CN104619839A - 药物递送蛋白质的增强运输的突变体的分离 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分离药物递送蛋白中增强运输的突变体的方法。在一种实施方式中，本发明提供了用于将治疗剂递送至细胞器的载体，其包括由突变的五邻体基质基因编码的多肽。在另一实施方式中，本发明提供了通过施用组合物来增强运输至细胞的方法，所述组合物包括具有增强进入至细胞的一个或多个突变的五邻体基质(PB)蛋白。

Description

药物递送蛋白质的增强运输的突变体的分离
政府权利
本发明在国立卫生研究院(National Institutes of Health)颁发的资助编号CA129822和CA140995的政府支持下完成。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
本发明提供了用于细胞渗透功能以改善药物向特定细胞器的递送的方法和组合物。
背景技术
定向进化已经被用于产生具有新趋性、减少的非特异性递送以及免疫逃逸的假型腺联病毒(AAV)衣壳(Kwon和Schaffer，2008；Maheshri等，2006)。不同选择压力下的体外和体内的噬菌体展示和全病毒文库的生物淘选产生了具有期望特性的蛋白，比如具有增强的配体结合和摄入、免疫相互作用或酶活性(Yuan等，2005)。因此，对于用于产生具有改善特征的新蛋白质变体的合理突变来说，该方法可能是有力的和更有效的替代方案。该方法的最新开发的方式采用易错PCR和交错延伸来产生变体文库，该变体文库可针对不同的细胞类型进行筛选，以挑选出细胞特异性靶向的载体(Zhao等，1998)。迄今为止，尚未开发出分离具有增强的细胞内运输功能的蛋白质变体的方法。本发明提出了一种新程序，以及从该程序产生的具有增强的用于药物递送的细胞渗透功能的新蛋白质分子。
发明内容
各种实施方式包括一种增强运输至细胞的方法，包括：提供组合物，该组合物包括具有增强进入至细胞的一个或多个突变的五邻体基质(PB)蛋白；以及将有效剂量的组合物施用至细胞。在一种实施方式中，一个或多个突变是111C和/或333F。在另一实施方式中，组合物靶向至细胞的细胞质和/或细胞核。在另一实施方式中，组合物进一步包括治疗性药物。在另一实施方式中，细胞是肿瘤细胞。在另一实施方式中，一个或多个突变是SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和/或SEQ ID NO：20。
其他实施方式包括生产靶向至细胞器的药物递送分子的方法。该方法包括下述步骤：a)获得编码五邻体基质(PB)基因的多核苷酸，并产生多核苷酸的突变体；b)将突变的多核苷酸克隆至噬菌体载体，并产生包括噬菌体载体的噬菌体文库；c)用噬菌体文库转化细胞；d)分级分离前述转化的细胞，并从转化的细胞收获细胞器；e)扩增来自前述收获的细胞器的噬菌体；f)用扩增后的来自前述收获的细胞器的噬菌体转化细胞；g)重复步骤(d)、(e)、(f)和(g)；h)滴定来自每轮的前述收获的细胞器的噬菌体；i)选择具有最高滴度的噬菌体，并从噬菌体获得突变的多核苷酸的序列；以及j)产生由前述序列编码的多肽，其中该多肽是靶向至细胞器的药物递送分子。在另一实施方式中，细胞器选自由线粒体、高尔基体、内质网、细胞核、核糖体、质膜和胞质溶胶所组合的组。在另一实施方式中，细胞是哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞。在另一实施方式中，使用下述的任何一种或多种产生突变体：基于PCR的方法、化学诱变、紫外线诱导的诱变或其组合。在另一实施方式中，药物递送分子包括靶向结构域、核内体裂解配体结构域和带正电荷的结构域。
