CN104630077B - 一种高山被孢霉ccfm442菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高山被孢霉CCFM442菌株及其用途。本发明利用高山被孢霉CCFM442菌株生产菌体饲料添加剂，该生产菌体饲料添加剂的方法包括斜面培养、种子培养、发酵培养以及后处理步骤。该菌体饲料添加剂安全性高。该菌体饲料添加剂中的脂肪酸组成合理，多不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的含量达到42.4‑45.8％，ω‑6/ω‑3比为4.5‑5.3，符合WHO和FAO的推荐标准。该菌体饲料添加剂生产所用培养基为廉价葡萄糖和豆粕，二者市场价格较低且容易获得，因此生产成本低。

Description

一种高山被孢霉CCFM442菌株及其用途

【技术领域】

本发明属于动物饲料技术领域。更具体地，本发明涉及一种高山被孢霉CCFM442菌株，还涉及所述高山被孢霉CCFM442菌株的用途。

【背景技术】

多不饱和脂肪酸(PUFAs)可分为ω-6和ω-3等系列。ω-6系列PUFAs主要有亚油酸(LA)、γ-亚麻酸(GLA)、花生四烯酸(AA)等。AA是人体***素合成的重要前体物质，它具有增加血管弹性和提高免疫力等生理功能，是重要的奶粉营养补充剂。ω-3系列PUFAs主要有α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)以及二十二碳六烯酸(DHA)。EPA能降低血液胆固醇水平以及动脉粥样硬化发生风险。DHA在提高婴幼儿智力等方面具有重要作用。WHO和FAO提出膳食中ω-6PUFAs和ω-3PUFAs的比例(以下简称ω-6/ω-3比)的最适值为(5-10)：1，在我国该比例严重失衡，达(10-30)：1。流行病学资料显示，饮食中ω-6/ω-3比过高与某些疾病的高发密切相关，如糖尿病、冠心病、乳腺癌等。因此，提高饮食中ω-3PUFAs比例并维持ω-6/ω-3比在适宜范围内具有重要意义。

ω-3系列PUFAs多来自于动物肝脏和鱼油等材料，因环境污染等因素，其生产受到限制。高山被孢霉(Mortierella alpina,M.alpina)是目前产PUFAs真菌中唯一经过正式安全性评估的菌种，其发酵生产ω-3PUFAs已被实验证实可行。利用M.alpina菌体制作菌饲料饲喂蛋鸡，可使鸡蛋中的ω-3PUFAs含量增加，这有助于提高饮食中ω-3PUFAs的比例。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种高山被孢霉CCFM442菌株。

本发明的另一个目的是提供所述高山被孢霉CCFM442菌株的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种高山被孢霉Mortierella alpina CCFM442，该菌株已于2014年12月25日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No 10295。

高山被孢霉菌株CCFM442为对高山被孢霉野生型菌株进行遗传修饰后获得的工程菌株。具体遗传修饰方法以及所得菌株的生物学性质参见中国专利申请CN201410087487.1的记载。所得的高山被孢霉具体培养条件如下：它先在温度28℃与转速为200r/min的条件下培养2天，然后在温度12℃与转速200r/min的条件下培养8天，高山被孢霉菌株CCFM442积累脂肪的规律较野生型菌株发生明显变化，其中EPA占总脂肪酸的比例明显增加，约为野生型菌株的7倍。正是由于这种性质的改变，为高山被孢霉菌株CCFM442成为相对高产ω-3PUFAs的工业菌株奠定了基础。

本发明还涉及所述的高山被孢霉CCFM442菌株在生产菌体饲料添加剂中的用途。

根据本发明的一种优选实施方式，生产本发明菌体饲料添加剂的步骤如下：

A、斜面培养

将冷冻保存的高山被孢霉CCFM442菌株挑取一环接种到PDA斜面培养基上，然后在温度25℃的条件下恒温培养14天，得到所述菌株活化培养物。

本发明使用的PDA斜面培养基是根据其常规配方配制的。PDA斜面培养基成分如下：200g马铃薯、20g葡萄糖、15g琼脂与1L自来水，使用氢氧化钠及氯化氢水溶液将其pH调节为6.0-6.2。

