CN104630096A

CN104630096A - 具有抑制脂肪细胞的两歧双歧杆菌tmc3115及其应用

Info

Publication number: CN104630096A
Application number: CN201410781788.4A
Authority: CN
Inventors: 龄南; 赵林森; 齐世华; 何方
Original assignee: HEBEI INATURAL BIOTECH CO Ltd
Current assignee: Hebei Yiran Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2014-12-16
Filing date: 2014-12-16
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2034-12-16
Also published as: CN104630096B

Abstract

本发明涉及一株两歧双歧杆菌TMC3115及其应用。本发明的两歧双歧杆菌具有明显的抑制脂肪细胞的功能。本发明还涉及两歧双歧杆菌TMC3115在制备乳制品中的应用及含有该菌株的益生产品。

Description

具有抑制脂肪细胞的两歧双歧杆菌TMC3115及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有抑制脂肪脂肪细胞作用的两歧双歧杆菌TMC3115及其应用。

背景技术

随着社会的快速发展，生活水平的大幅度提高，肥胖的发生率逐年增高，目前已经成为了一个世界性的公共卫生问题。我国2010年国民体质监测公报显示，2010年我国成人的超重率为32.1％，比2005年增长3个百分点；成人肥胖率为9.9％，比2005年增长1.9个百分点。肥胖是一系列慢性疾病的危险因素，例如高血压、2型糖尿病、心脑血管疾病等，这些慢性病严重影响了人们的生活质量。

益生菌是指有益于宿主健康及良好状态的微生物制剂或微生物的细胞成分，主要包括乳酸杆菌、双歧杆菌、酵母菌等。研究^[3-7]表明益生菌具有多重健康促进功能，包括调节肠道菌群对病原微生物的抵抗作用、防止腹泻、调节免疫、减少血清胆固醇水平、预防过敏性疾病和癌症等。其中最被人们所关注的是其免疫调节功能。

近年来的研究显示，益生菌具有防治肥胖的潜能。研究表明，加氏乳杆菌SBT2055可以抑制高脂饲料喂养的小鼠内脏脂肪细胞增大。植物乳杆菌KY1032和乳酸菌HY7601可以降低食源性肥胖小鼠脂肪组织、肝脏中代谢相关基因的表达以及脂肪沉积、血浆胰岛素、总胆固醇标记物的表达。人体实验中发现，加氏乳杆菌BNR17可以有效降低腰围和臀围值。最近的研究显示，口服乳酸杆菌可以预防宿主发生肥胖。同时，乳酸杆菌可以促进巨噬细胞及其他免疫细胞的增殖，因而改善宿主的免疫功能，这表明乳酸杆菌防治肥胖的功能可能与其对机体免疫细胞活性的调节存在一定联系。但最近的研究显示，宿主肥胖组织与体内免疫细胞之间的关系及其相互作用比人们之前所认识的更加复杂。相关的理论还需要更多的研究予以验证，而有关机制也还需要进行更深入地研究。

本发明对益生菌TMC3115的肥胖防治功能进行评价，并对其机制进行初步探讨。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抑制脂肪细胞的两歧双歧杆菌。

本发明的另一个目的是提供含有两歧双歧杆菌的产品，该两歧双歧杆菌具有抑制脂肪细胞的功能。

本发明提供了一种两歧双歧杆菌，命名为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)TMC3115，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所)，保藏日期2013年11月11日，保藏号为CGMCCNo.8462。

本发明还提供了一种两歧双歧杆菌TMC3115的产品，所述产品包括两歧双歧杆菌片剂、两歧双歧杆菌颗粒、两歧双歧杆菌粉剂、两歧双歧杆菌胶囊剂和两歧双歧杆菌乳制品。

本发明的两歧双歧杆菌TMC3115可以制备成各种含有两歧双歧杆菌的产品，包括片剂、颗粒、粉剂及乳制品。但不限于此，还包括本领域常见的其他产品形式，例如胶囊剂等等。本发明的含有两歧双歧杆菌TMC3115的片剂、颗粒、粉剂可以通过将两歧双歧杆菌TMC3115，按照本领域常规的方法，以常规的比例与常规的辅料制成。本发明的含有两歧双歧杆菌TMC3115的发酵果蔬汁及乳制品中，可将两歧双歧杆菌TMC3115直接添加使用，再按照本领域常规的方法，以常规的比例与常规的原料制成。

本发明的两歧双歧杆菌TMC3115是一种功能性乳酸菌，其具有抑制脂肪细胞的功能。

具体实施方式

为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现说明本发明的具体实施方式。以下实施例中，试验方法如无特别说明均为常规方法；百分含量如无特别说明均为质量百分含量。