其他实施方式包括一种用于将治疗剂递送至细胞器的载体，所述载体包括由增强进入至细胞的一个或多个五邻体基质(PB)突变编码的多肽。在另一实施方式中，一个或多个五邻体基质(PB)突变包括111C和/或333F。在另一实施方式中，载体进一步包括聚赖氨酸模体。在另一实施方式中，载体进一步包括调蛋白的靶向结构域。在另一实施方式中，一个或多个PB突变包括C-末端缺失。
其他实施方式包括一种治疗剂，该治疗剂包括载体和治疗性药物，所述载体用于将治疗剂递送至细胞器，所述载体包括由增强进入至细胞的一个或多个五邻体基质(PB)突变编码的多肽。在另一实施方式中，治疗性药物是化学治疗剂。
各种其他实施方式包括生产不具有增殖活性的载体的方法，包括：a)获得编码调蛋白(Her)受体结合结构域的多核苷酸，并在该多核苷酸中产生突变体；b)将突变的Her多核苷酸克隆至噬菌体载体，并产生包括噬菌体载体的噬菌体文库；c)在存在有丝***抑制剂的情况下，用噬菌体文库转化MDA-MB-435细胞；d)分级分离前述转化的细胞，并提取MDA-MB-435细胞的膜级分；e)从膜级分收获膜噬菌体；f)在存在有丝***抑制剂的情况下，将膜噬菌体转化为MDA-MB-435细胞；g)重复步骤(d)、(e)和(f)；h)监测每轮的MDA-MB-435细胞增殖，并选择具有最低MDA-MB-435细胞增殖的膜噬菌体；i)在所选择的膜噬菌体中获得Her多核苷酸的突变体的序列；以及j)产生由Her序列和五邻体基质基因编码的多肽，其中该多肽是不具有增殖活性的载体。
其他实施方式包括用于将治疗剂递送至细胞核的载体，其包括由突变的Her序列编码的多肽。在另一实施方式中，该载体进一步包括编码五邻体基质(PB)蛋白的多肽，以及聚赖氨酸模体。在另一实施方式中，PB蛋白是突变体五邻体基质蛋白。
其他实施方式包括一种治疗剂，其包括载体和治疗性药物。
附图说明
图1表示根据本文的实施方式的生物淘选策略；
图2表示根据本文的实施方式的五邻体基质基因基于PCR的随机诱变。基于密度测定法分析，PCR产物(刚好在1600bp条带之上)包含100ng DNA，得到约4800ng的总产量。因为初始靶DNA是97ng，因此产量/初始量之比是约50并且复制数(duplication number)是约5.6，用制造商的规程(GenemorphII，Strategene，La Jolla，CA，USA)中提供的标准曲线外推时，对应的突变率为～8/kb；
图3表示根据本文的实施方式的表达五邻体基质变体的噬菌体的分离，所述五邻体基质变体向细胞核区室的划分被增强。按照细胞结合和摄入部分描述的条件，以1x10^8pfu将表达随机诱变的PB的T7噬菌体文库添加至1x10^6的HeLa细胞。通过胰酶消化去除任何表面结合的噬菌体来收获细胞，然后使用市售分级分离试剂盒(Qproteome Cell Compartment Kit(细胞区室试剂盒)；Qiagen Inc.,Valencia,CA,USA)进行分级分离。按照标准程序进行PEG-沉淀过夜从而从每个级分使噬菌体沉淀，然后再悬浮于TB细菌培养基中，并且添加至BLT5403细菌中以扩增分离的噬菌体。通过噬菌斑测定法来滴定扩增的噬菌体，然后在HeLa上使用如之前描述的相同滴定和条件进行再淘选。对于从细胞溶质级分获得的噬菌体，进行3轮的细胞溶质生物淘选，而对于从细胞核级分获得的进行2轮；
图4表示根据本文的实施方式的由生物淘选分离的运输变体的比对；
图5表示根据本文的实施方式的全长突变体111C展示出增强的向细胞质和细胞核的运输。图5(A)通过丙酮沉淀法从每个级分使蛋白质沉淀，并且将小球再悬浮在40uL脱盐缓冲液中，随后通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)和蛋白质印记法分析。图5(B)表示使用Image J进行的条带密度分析，显示出与野生型蛋白质相比，111C在细胞溶质和细胞核级分中都增加。运输和细胞分级分离试验：将在烧瓶中生长的粘附HeLa细胞通过用5mL1XPBS+2mM EDTA在37℃搅拌孵育50min解粘附，并且转移至15mL圆锥形管。