在这个步骤中，斜面培养所使用的设备是上海森信实验仪器有限公司销售的隔水式恒温培养箱(型号：GRP-9080)。

B、种子培养

将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到种子培养基中，在温度25℃与200rpm的条件下恒温振荡培养3天，再称得湿菌体重，将湿菌体与无菌水按照湿菌体与无菌水质量比1：4进行混合，接着用分散机对该混合体系进行分散10min以制备菌悬液，再按照每升所述菌悬液为10mL的接种量接种于所述种子培养基中，在温度25℃与转速200rpm的条件下恒温振荡培养36h，得到高山被孢霉CCFM442种子液。

本发明使用的种子培养基是根据下述配方配制的：20g/L葡萄糖、10g/L硝酸钾、3g/L磷酸二氢钾、5g/L酵母提取物与0.25g/L硫酸镁，自然pH。

在这个种子培养步骤中，使用的培养设备是上海知楚仪器有限公司销售的振荡培养箱(型号：ZQZY-70B)。

本发明使用的分散机是艾卡仪器设备有限公司销售的分散机(型号：T10B)。

C、发酵培养

按照以发酵培养基体积计1％-5％接种量，将步骤B得到的高山被孢霉CCFM442种子液接种到发酵培养基中，首先在温度25℃的条件下培养2天，接着在温度6℃的条件下培养5天，得到含有高山被孢霉CCFM442的发酵液。

根据本发明，发酵采用变温培养的主要目的在于温度25℃为高山被孢霉CCFM442最适宜生长温度，在该温度下培养2天可使菌体生物量增至最大；温度6℃为高山被孢霉CCFM442发酵生产EPA的适宜温度，在此温度下培养5天可使菌体积累大量EPA。

在这个步骤中，根据发酵液溶氧量判断菌体生物量是否增至最大，由于培养初期菌体快速生长需消耗大量氧气，所以发酵液溶氧量逐步下降，下降至最低点后溶氧有缓慢升高，该时间点(在温度25℃下培养2天)时菌体生物量最大。

在这个发酵培养步骤中，使用的培养设备是New Brunswick公司销售的4L发酵罐(型号：BioFlo 115)。

所述发酵培养基制备方法如下：制备含有50g/L葡萄糖碳源、20g/L豆粕、13.34g/L硝酸钾、3g/L磷酸氢二钾、1g/L硫酸钠、0.5g/L二水合氯化钙与0.5g/L六水合氯化镁的混合物水溶液，将其水溶液的pH调节至6.0，再在温度121℃下灭菌20min，得到所述的发酵培养基。

所述水溶液的pH是使用硫酸及氢氧化钾水溶液调节的。

D、后处理

让步骤C得到的含有高山被孢霉CCFM442的发酵液进行离心分离，得到的湿菌体用蒸馏水进行洗涤，再离心分离，洗涤湿菌体接着干燥，于是得到一种干燥菌体，即所述的菌体饲料添加剂。

在这个步骤中，所述的洗涤是使用以湿菌体体积计3-5倍蒸馏水洗涤2-4次。

在这个步骤中，第一次与第二次离心分离都是在转速6000rpm的条件下进行离心分离10min。离心分离所使用的设备是Thermo销售的离心机(型号：LYNX 4000)。

在这个步骤中，所述的干燥是在温度48-52℃与风速2.1-2.5m/s的条件下干燥85-95min。

本发明使用的干燥设备是上海森信实验仪器有限公司销售的电热恒温鼓风干燥箱(型号：DGG-9123A)。

采用本发明方法得到的干燥菌体，即所述的菌体饲料添加剂的含水率为以干燥菌体总重量计25.4-26.4％，总脂肪酸含量为7.6-10.7％，其中多不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的含量是42.4-45.8％。

所述的含水率测定参考GB/T 5009.3-2003。

所述的粗脂肪测定参考GB/T 14772-2008。

所述的脂肪酸测定参考文献Wang L,Chen W,Feng Y,et al.Genomecharacterization of the oleaginous fungus Mortierella alpina.Plos One6:e28319.。