1、本发明的两歧双歧杆菌TMC3115的分离、鉴定。

(1)、菌株分离。

a.取新鲜婴儿粪便放入至50mL无菌离心管中，再加入20mL灭菌的生理盐水，振荡均匀，该步骤需在厌氧条件下进行。

b.用接菌环沾取上述稀释液，在已配置好的MRS琼脂平板上进行划线，将完成划线的平板置于37℃条件下恒温厌氧培养72小时。用接菌环挑取单菌落，接种于MRS液体培养基中，置于37℃条件下恒温厌氧培养18小时。取菌液划线接种于MRS琼脂培养基，置于37℃下恒温厌氧培养72小时后，观察菌落形态并进行革兰氏染色，观察染色情况及细胞形态特征。将革兰氏染色呈阳性的棒状杆菌或分叉杆菌，进行编号并进一步纯化培养。采用-85℃冻结保存或低温真空冷冻保存方法保存目标菌株。

(2)菌株鉴定。

分离纯化的两歧双歧杆菌TMC3115需进行生理生化鉴定及16SrDNA鉴定。两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum TMC3115生物学特性如下所示：

两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum TMC3115生物学特性

两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum tuf基因序列测定结果

GGCGAGGAGTGTGGCGCCTTCCGCACAGCGAAGGTCAGGCCCTCCTCCATAGCGATGGGCTGGATCAGCTCAACGGTGAAGGTCGCGTGGTCGCCAGGCTGAACCATCTCGACGCCTTCCGGCAGCTCGATGACGCCGGTGACGTCGGTGGTGCGGAAGTAGAACTGCGGACGGTAGTTGGAGAAGAACGGCGAGTGACGGCCGCCCTCGTCCTTGGTCAGCACGTAGACTTCGCCCTCGAACTTGGTGTGCGGGGTGACGGAGCCCGGCTTGGCCACAACCTGGCCACGCTCGACGTCCGTACGGTTGATGCCGCGGAGCAGCAGACCGGTGTTGTCGCCAGCCTCGCAGGCGTCCATGGTCTTGTGGAACGTCTCGATGGAGGTAACGGTGGTGGTCTGGGTCGGGCGGATGCCGACGATCTCGACCGGGGTGTTGACGGCCAGCTGGCCACGCTCAACACGACCGGTGACGACGGTACCACGGCCGGAGATGGTGAAGACGTCCTCGATAGGCATCAGGAACGGCTTGTCCAGGTCGTGAACCGGGGTCGGGATGTACTCGTCGACGGCGTCCATCAGATCCTTGACGGTCTGGACCCACTTGTCGTGGTCCGGAGCGTCATCGTGCAGAGCGCCGTAGGCGGAGGTACGGATGACCGGGCAGTCGCGGTCGAAGCCGTTCTCGTCGAGGAGGTCACGGACCTCTTCCTCAACGAGCTCGATGAGCTCCTCGTCCTCGACCATGTCGCACTTGTTCAGGGCGACGAGGATACGCGGGACACCCACCTGACGGGCGAGCAGAACGTGCTCGCGGGTCTGGGCCATCGGGCCGTCGGTGGCGGCCACAACGAGGATGGCGCCATCCATCTGGGCAGCACCGGTGATCATGTTCTTCACGAAGTCGGCGTGGCCCGGGCAGTCCACGTGAGCGTAGTGACGCTTCGCGGTCTGGTAGTCGATGTGGGCGATGTTGATGGTGATACCACGCTGCTGCTTTTCGGGAGCGGCGTCGAT

两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum hsp60基因序列测定结果

GGGGTATGGCGCATCGGCGCGAGCTGGTCAGGAAGTCGCCAAGAAGACCGACGACGTCGCGGGCGACGGAACCACCACCGCCACCGTGCTGGCCCAGTCCCTCGTGCACGAAGGCCTGAAGAACGTTGTCGCCGGCTCCAACCCGATCGCGCTGCGTCGCGGCATCGAGAAGGCCACCGACACCATCGTCAAGGAACTGGTCGCCGCCGCCAAGGACGTGGAGACCAAGGACCAGATCGCCGCCACCGCCACGATCTCCGCAGCCGACCCCGAGGTTGGCGAGAAGATCGCCGAGGCTCTGGACAAGGTCGGTCAGGACGGCGTCGTGACCGTCGAGGACAACAACCGCTTCGGCCTTGACCTTGAGTTCACCGAGGGCATGCGTTTCGACAAGGGCTACATCGCCCCGTACTTCGTGACCAACGCGGACGACCAGACCGCGGTTCTTGAGGATCCGTACATCCTCCTGACCTCCGGCAAGGTTTCCAGCCAGCAGGACGTCGTCCACATCGCCGAGCTCGTCATGAAGTCCGGCAAGCCGCTGCTGATCATCGCCGAGGACGTCGACGGCGAGGCGCTGCCGACCCTCATCCTGAACAAGATCGGGGGGCCACCTTAA

