CN104630086A

CN104630086A - 一种防治稻瘟病的解淀粉芽孢杆菌rl263

Info

Publication number: CN104630086A
Application number: CN201410671030.5A
Authority: CN
Inventors: 王�琦; 李双东; 李燕
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2014-11-20
Filing date: 2014-11-20
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2034-11-20
Also published as: CN104630086B

Abstract

本发明公开了一种防治稻瘟病的解淀粉芽孢杆菌RL263(Bacillus amyloliquefaciens)，包含所述解淀粉芽孢杆菌RL263的菌剂，使用所述解淀粉芽孢杆菌RL263防治稻瘟病的方法及其在防治稻瘟病中的用途。本发明的解淀粉芽孢杆菌具有对稻瘟病更高效的防治作用。

Description

一种防治稻瘟病的解淀粉芽孢杆菌RL263

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种防治稻瘟病的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)及其应用。

背景技术

水稻是世界范围内最主要的粮食作物之一，在我国，水稻的种植面积约为全国耕地的1/4，而年产量却占全国粮食总产量的一半。在水稻生产过程中，病害问题(尤其稻瘟病)是制约水稻高产稳产的重要障碍因素之一(董金皋等，2008)。

稻瘟病是由稻卵孢球腔菌Magnaprthe grisea(Hebert)Barr引起的真菌性病害(孙泰宏，2009)。稻瘟病是分布最广泛、危害最严重的植物真菌病害之一。根据发病时期和发病部位的不同可分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟、枝梗瘟、谷粒瘟等，其中以叶瘟、穗颈瘟最为常见，危害较大。在我国，南北稻区每年都有此病不同程度的发生和流行。其发病区分布广泛，尤以山区、丘陵地区发生较重；病情扩散速度快，一旦条件适宜，容易流行成灾；造成损失严重，病害流行年份，一般减产10％-20％，严重的可达40％-50％，特别严重的田块甚至颗粒无收。由此可见，稻瘟病是严重影响水稻生产的重要病害，因而对稻瘟病进行防治具有十分重要的意义。

化学防治作为该病害最主要的防治措施之一，具有较长的历史沿革，化学防治的优点在于见效快，成本低、使用方便、多病兼治。缺点在于长期以来对其大量、不合理的使用，会导致防效降低，其高毒、高残留的特性不仅对人、畜的健康造成危害，而且对土壤、水体、大气造成严重污染，破坏生态平衡。同时，由于病菌抗药性不断增强，农药的使用量和使用频度不断加大，尽管化学防治起初很有效，但是随着时间的发展，植物病菌会出现不同程度的抗药性。

随着植物病害防治技术的改进，人类对环境的高度重视，探寻一种对人类和环境友好并具良好防效的防治策略—利用有益微生物防治稻瘟病已成为当务之急(刘国权，2004)。目前，防治稻瘟病的有益微生物类群主要有放线菌、真菌、细菌及真菌病毒等。目前用于生物防治的细菌主要有芽孢杆菌和假单孢杆菌，且芽孢杆菌是近年来科研工作者研究的热点(穆常青，2006)。

芽孢杆菌中用于防治稻瘟病的种类已经报道的主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)和蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)等。彭化贤等，利用水稻根际分离获得的蜡样芽孢杆菌Ma-32和枯草芽孢杆菌Xi-55，进行田间防效试验，连续两年防效均为50％以上(彭化贤，2002)。穆常青等研究发现，芽孢杆菌浓度在1x10⁸c fu/mL时，对穗颈瘟的防效达57.2％，增产率达9.6％(穆常青，2006)。高学文等研究发现，枯草芽孢杆菌B2菌株产生的胞外物质，对小麦纹枯病菌和稻瘟病菌菌丝生长均具有抑制作用(高学文等，2003)。朱桂梅，陈宏州等，利用短小芽孢杆菌TW-2菌株对水稻穗颈瘟进行防治，结果表明：TW-2不仅对稻瘟病菌具有强烈的抑制作用，对穗颈瘟的防效也达到80％以上(朱桂梅等，2007)。