在总脂肪酸测定之后，对相应脂肪酸含量进行加和后可得所述的多不饱和脂肪酸含量。

由所述多不饱和脂肪酸中的ω-6系列与ω-3系列多不饱和脂肪酸含量可以计算出，ω-6/ω-3比为4.5-5.3。

根据本发明，所述菌体饲料添加剂的用量是基础饲料总重量的5-10％。

本发明菌体饲料添加剂的脂肪酸组成合理，能提供有利于食用者身体健康的鸡蛋。该添加剂具有使用安全性高、PUFAs含量高、脂肪酸组成合理等优点，在不降低产蛋性能参数的情况下提高鸡蛋中AA、DHA的含量，并维持ω-6/ω-3比在合理范围内。

[有益效果]

本发明的有益效果是：

该菌体饲料添加剂安全性高。本发明使用的菌种已通过正式安全性评估，其生产安全性得到保证；本发明在生产过程中未引入对人体安全造成影响的物质。

该菌体饲料添加剂中的脂肪酸组成合理，多不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的含量达到42.4-45.8％，ω-6/ω-3比为4.5-5.3，符合WHO和FAO的推荐标准。

该菌体饲料添加剂生产所用培养基为廉价葡萄糖和豆粕，二者市场价格较低且容易获得，因此生产成本低。

本发明涉及的高山被孢霉Mortierella alpina CCFM442已于2014年12月25日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.10295。

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

实施例1：生产本发明的菌体饲料添加剂

该实施例的实施步骤如下：

A、斜面培养

将冷冻保存的高山被孢霉CCFM442菌株挑取一环接种到所述的PDA斜面培养基上，然后在由上海森信实验仪器有限公司销售的隔水式恒温培养箱(型号：GRP-9080)中在温度25℃的条件下恒温培养14天，得到所述菌株活化培养物。

B、种子培养

将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到按照说明书所描述方法配制的种子培养基中，然后在由上海知楚仪器有限公司销售的振荡培养箱(型号：ZQZY-70B)中在温度25℃与转速200rpm的条件下恒温振荡培养3天，然后称得湿菌体重，将湿菌体与无菌水按照湿菌体与无菌水质量比1：4进行混合，然后用由艾卡仪器设备有限公司销售的分散机(型号：T10B)对该混合体系进行分散10min以制备菌悬液，再按照每升所述菌悬液为10mL的接种量接种于所述的种子培养基中，在同一种子培养设备中在温度25℃与转速200rpm的条件下恒温振荡培养36h，得到高山被孢霉CCFM442种子液。

C、发酵培养

制备含有50g/L葡萄糖碳源、20g/L豆粕、13.34g/L硝酸钾、3g/L磷酸氢二钾、1g/L硫酸钠、0.5g/L二水合氯化钙与0.5g/L六水合氯化镁的混合物水溶液，使用1M硫酸或氢氧化钾水溶液将其水溶液的pH调节至6.0，再在温度121℃下灭菌20min，得到所述的发酵培养基；

按照以发酵培养基体积计2％接种量，将步骤B得到的高山被孢霉CCFM442种子液接种到发酵培养基中，在由New Brunswick公司销售的4L发酵罐(型号：BioFlo 115)中进行发酵培养。首先在温度25℃的条件下培养2天使菌体生物量增至最大，判断依据为发酵液溶氧量，由于培养初期菌体快速生长需消耗大量氧气，所以发酵液溶氧量逐步下降，下降至最低点后溶氧量有缓慢升高，该时间点(在温度25℃下培养2天)时菌体生物量最大，接着在温度6℃的条件下培养5天以促进菌体积累EPA。

D、后处理

使用由Thermo销售的离心机(型号：LYNX 4000)，让步骤C得到的含有高山被孢霉CCFM442的发酵液在转速6000rpm的条件下进行离心分离，得到的湿菌体使用以湿菌体体积计4倍蒸馏水洗涤3次，使用同一离心机在转速6000rpm的条件下离心分离，得到的洗涤沉淀物接着在上海森信实验仪器有限公司销售的电热恒温鼓风干燥箱(型号：DGG-9123A)中在温度50℃与风速2.3m/s的条件下干燥90min，得到干燥菌体，即所述的菌体饲料添加剂。