2、两歧双歧杆菌TMC3115的抑制脂肪细胞功能

分别使用小鼠前脂肪细胞株(3T3-L1)、大鼠和人体来源的原代前脂肪细胞进行脂肪细胞体外培养和成脂分化诱导，建立脂肪细胞的体外培养体系。通过细胞形态学观察、成脂分化率计算、油红O染色方法对各种前脂肪细胞的成脂分化能力进行定性和定量分析。

使用两歧双歧杆菌TMC3115(Bifidobacterium bifidum TMC3115)与J774.1巨噬细胞共培养，通过RT-PCR、ELISA方法评价两歧双歧杆菌TMC3115对巨噬细胞中细胞因子基因表达量以及分泌量的影响。实验结果显示，两歧双歧杆菌TMC3115能以菌株特异性的方式显著增强J774.1巨噬细胞中抗炎型基因Arg-1表达，抑制促炎型基因iNOS表达。两歧双歧杆菌TMC3115促进J774.1巨噬细胞中IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α基因表达，并可促进J774.1巨噬细胞分泌IL-6。

使用0.5％、1.0％、5.0％浓度的两歧双歧杆菌TMC3115与J774.1巨噬细胞共培养后的培养液上清液干预3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化，结果显示两歧双歧杆菌TMC3115对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化具有显著的抑制作用。

3、含有本发明两歧双歧杆菌TMC3115的益生产品

(1)两歧双歧杆菌片剂

目前片剂产品是双歧杆菌相关制剂的主要产品形式。该产品是利用本发明的两歧双歧杆菌TMC3115，配合片剂领域的常用原辅材料，如：葡萄糖、乳糖、微晶纤维素、硬脂酸镁以及脱脂奶粉等，经常规制剂技术制成的片状制剂。片剂具有剂量准确，服用和携带方便，便于识别等优点。本发明的片剂制备是按常规的方法，将菌粉与常规的辅料按照常规的比例混合均匀，使其具有良好的流动性和可压性，然后通过压片机机械压成片。压片时可在适度的压力下压成硬度符合要求的片剂。

(2)两歧双歧杆菌颗粒

颗粒也是两歧双歧杆菌制品的一类。颗粒生产非常简单，不需要复杂的设备，携带和服用方便。服用时容易溶解、入口分散性很好。颗粒以菌粉、填充剂、稳定剂和调味剂等组成。本发明的两歧双歧杆菌颗粒主料为本发明的两歧双歧杆菌TMC3115干燥菌粉，辅料为奶粉以及淀粉，根据产品要求还可加入一些常规的甜味剂、香精等调味剂，有的还加入一些营养强化剂。按照常规的比例，经过常规制粒法进行生产，产品可以不同的克重和活菌数进行规格的分类。

(3)两歧双歧杆菌粉剂

粉剂也是两歧双歧杆菌制品的一类。其生产最为便利，采用设备也最为简单。其也具有携带及使用方便的特点。该类产品主要以两歧双歧杆菌TMC3115冻干菌粉为主，添加如麦芽糊精、抗性糊精、低聚异麦芽糖、低聚果糖、水苏糖、乳糖醇等食品原料、益生元及食品添加剂，混合均匀，也可加入天然水果粉进行调味。产品同样可以不同的克重和活菌数进行规格的分类。

(4)两歧双歧杆菌胶囊剂

胶囊剂也是两歧双歧杆菌制品的一类，其分为固体胶囊剂以及液体胶囊剂，固体胶囊剂，是将两歧双歧杆菌粉剂或者两歧双歧杆菌颗粒剂，经胶囊机制作成为胶囊产品；液体胶囊剂，是将两歧双歧杆菌菌粉与油脂混合，通过胶囊剂制作成软胶囊产品。以上两种产品均可以不同的克重和活菌数进行规格的分类。

(5)本发明两歧双歧杆菌在制备乳制品中的应用

本发明的两歧双歧杆菌TMC3115可以在制备乳制品中使用，乳制品包括酸奶、乳饮料、冰淇淋。但本发明的乳制品不限于此，还包括其他形式的乳制品。本发明的各种乳制品可以通过将本发明的两歧双歧杆菌TMC3115菌粉作为原料，按照本领域常规的方法，以常规的比例添加制成。

