未知样品中相应菌的定量。
应用以上计算结果绘制标准曲线，依据扩增标准曲线完成未知样品中优势菌属、乳酸杆菌种以及双歧杆菌种的定量分析和计算，并且设置不加模板的阴性对照。分别选择对应引物扩增肠道菌群优势菌属(表2)。扩增程序为：94℃预变性30秒；94℃变性5秒，Tm退火45秒(退火温度见表2)，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃末端延伸5min。RT-PCR反应体系为20μL体系，包括Super MIX(SYBR Green)10μL，前引物和后引物各0.5μL，模板2μL，Dye 0.4μL，补充ddH2O至20μL。
(2)肠道优势菌群特异性引物设计
针对肠道中总细菌、乳杆菌族、链球菌族、梭杆菌亚种、双歧杆菌族和韦荣球菌亚种设计合成特异性引物，菌体引物信息见下表：
表2鸡肠道菌群优势菌属RT-qPCR引物
Table.2Primer of RT-qPCR for dominent genus in broilers gut 
(3)扩增体系：见附图1。
反应体系20μL：反应体系20μL：10×PCR mix 10μL，10mmol/L上下游引物各0.4μL，DNA模板100ng左右，dd H2O补足至20μL。
扩增条件： 
95℃变性5min；循环30次：95℃变性1min，退火45s，72℃延伸1min，然后72℃延伸7min，4℃保存。
从两个处理组随机选取12只肉鸡粪便，采用RT-qPCR方法对7、42日龄鸡肠道内总细菌、乳杆菌族、链球菌族、梭杆菌亚种、双歧杆菌族和韦荣球菌亚种、埃希氏菌属、脱硫弧菌属数量进行检测。
与对照组相比，饮水投喂L.plantarumP-8可显著提高7、42日龄肉鸡肠道总细菌、乳杆菌族、链球菌族数量(P<0.01)；而且饮水投喂L.plantarum P-8能够显著降低7、42日龄肉鸡肠道中埃希氏菌属、脱硫弧菌属数量(P<0.01)；此外饮水投喂L.plantarum P-8还显著提高了7、42日龄肉鸡肠道中双歧杆菌族、梭杆菌亚种数量(P<0.05)，见附图2。
饲喂Lactobacillus plantarum P-8可以提高鸡肠道中总细菌、乳杆菌族、链球菌族、梭杆菌亚种、双歧杆菌族和韦荣球菌亚种数量；同时可显著降低埃希氏菌属和脱硫弧菌属数量，从而达到调节肠道菌群比例，改善肠道微生物菌群结构的效果。益生菌Lactobacillus plantarum P-8可以通过饮水或饲料添加应用于肉鸡养殖中，使用方便。

Claims (3)

1.一株改善鸡肠道微生物群落结构的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8，分离自酸牛奶中，具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.6312。
2.一种如权利要求1所述的植物乳杆菌植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8用于提高鸡肠道中总细菌、乳杆菌族、链球菌族、梭杆菌亚种、双歧杆菌族和韦荣球菌亚种数量、提高鸡肠道中有益菌的数量、降低有害菌数量以及改善肠道微生物群落结构，预防疾病的发生，促进肉鸡健康成长的应用。
3.如权利要求2所述的植物乳杆菌植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8的应用，其特征在于：所述植物乳杆菌通过饮水或饲料添加应用于肉鸡养殖，生产使用方便。
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