采用本说明书描述的的含水率测定参考GB/T 5009.3-2003。粗脂肪测定参考GB/T14772-2008。脂肪酸测定参考文献Wang L,Chen W,Feng Y,et al.Genomecharacterization of the oleaginous fungus Mortierella alpina.Plos One6:e28319.。

本实施例制备得到的干燥菌体(菌体饲料添加剂)的含水率为以干燥菌体总重量计26.38％，总脂肪酸含量为10.56％，其中多不饱和脂肪酸以及ω-6系列多不饱和脂肪酸与ω-3系列多不饱和脂肪酸含量列于下表1中。

表1：菌体饲料添加剂的脂肪酸组成与含量

注：表中数据以平均数±标准差表示；ω-6/ω-3比为4.47±0.76。

本菌体添加剂脂肪酸种类较为丰富，PUFAs含量占总脂肪酸含量的45.76％±0.81％，其中作为重要的婴幼儿奶粉添加剂的AA含量占总脂肪酸含量24.43％±0.75％，具有重要的免疫功能的EPA含量占总脂肪酸含量的6.09％±0.15％；普通鸡蛋中的ω-3PUFAs主要为DHA，约占全蛋总重量的0.04％，AA约占全蛋总重量的0.11％。我国2000年规定婴儿强化奶粉中AA的添加量为0.16％-0.26％，DHA的添加量为0.04％-0.18％。因而从AA和DHA含量的角度上看，对普通鸡蛋脂肪酸成分进行改善特别在增加二者的含量这方面尤其必要。因此，本菌体添加剂具有生产上的优越性，以及在改善鸡蛋脂肪酸组成、提高鸡蛋中DHA和AA的含量上的重要性。

实施例2：生产本发明的菌体饲料添加剂

该实施例的实施方式与实施例1相同，只是在步骤C中种子液接种量为以发酵培养基体积计5％。

采用本说明书描述的方法沉淀，本实施例制备得到的干燥菌体(菌体饲料添加剂)的含水率为以干燥菌体总重量计25.37％，总脂肪酸含量为9.07％，其中多不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的含量是42.37％。ω-6系列多不饱和脂肪酸与ω-3系列多不饱和脂肪酸的比为4.95。

实施例3：生产本发明的菌体饲料添加剂

该实施例的实施方式与实施例1相同，只是在步骤C中种子液接种量为以发酵培养基体积计1％。

采用本说明书描述的方法沉淀，本实施例制备得到的干燥菌体(菌体饲料添加剂)的含水率为以干燥菌体总重量计25.99％，总脂肪酸含量为7.64％，其中多不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的含量是43.76％。ω-6系列多不饱和脂肪酸与ω-3系列多不饱和脂肪酸的比为5.28。

对以上实施例1、2、3试验结果进行总结，见表2。

表2：各实施例中菌体成分指标

注：1表中数据以平均数±标准差表示。

2同行肩标字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

对比实施例1：生产本发明的菌体饲料添加剂

该对比实施例的实施方式与实施例1相同，只是在步骤C种子培养时，发酵培养前期与在发酵培养后期都是温度25℃的条件下进行培养的。

采用本说明书描述的方法沉淀，本实施例制备得到的干燥菌体(菌体饲料添加剂)的含水率为以干燥菌体总重量计25.11％，总脂肪酸含量为15.56％，其中多不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的含量是39.15％。ω-6系列多不饱和脂肪酸与ω-3系列多不饱和脂肪酸的比为23.72.。

对比实施例2：生产本发明的菌体饲料添加剂

该对比实施例的实施方式与实施例1相同，只是在步骤C种子培养时，发酵培养前期与在发酵培养后期都是温度6℃的条件下进行培养的。

采用本说明书描述的方法，由于整个过程全部在6℃的条件下进行发酵培养，菌体几乎不生长，菌体生物量小于1g/L，小于变温培养下的50g/L，菌体中仅有极少量EPA检出。