实施例1、两歧双歧杆菌乳饮料

鲜奶或浓缩脱脂乳或脱脂乳粉强化的脱脂乳10％-15％。糖液：甜味剂(砂糖或葡萄糖或其他常用甜味剂)22％-30％，柠檬酸0.05％-0.1％，稳定剂(本领域任何常用的用于乳制品的稳定剂)0.1％-0.4％。发酵液、糖液与水比例为1:2:1。

将鲜奶或浓缩脱脂乳或脱脂乳粉强化的脱脂乳用40-50℃去离子水混合料液，充分溶解后预热至60-65℃，20MPa压力下均质，在90-95℃温度下加热杀菌5-30分钟，冷却到42℃；然后在其中添加发酵剂0.003％-0.01％和两歧双歧杆菌TMC3115菌粉0.002％-0.004％，在42℃下培养，使其pH值为4.2-4.5，活菌数达到l0⁸cfu/mL以上。

另外，将作为辅料的甜味剂、稳定剂、色素等，用60-80℃去离子水溶解配成糖浆，经95℃加热杀菌5-30分钟后冷却到42℃，将发酵乳与糖浆混合，必要时添加柠檬酸调节酸度；添加香料后，加一定量的冷却水定容，用10兆帕的压力均质，冷却至25℃，最后将制品灌装于容器中冷藏，其产品活菌数为3×10⁶cfu/mL。

实施例2、两歧双歧杆菌酸乳

将鲜乳加热至50℃以上，加入6.5-8％白砂糖搅拌至完全溶解，预热至60-65℃，20Mpa压力均质，95℃左右杀菌5分钟，冷却至42-45℃，接种发酵剂0.003％-0.01％和本发明两歧双歧杆菌0.002％-0.004％。40-42℃发酵至pH 4.2-4.5，冷却、冷藏，制成凝固型酸乳或搅拌型酸乳。

实施例3、两歧双歧杆菌冰淇淋

制备1000kg冰淇淋，使用白砂糖75kg，全脂奶粉66kg，奶油32kg，椰子油23kg，糖浆26.5kg,稳定剂6kg，本发明两歧双歧杆菌菌粉0.002％-0.004％，将除菌粉外的其他物料混合，预热至60-65℃，20Mpa下均质，70-85℃下杀菌10-30分钟，冷却至40-50℃，加入本发明两歧双歧杆菌菌粉，20-30Mpa下进行均质，在2-4℃下放置6小时，经凝冻硬化制成冰淇淋。

实施例4、两歧双歧杆菌粉剂

选用麦芽糊精、抗性糊精、乳粉等食品原料5％-30％、益生元(低聚果糖、低聚异麦芽糖、水苏糖、乳糖醇等)10％-30％、膳食纤维(菊粉等)5％-15％、果蔬粉5％-10％以及本发明的两歧双歧杆菌菌粉5％-15％，按照一定比例混合，混合后经包装制成粉剂小条即可，终端产品每包活菌数可达100亿到300亿不等，可根据不同活菌数制定产品规格。

实施例5、两歧双歧杆菌TMC3115抑制脂肪细胞功能试验

两歧双歧杆菌TMC3115的培养及灭活

1)称取TMC3115菌粉(1×10¹¹CFU/g)1000.00mg，溶于10.0mL生理盐水制成菌液。

2)菌液10⁷倍稀释，10-3、10-5、10-7稀释样品于TOS琼脂培养基，涂板，37℃厌氧培养。

3)48-72h后，琼脂培养板菌落传代一次，37℃厌氧培养。

4)48-72h后，刮取琼脂板上菌体于装有20.0mL TOS液体培养基的50mL离心管中37℃厌氧培养。

5)72-96h后，含菌体的TOS液体培养基8000rpm 4℃离心5min，弃上清，每管加生理盐水20.0mL清洗，吹打混匀。重复4℃离心、清洗两次。

6)8000rpm 4℃离心5min后弃上清，加生理盐水5.1mL混匀菌体，吸取菌液100.0μL稀释涂板计数(10⁷倍稀释，10-3、10-5、10-7稀释样品TOS培养基涂板，37℃厌氧培养48-72h后计数)。