目前，国内利用解淀粉芽孢杆菌防治稻瘟病的研究较少。陈成等研究发现，解淀粉芽孢杆菌HN-06的代谢产物经分离纯化后，对稻瘟病菌具有显著的抑菌作用(陈成，2010)。陆凡等研究发现，解淀粉芽孢杆菌T553具有蛋白酶、纤维素酶活性及产嗜铁素能力,且对水稻稻瘟病菌的抑制作用比较明显(陆凡，2011)。在已报道的解淀粉芽孢杆菌防治稻瘟病的研究中，对于实验室抑菌效果的研究较多，但对于田间防治效果、实际生产应用的研究较少。所以，出于本领域中还仍旧存在对水稻稻瘟病具有广谱且高效的防效、能够有效增产的新的解淀粉芽孢杆菌菌株的需要。需要改进筛选方式，改变离体条件下菌株抑菌能力检测的传统筛选方法，建立在水稻叶片上直接进行抑菌防病检测的高通量的筛选方法，获得大量有益菌，并对菌株的田间防效进行充分验证，对其实际生产应用潜力进行准确评估与大力开发。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具对稻瘟病有稳定且高效的防效、能够有效增产的解淀粉芽孢杆菌菌株。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

在第一方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌RL263(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2014年5月21日，保藏编号为CGMCC No.9191。

在第二方面，本发明提供了一种菌剂，其包含如第一方面所述的解淀粉芽孢杆菌RL263。

在第三方面，本发明提供了一种防治稻瘟病的方法，其包括将如第一方面所述的解淀粉芽孢杆菌RL263或如第二方面所述的菌剂施用于水稻作物。

在本发明的防治稻瘟病的方法中，所述菌剂为所述解淀粉芽孢杆菌RL263的培养液。

在本发明的防治稻瘟病的方法中，所述稻瘟病为苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、穗瘟、枝梗瘟和/或谷粒瘟。其中，优选地，所述稻瘟病为叶瘟和/或穗颈瘟。

在第四方面，本发明提供了如第一方面所述的解淀粉芽孢杆菌RL263或如第二方面所述的菌剂在防治稻瘟病中的用途。

在本发明的防治稻瘟病的用途中，所述稻瘟病为苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、穗瘟、枝梗瘟和/或谷粒瘟。其中，优选地，所述稻瘟病为叶瘟和/或穗颈瘟。

本发明的有益技术效果为：

本发明所获得的解淀粉芽孢杆菌RL263，分离自水稻植株叶片内部，适应水稻植株叶部的微生态环境，能够在叶片内部很好的定殖生存，可以有效延长其在田间的防治有效期。

本菌株是直接依据实验室离体叶片防效测定结果筛选获得，并经过连续2年不同地点不同水稻品种的田间防效验证，其田间防效稳定，具有较高的实际应用潜力。

本菌株分离自水稻植株内部，而非其他生态***，其与水稻田的环境相容性更好，能够更好的保持水稻田生态环境。

附图说明

图1是解淀粉芽孢杆菌菌株RL26316S rDNA序列测定聚类分析图谱。

图2是解淀粉芽孢杆菌菌株RL263的gyrA序列测定聚类分析图谱。

图3是解淀粉芽孢杆菌RL263菌株对稻瘟病菌菌落生长的抑制效果。

图4是解淀粉芽孢杆菌RL263菌株对稻瘟病菌菌落生长抑制试验的空白对照，即仅在培养基平板中接种稻瘟病菌的菌落生长效果。

图5是解淀粉芽孢杆菌RL263菌株发酵液对稻瘟菌孢子萌发的抑制试验结果。

图6是解淀粉芽孢杆菌RL263菌株发酵液对稻瘟菌孢子萌发的抑制效果。

图7是清水处理的稻瘟菌孢子正常萌发并形成附着胞。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

实施例1：解淀粉芽孢杆菌RL263菌株的筛选

(1)水稻材料：所采用的样品为水稻叶片，品种为辽星1号，采集地点为辽宁省东港市。

(2)所用的培养基：

1)牛肉膏培养基(NA)：牛肉膏3g，大豆蛋白胨7g，NaCl 5g，琼脂20g，1L dH₂O，pH值为7.2。

2)牛肉膏液体培养基(NB):牛肉膏3g，大豆蛋白胨7g，NaCl 5g，1LdH₂O，pH值为7.2。

3)胰蛋白胨液体培养基(LB)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，1L dH₂O，pH值为7.2。