由实施例1与对比实施例1和2的实施结果进行比较可以知道，根据高山被孢霉CCFM442的产脂规律，采用变温培养策略能促进菌体积累大量的EPA，而恒温培养(温度6℃或25℃)难以满足实际要求。

试验实施例1

为了更有效地说明该菌体饲料添加剂的实用性，先将菌体饲料添加剂分别以基础饲料总重量计5％或10％与基础饲料混合造粒，然后采取了一系列动物试验加以验证。以下为动物试验的具体实施方式和结果分析：

1、菌体饲料的制备。

基础饲料购买自绿科茂牧业有限公司，该产品主要成分含量如下表3中。

表3：基础饲料组成及脂肪酸分布表

注：数据以平均数±标准差表示。

将本发明干燥菌体添加剂粉碎，然后分别按照基础饲料总重量的5％和10％添加到所述的基础饲料中，混合造粒后置于4℃冷库保存。

2、试验分组与设计

选取25周鸡龄蛋鸡，共45只，随机分为3组，分别记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。其中Ⅰ组为对照组，Ⅱ、Ⅲ组为实验组。

将整个实验期分为适应期与试验期。在适应期14d三个组都用基础饲料饲喂。在试验期，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别以基础饲料、低剂量(以基础饲料重量计5％，下面简称5％组)菌体饲料添加剂饲料、高剂量(以基础饲料重量计10％，下面简称10％组)菌体饲料添加剂饲料饲喂。每隔5d测定鸡蛋指标(见4、测定指标)，至蛋黄脂肪酸水平不变时改喂基础饲料。

3、饲养管理方法

整个饲喂试验在无锡市滨湖区金城路江南驾校院内进行，对蛋鸡采取散养，光照14h/天(日照不足时，采用人工补光)，饲料、水足量。自由采食和饮水，定期对鸡舍进行打扫。每日在8:00、16:00两次喂料，每日记录当天投料量和饲料剩余量。每日16:00捡蛋并标号、记数。

4、测定指标

4.1平均蛋重、产蛋率、料蛋比、进食量生产性能指标。

计算方法如下：

平均蛋重(g/枚)＝每天产蛋量/每天蛋总枚数

产蛋率＝(每天产蛋枚数/存栏鸡数)×100％

料蛋比＝每天耗料量/每天产蛋重

进食量(g)＝M-m

其式中：

M为每日每组投入饲料质量，单位g；

m为次日投料前收集饲料槽内的剩余饲料量，单位g

4.2鸡蛋品质指标，包括蛋形指数、蛋黄色度、蛋黄相对重、蛋壳厚度、哈夫单位。

蛋形指数测定方法：

用游标卡尺测量蛋的纵径与最大横径，测量精确到0.02mm。

蛋形指数＝(横径/纵径)×100％

蛋黄色度测定方法：

使用罗氏比色扇，分别从每个试验组随机取5枚蛋，以黑色为背景，在自然光线下进行目测。

蛋黄相对重测定方法：

使用蛋黄分离器将蛋清和蛋黄完全分离，收集蛋黄称取重量。

蛋黄相对重＝(蛋黄重/全蛋重)×100％

蛋壳厚度测定方法：

用游标卡尺分别测量蛋壳的钝端、中间和锐端三个部位的厚度，求平均值，精确到0.01mm。

哈夫单位测定方法：

将鸡蛋打***在水平放置的平面玻璃板上，用游标卡尺测量浓蛋白的高度。

Hu＝100×log₁₀(H-1.7×W^0.37+7.57)

式中：

Hu为哈夫单位；

H为浓蛋白高度(mm)；

W为蛋重(g)。

4.3、鸡蛋脂肪酸分析。

鸡蛋脂肪酸分析方法参考文献Wang L,Chen W,Feng Y,et al.Genomecharacterization of the oleaginous fungus Mortierella alpina.Plos One6:e28319.。