7)剩余5.0mL菌液121℃高温高压20min灭活，-80℃保存备用。

MTT测定共培养上清液对3T3-L1前脂肪细胞生长的影响

取对数生长期的3T3-L1前脂肪细胞，0.25％胰蛋白酶消化后制成2×10⁴细胞/mL的细胞悬液，以每孔100.0μL接种于96孔板中。细胞置于CO₂孵箱中，37℃、5％CO₂条件下培养。每2-3天换完全培养液一次。3T3-L1前脂肪细胞完全融合2天后，对照组换完全培养液，干预组换含有0.5％、1.0％、5.0％、10.0％、20.0％巨噬细胞与益生菌共培养上清液的完全培养液，每组做4个复孔，继续培养。24h后每孔加入MTT(5mg/mL)200.0μL，37℃、5％CO₂孵育24h后弃去上清液，每孔加入DMSO 200.0μL，37℃、5％CO₂孵育4h，轻轻震荡10min，结晶物充分溶解后，于酶标仪490nm波长测定各孔吸光度值。

共培养上清液对3T3-L1前脂肪细胞脂肪生成量的影响

取对数生长期的3T3-L1前脂肪细胞，0.25％胰蛋白酶消化后制成2×10⁴细胞/mL的细胞悬液，以每孔1.0mL接种于24孔板中。细胞置于CO₂孵箱中，37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养。每2-3天换完全培养液一次。3T3-L1前脂肪细胞完全融合2天后，对照组换成脂分化诱导剂A，干预组换含有0.5％、1.0％、5.％巨噬细胞与益生菌共培养上清液的成脂分化诱导剂A，每组做3个复孔。3天后各组均换为成脂分化诱导剂B，2天后换完全培养液培养3天。各孔细胞进行油红O染色，加异丙醇于染色后的细胞脱色，枪头吹打混匀后吸入96孔板于酶标仪490nm波长测定吸光度值。

由表1可见，0.5％、1.0％、5.0％浓度巨噬细胞与两歧双歧杆菌共培养上清液干预组(J、TMC3115J)吸光度值与常规培养组(C)没有明显差异，提示0.5％、1.0％、5.0％浓度的巨噬细胞与益生菌共培养上清液对3T3-L1前脂肪细胞的生长没有明显影响。

10.0％、20.0％浓度下，J、TMC3115J组吸光度值显著低于C组(P<0.05；P<0.05)。提示10.0％、20.0％浓度的巨噬细胞与益生菌共培养上清液可抑制3T3-L1前脂肪细胞的生长。

表1巨噬细胞与TMC3115共培养上清液对3T3-L1前脂肪细胞生长的影响(n＝4)

由表2可见，与常规成脂分化诱导组(C)相比，0.5％、1.0％浓度J774.1与TMC3115灭活菌共培养上清液干预组(0.5％J、0.5％TMC3115J、1.0％J、1.0％TMC3115J)油红O染色后吸光度值无明显差异。5.0％浓度J774.1与TMC3115灭活菌共培养上清液干预组(5.0％J、5.0％TMC3115J)油红O染色后吸光度值显著低于C组(P<0.05)，且5.0％TMC3115J组明显低于5.0％J组(P<0.05)。提示5.0％浓度J744.1细胞常规培养上清液以及5.0％浓度J744.1细胞与TMC3115灭活菌共培养上清液均能抑制3T3-L1前脂肪细胞中脂肪的生成，且TMC3115灭活菌能显著增强这一抑制效果。

表2TMC3115对3T3-L1前脂肪细胞脂肪生成量的影响(n＝3)

整体试验结果证明TMC3115具有抑制3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的功能。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种两歧双歧杆菌TMC3115，其特征在于,所述的两歧双歧杆菌菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏（地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所），保藏日期2013年11月11日，保藏号为CGMCC No.8462。

2.根据权利要求1所述的两歧双歧杆菌TMC3115，其特征在于具有明显的抑制脂肪细胞的功能。

3.根据权利要求1或2所述的两歧双歧杆菌TMC3115，其特征在于对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化具有显著的抑制作用。

4.根据权利要求1或2所述的两歧双歧杆菌TMC3115，其特征在于能显著增强J774.1巨噬细胞中抗炎型基因Arg-1表达，抑制促炎型基因iNOS表达，促进J774.1巨噬细胞中IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α基因表达，并可促进J774.1巨噬细胞分泌IL-6。

5.根据权利要求1或2所述的两歧双歧杆菌TMC3115，其特征在于含有两歧双歧杆菌TMC3115的益生产品包括两歧双歧杆菌片剂，两歧双歧杆菌颗粒，两歧双歧杆菌粉剂，两歧双歧杆菌胶囊剂。

6.根据权利要求1或2所述的两歧双歧杆菌TMC3115，其特征在于应用于乳制品的制备。