4)番茄燕麦培养基：燕麦40g，番茄汁150mL，琼脂20g，CaCO₃0.6g,1L dH₂O。

(3)芽孢杆菌的分离：(a)水稻叶片经清水冲洗干净，1％次氯酸钠消毒8min，无菌水漂洗4次，取100μl第4次漂洗水涂牛肉膏培养基平板培养3d，无菌落出现，表明水稻叶片表面灭菌干净；(b)将表面灭菌水稻组织分段，约2g放入已灭菌研钵中，加适量灭菌石英砂、10mL无菌水进行充分研磨，取所获汁液1mL，加入含9mL无菌水的试管中，震荡混合均匀。梯度稀释至10^-3浓度，将10^-1、10^-2、10^-3浓度的稀释液在80℃的水温中水浴30min，分别取100μl涂牛肉膏培养基平板，30℃培养。(c)对获得的菌落根据菌落形态进行单菌落纯化培养；挑取纯化的菌株单菌落，置于15％的甘油中，-80℃超低温保存。

(4)防治稻瘟病芽孢杆菌的筛选：

1)芽孢杆菌菌株发酵液的制备：将菌株从-80℃冰箱中取出，接种在牛肉膏培养基平板上培养活化24h，接入100mL(500mL的三角瓶)的牛肉膏蛋白胨培养液中，28℃，180r/min，培养24h，得菌株种子液。取所得种子液，按2％的接种量加入到100mL(500mL的三角瓶)的牛肉膏蛋白胨培养液中，28℃，180r/min，培养2d，得菌株发酵液。

2)芽孢杆菌离体叶片防效测定：取水稻四叶期功能叶,置超声波清洗仪清洗5min，无菌水冲洗3次，置超净工作台晾干，剪为8cm长片段，RL263发酵液浸泡(1.0×10⁸cfu·mL-1)处理0.5h，置超净工作台晾干。在培养皿里垫灭菌湿润滤纸保湿，平行放入灭菌竹制牙签，将叶片放在培养皿中的牙签上，使叶片与滤纸不发生接触，每皿4个叶片，叶片两端用湿润脱脂棉缠绕保湿，24h后将稻瘟菌孢子悬浮液(1×10⁵cfu·mL-1)悬滴于叶片上，每叶片4滴，每滴20μL，28℃暗处理24h后转入16h光照：8h黑暗光周期，设仅用无菌水处理为对照1，仅接稻瘟菌的处理为对照2，5d后观察，统计发病结果，计算病斑抑制率：

经离体叶片防效检测，筛选得到防效最高的菌株RL263的病斑抑制率为66.56％，并且叶片病斑扩展速度明显比只接稻瘟菌的对照慢。表明RL263菌株在水稻离体条件下对叶瘟有明显的抑制病菌侵染形成病斑，并延缓病害发展、抑制病斑扩展的效果。

(5)解淀粉芽孢杆菌的鉴定：经综合16S rDNA及gyrA测序和序列比对鉴定，结果表明：RL263的16S rDNA基因序列与解淀粉芽孢杆菌同源性为99％，并与解淀粉芽孢杆菌(GU688203)、解淀粉芽孢杆菌(FJ844828)、枯草芽孢杆菌(Gu888127)、枯草芽孢杆菌(HQ327128)聚为一大类(参见图1)。解淀粉芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌的近缘种，由于它们有非常相似的显微特征和理化特征，采用常规的鉴定方法很难准确区分，而利用gyrA基因可以有效区分，结果表明，解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌分别聚为两大类(参见图2)。通过16S rDNA及gyrA***进化树分析，菌株RL263为解淀粉芽孢杆菌。

发明人已将本菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2014年5月21日，保藏编号为CGMCC No.9191。

实施例2：解淀粉芽孢杆菌RL263菌株的生物活性测定：

(1)解淀粉芽孢杆菌RL263对稻叶瘟温室盆栽防效试验：分别以丽江新团黑谷、辽星1号水稻品种为实验材料，在水稻四叶一心期，叶片喷施1％硫酸铵溶液，3d后，选取生长一致的植株进行生防试验。制备1×10⁵cfu·mL-1的稻瘟菌孢子悬浮液，对RL263菌株进行喷雾接种，接种后保持黑暗12h，湿度90％。2h后，以RL263菌株发酵液对接种过病原菌的水稻植株进行喷雾，浓度为1.0×10⁸cfu·mL-1，每处理30株，以清水喷雾的处理为对照1，仅接种稻瘟病菌的处理为对照2。1周后调查叶瘟发病请况，计算病情指数及防效(参见表1)。