4.4、鸡蛋脂肪酸分布变化分析。

随饲喂过程进行，等到鸡蛋中各脂肪酸占总脂肪酸百分比不再变化时，即为饲料中脂肪酸转化到鸡蛋中的饱和点。

5、数据计算和统计方法

通过SPSS 17.0软件采用单因素分析各组指标的差异性。

6、结果及分析

实验发现，该菌体添加剂补充饲喂10天后鸡蛋中各脂肪酸占总脂肪酸百分比不再变化，因而对补充期10天及10天前的鸡蛋样品进行指标测定。

6.1生产性能指标

各实验组蛋鸡生产性能指标列于表4中。

表4：各实验组蛋鸡生产性能指标

注：1数据以平均数±标准差表示；

2同行肩标字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

试验结果发现：与对照组相比，添加5％和10％菌体添加剂对蛋鸡体重、摄食量、产蛋率、平均蛋重指标影响差异不显著。由于对蛋鸡采取室外散养，温度等环境条件难以保持控制，因而蛋鸡产蛋率和平均蛋重均低于普通笼养蛋鸡的数据；与笼养蛋鸡相比，散养蛋鸡活动量大，根据能量分配规律，因而散养蛋鸡料蛋比较高，上述结果与文献报道一致。

6.2、鸡蛋品质指标

各实验组蛋鸡生产鸡蛋品质指标列于表5中。

表5 各实验组鸡蛋品质指标

注：1数据以平均数±标准差表示；

2同行肩标字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

试验结果表明：对照组相比，添加5％和10％菌体饲料添加剂对蛋鸡蛋形指数、蛋黄色度、蛋黄相对重、蛋壳厚度、哈夫单位指标影响差异不显著。因此，该菌体饲料添加剂不会降低鸡蛋品质指标。

6.3鸡蛋脂肪酸组成

各实验组蛋鸡生产鸡蛋蛋黄中主要脂肪酸含量结果列于表6中。

表6：蛋黄中主要脂肪酸含量测定结果

注：

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的ω-6/ω-3比分别为29.63±0.55^a、15.91±1.93^b、12.89±0.52^b；

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的总脂肪酸量为蛋黄总重量的百分比分别是22.37±0.54^a、21.91±0.83^a、23.51±0.93^a；

表中数据以平均数±标准差表示；同行肩标字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

由上述试验结果可以看出：

对于添加5％高山被孢霉菌体饲料添加剂，DHA占总脂肪酸比例由0.45％增至1.06％(P＜0.05)，AA占总脂肪酸比例由2.69％增加至3.26％(P＜0.05)，无EPA检出，ω-6/ω-3比由29.63降低至15.91(P＜0.05)；

对于添加10％高山被孢霉菌体饲料添加剂，DHA占总脂肪酸比例进一步增加至1.27％(P＜0.05)，AA占总脂肪酸比例为对照组的2倍(P＜0.05)，同时有极少量(0.07％)的EPA检出，ω-6/ω-3比进一步降低至12.89(P＞0.05)。

上述数据表明，添加5％高山被孢霉菌体添加剂能显著提高散养鸡鸡蛋中AA和DHA的含量；当菌体饲料添加剂的添加量增至10％后，鸡蛋中DHA的含量较5％添加剂组显著增加(P＜0.05)，同时鸡蛋中AA占总脂肪酸比例较5％添加剂组有所增加，但二者无显著性差异(P＞0.05)。以上试验结果表明，添加一定比例该菌体饲料添加剂后，菌体脂肪中的ω-3PUFAs能在鸡蛋蛋黄中沉积转化并主要以DHA的形式存在，AA占总脂肪酸比例较对照组可增加1倍，总ω-3PUFAs占总脂肪酸比例较对照组可增加2倍，同时维持蛋黄中的ω-6/ω-3比在适宜人体吸收的范围内。经计算，饲料中添加5％该菌体添加剂后，AA含量占全蛋0.32％，DHA含量占全蛋0.11％，更接近于强化奶粉中AA和DHA所占比例。

以上实验表明，该高山被孢霉菌体发酵采用较廉价的葡萄糖、豆粕作为碳、氮源，发酵过程中不添加外源物质促进菌体产生脂肪，发酵时间短，因而可通过大批量发酵获得菌体。制成的菌体添加剂以一定比例添加到饲料中并进行动物饲喂试验，对蛋鸡生产指标、鸡蛋品质指标以及鸡蛋脂肪酸成分分析后发现，该菌体添加剂在不降低蛋鸡生产指标和鸡蛋品质指标的同时，能显著提高鸡蛋脂肪中DHA和AA的比例，同时维持ω-6/ω-3在合理的范围内。因此，本发明具有重要的生产意义，可用于改善鸡蛋的脂肪酸组成。

Claims (8)

1.一种用高山被孢霉(Mortierella alpina)CCFM442生产菌体饲料添加剂的方法，其特征在于该生产方法的步骤如下：

A、斜面培养

将冷冻保存的高山被孢霉CCFM442菌株挑取一环接种到PDA斜面培养基上，然后在温度25℃的条件下恒温培养14天，得到所述菌株活化培养物；

B、种子培养

将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到种子培养基中，然后在温度25℃与200rpm的条件下恒温振荡培养3天，再称得湿菌体重，将湿菌体与无菌水按照湿菌体与无菌水的质量比1：4进行混合，接着用分散机对该混合体系进行分散10min以制备菌悬液，再按照每升所述菌悬液为10mL接种量接种于所述种子培养基中，在温度25℃与转速200rpm的条件下恒温振荡培养36h，得到高山被孢霉CCFM442种子液；

C、发酵培养

按照以发酵培养基体积计1％-5％接种量，将步骤B得到的高山被孢霉CCFM442种子液接种到发酵培养基中；首先在温度25℃的条件下培养2天，接着在温度6℃的条件下培养5天，得到含有高山被孢霉CCFM442的发酵液；

所述发酵培养基制备方法如下：制备含有50g/L葡萄糖碳源、20g/L豆粕、13.34g/L硝酸钾、3g/L磷酸氢二钾、1g/L硫酸钠、0.5g/L二水合氯化钙与0.5g/L六水合氯化镁的混合物水溶液，将其水溶液的pH调节至6.0，再在温度121℃下灭菌20min，得到所述的发酵培养基；

D、后处理

让步骤C得到的含有高山被孢霉CCFM442的发酵液进行离心分离，得到的湿菌体用蒸馏水进行洗涤，再离心分离，洗涤湿菌体接着干燥，于是得到一种干燥菌体，即所述的菌体饲料添加剂；

高山被孢霉(Mortierella alpina)CCFM442，该菌株已于2014年12月25日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.10295。

2.根据权利要求1所述的生产菌体饲料添加剂的方法，其特征在于在步骤C中，所述水溶液的pH是使用硫酸及氢氧化钾水溶液调节的。

3.根据权利要求1所述的生产菌体饲料添加剂的方法，其特征在于在步骤D中，所述的离心分离是在转速6000rpm的条件下进行离心分离10min。

4.根据权利要求1所述的生产菌体饲料添加剂的方法，其特征在于在步骤D中，所述的洗涤是使用以湿菌体体积计3-5倍蒸馏水洗涤2-4次。

5.根据权利要求1所述的生产菌体饲料添加剂的方法，其特征在于在步骤D中，所述的干燥是在温度48-52℃与风速2.1-2.5m/s是条件下干燥85-95min。

6.根据权利要求1所述的生产菌体饲料添加剂的方法，其特征在于在步骤D中，所述干燥菌体的含水率为以干燥菌体总重量计25.4-26.4％，总脂肪酸含量为7.6-10.7％，其中多不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的含量是42.4-45.8％。

7.根据权利要求6所述的生产菌体饲料添加剂的方法，其特征在于在所述的多不饱和脂肪酸中，ω-6系列多不饱和脂肪酸与ω-3系列多不饱和脂肪酸的比为4.5-5.3。

8.根据权利要求1-7中任一项权利要求所述的生产菌体饲料添加剂的方法，其特征在于所述菌体饲料添加剂的用量是基础饲料总重量的5-10％。