表1菌株RL263对稻叶瘟的温室盆栽防效试验

注：表中数据为3次以上重复的平均值，差异显著性分析用spss软件Duncan’s多重比较测验所得结果，α＝0.05

(2)解淀粉芽孢杆菌RL263对稻瘟病的田间防治试验：2012年与2013年进行连续2年的田间防效试验。试验地点为辽宁省盘锦市及辽宁省东港市水稻试验田，水稻品种分别为盐丰47号与辽星1号。采用叶片喷施RL263菌株发酵液进行防治，RL263发酵液的菌体浓度为1.0×10⁸cfu/mL，以75％三环唑可湿性粉剂(600g/hm²)作为药剂对照，并以清水作为空白对照，试验采取随机区组设计，每处理3个重复，共计9小区，80m²/小区，每小区之间设置1m保护行。在水稻拔节期、分蘖盛期以及破口期、齐穗期各防治一次，在喷菌前14d以及喷菌后9d调查病情指数。调查方法：每小区五点取样，每点调查10穴，记录感病叶(穗)数目及其对应的病害严重程度，病害严重度用分级的方法来表示，分级标准如下。水稻成熟后，测定每小区实际产量，计算亩产。

叶(穗)瘟分级标准：

叶瘟(以叶为单位)；

0级：无病

1级：圆形稍长的灰色小病斑，边缘褐色，直径约1～2mm

2级：直径为1mm的褐色小点

3级：典型纺锤形病斑，长1～2cm，常局限于两条主脉间，为害面积2％以下

4级：典型病斑，为害面积2.1～10％

5级：典型病斑，为害面积10.1～25％

6级：典型病斑，为害面积25.1～50％

7级：典型病斑，为害面积50.1～75％

8级：叶片全部枯死

穗颈瘟(以穗为单位)；

0级：无病

1级：每穗损失5％以下(个别枝梗发病)

3级：每穗损失6～10％(三分之一左右枝梗发病)

5级：每穗损失21％～50％(穗茎或主轴发病，谷粒半瘪)

7级：每穗损失51％～70％(穗茎发病，大部分瘪谷)

9级：每穗损失71％～100％(穗茎发病，造成白穗)

根据以下公式计算病情指数和防效指数，病情指数＝∑(各级病株数×相对病级数)/(调查总株数×最高病级数)×100；防治效果＝(对照区病情指数－防治区病情指数)/对照区病情指数×100％。

结果显示，RL263发酵液对稻叶瘟具有显著防效(参见表2)，在2年两地的连续防效试验中，均与三环唑药剂处理的防效相当，且其对叶瘟的防效最高可达到80％以上。同时，经RL263菌株及药剂处理后穗颈瘟病情指数均有所下降，与清水对照相比均呈显著性差异，防效最高达到84％(参见表3)。试验田产量测定结果表明，RL263菌株及药剂(三环唑)处理后产量均有所提高，分别与清水对照相比，均呈显著性差异，(参见表4)。田间防效试验表明RL263菌株发酵液对稻瘟病具有显著的生防效果，能够显著提高水稻产量。

表2菌株RL263田间防治水稻叶瘟试验结果

表3菌株RL263田间防治水稻穗颈瘟试验结果

表4菌株RL263田间试验产量结果

(3)解淀粉芽孢杆菌RL263对稻瘟病菌菌落生长的影响：在番茄燕麦培养基平板上，对峙接种稻瘟病菌与菌株RL263(参见图3)，以只接种稻瘟病菌为对照(参见图4)；于28℃培养7h，观察稻瘟病菌生长情况，测量RL263的抑菌带宽度(稻瘟病菌菌落与RL263菌落边缘的最短距离)。结果显示菌株RL263的抑菌带宽度为平均1.5cm(参见图3)。

(4)解淀粉芽孢杆菌RL263对稻瘟菌孢子萌发形成附着胞的影响：菌株RL263发酵液经8000r/min离心10min取上清液，经直径为0.22μm的细菌过滤器滤除菌体，得无菌发酵上清液。

将生防菌无菌发酵上清液用无菌水稀释为四个浓度(原浓度、5倍稀释液、10倍稀释液、40倍稀释液)，分别取100μL的发酵上清液(四个浓度)稀释液和100μL的稻瘟菌孢子悬浮液混合，置48孔细胞培养板中28℃温箱中培养，每隔4h取样观察一次，统计附着胞形成率。

结果表明，菌株RL263原浓度发酵液对稻瘟菌孢子萌发形成附着胞抑制效果明显，其40倍稀释液在12h后，对孢子萌发形成附着胞的抑制率仍达到60％以上(参见图5)。以菌株RL263发酵液处理后的稻瘟菌孢子，大部分不能正常萌发(参见图6)；经清水处理的稻瘟病菌孢子可正常萌发并形成附着胞(参见图7)。

(5)解淀粉芽孢杆菌RL263菌株生防活性物质检测

生物膜的检测：将生防菌用LB培养液培养16h，取发酵液按1：1000的比例用LB培养液稀释，取1.5mL转移到灭菌离心管中，30℃静置培养48、60、72h后加入0.1％(w/v)的结晶紫染色15min，用清水冲洗离心管至冲洗液清晰，可看到附着在管壁的被染色的生物膜，加入1.5mL 95％的乙醇漂洗5min，将洗液于570nm下测吸光值。结果见表5。

淀粉酶的检测：取新活化的单菌落接种于含0.2％可溶性淀粉的LB平板上，培养48h，形成明显菌落后，在平板上滴加卢哥式碘液染色，用70％乙醇洗板，观察是否有透明圈的产生。如果有透明圈表明菌株可以产生淀粉酶，每个处理三个重复。结果见表5。

嗜铁素的检测：制作嗜铁素检测平板，将活化的菌株穿刺接种于平板上，28℃培养24、48、60h后观察菌落***是否有黄色晕圈的产生，由于嗜铁素竞争培养基中EDTA螯合的铁离子，使培养基由蓝色变成黄色，因此菌落周围黄色晕圈的大小可代表嗜铁素的产量。每个处理设3个重复。结果见表5。

蛋白酶的检测：将活化的菌株穿刺接种于脱脂牛奶琼脂平板上，28℃培养24、48、60h后观察菌落***透明圈的产生，出现透明圈表明蛋白酶的产生。每个处理设3个重复，结果见表5。

几丁质酶的检测：几丁质酶用胶体几丁质培养基检测，将活化的菌株穿刺接种于几丁质酶检测培养基平板上，28℃培养24、48、60h后观察菌落***透明圈的产生，出现透明圈表明有几丁质酶的产生。每个处理设3个重复，结果见表5。

葡聚糖酶检测：菌株接种于含有地衣多糖为底物的LB平板中，30℃培养48h后，用1％刚果红染色5min，随后用1mol/L NaCL洗脱，观察平板中是否出现透明圈，若有透明圈则表明有葡聚糖酶的产生。每个处理三个重复，结果见表5。

纤维素酶的检测：将活化的菌株穿刺接种于纤维素刚果红培养基平板上，28℃培养24、48、60h后观察菌落周围红色水解圈的产生，出现红色水解圈表明有纤维素酶的产生。每个处理设3个重复，结果见表5。

生物表面活性剂的检测：在96孔板上均匀的滴加一滴油滴(10W-40Castorl)，晾干后再滴加菌株无菌发酵上清液，若液滴坍塌则表明这种菌能产生表面活性剂，若液滴成水珠状则表明这种菌不产生表面活性剂。结果见表5。

HCN的检测：在含有4.5g/L甘氨酸的KMB培养基上活化菌株，在培养皿的盖上面放一张灭菌的滤纸，滤纸用含有1％的苦味酸和2％的碳酸钠混合液浸湿，密封培养皿，在30℃培养48h，观察滤纸颜色变化，若滤纸由红色变成红褐色表明有HCN的产生。每个处理三个重复。结果见表5。

表5不同菌株生防相关物质检测

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用条件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种防治稻瘟病的解淀粉芽孢杆菌RL263(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2014年5月21日，保藏编号为CGMCC No.9191。

2.一种菌剂，其包含如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌RL263。

3.一种防治稻瘟病的方法，其包括将如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌RL263或如权利要求2所述的菌剂施用于水稻作物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述菌剂为所述解淀粉芽孢杆菌RL263的培养液。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述稻瘟病为苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、穗瘟、枝梗瘟和/或谷粒瘟。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述稻瘟病为叶瘟和/或穗颈瘟。

7.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌RL263或如权利要求2所述的菌剂在防治稻瘟病中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述稻瘟病为苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、穗瘟、枝梗瘟和/或谷粒瘟。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述稻瘟病为叶瘟和/或穗颈瘟。