测量细胞的密度，并且将细胞以每管5x106个细胞分散至分开的管。用1X PBS+Ca2++Mg2+洗涤细胞三次以去除EDTA，并且将细胞小球再悬浮于0.7ml缓冲液A(20mM HEPES，pH 7.4；2mM MgCl2；DMEM中的3％BSA)中。将野生型(WT)或突变体(111C，333F)五邻体基质蛋白(450ug)添加至分开的细胞等份中，并且将混合物在4℃搅拌孵育2hrs，以促进受体结合，随后在37摄氏度搅拌孵育2h，以促进结合受体的蛋白质的内化。对照处理没有接收蛋白质(NP)。然后收集并且处理细胞，以用于使用Qproteome CellCompartment Kit(细胞区室试验试剂盒)(Qiagen)进行亚细胞分级分离；
图6表示根据本文的实施方式的PB突变体111C和333F，其与野生型PB相比显示出增强的向细胞核的进入。图6(A)表示细胞内运输和免疫细胞化学特征。按照Gene Therapy(基因疗法)(2006)13，821–836中详细确立的方案执行程序。以1:500的稀释度使用抗五邻体基质抗体(Ad5抗体)。以1:400的稀释度使用Alexa-Fluor 488山羊抗兔(二抗)。以1:100的稀释度使用鬼笔环肽，并且使用300nM的DAPI。绿色，野生型(WT)或突变体(111C、333F)PB；红色，肌动蛋白；蓝色，细胞核。图6(B)表示蛋白质运输的量化。选择左图表示的来自每次处理的十六个细胞用于量化。计数是基于AdobePhotoshop中每张图的柱状图。条表示绿色通道中80-255个窗口的绿色像素计数；
图7表示根据本文的实施方式的PB突变体更新的比对。新的肽长度基于由突变体克隆的核酸序列翻译的氨基酸序列。序列提供于本文图8-17中；
图8表示根据本文的实施方式的来自级分111克隆A(111A)的突变PB的核酸和肽序列；
图9表示根据本文的实施方式的来自级分111克隆C(111C)的突变PB的核酸和预测的氨基酸序列；
图10表示根据本文的实施方式的来自级分111克隆G(111G)的突变PB的核酸和肽序列；
图11表示根据本文的实施方式的来自级分331克隆E(331E)的突变PB的核酸和肽序列；
图12表示根据本文的实施方式的来自级分331克隆I(331I)的突变PB的核酸和肽序列；
图13表示根据本文的实施方式的来自级分331克隆J(331J)的突变PB的核酸和肽序列；
图14表示根据本文的实施方式的来自级分333克隆A(333A)的突变PB的核酸和肽序列；
图15表示根据本文的实施方式的来自级分333克隆D(333D)的突变PB的核酸和肽序列；
图16表示根据本文的实施方式的来自级分333克隆E(333E)的突变PB的核酸和肽序列；
图17表示根据本文的实施方式的来自级分333克隆F、G和H(333F、333G、333H)的突变PB的核酸和肽序列。
发明详述
本文所使用的缩写“PB”意思是五邻体基质。
已经开发了各种试剂用于将治疗性基因和药物递送至患病的细胞，包括脂质体、合成聚合物、肽、蛋白质、病毒和病毒纳米颗粒(Medina-Kauwe，2006；Medina Kauwe等，2005)。通常，由这些试剂形成的颗粒需要修饰以利于基因或药物载荷的递送。这种修饰包括附加靶向配体或抗体、膜渗透剂，和/或细胞内靶向(比如细胞核靶向)剂。这些修饰通常通过合理的设计引入，因此通过这种修饰产生的每个新的变体都需要实践检验。这将是耗费时间的和劳动密集的，并且存在产生未达最佳活性的风险。
过去和现在尝试改善细胞膜渗透性和/或细胞内运输的，是使用合理的设计将细胞渗透性或细胞内靶向肽缀合至药物载体。这种方法需要每个分子的实践检验。已经测试了用于增强的基因和药物递送的许多类型的细胞渗透肽，包括AntP、TAT、GALA、蜜蜂蜂毒肽和类似的肽(Medina-Kauwe，2006；Medina-Kauwe等，2005)。同样地，已经通过附加不同的聚碱性结构域比如SV40NLS、HMG-1、鱼精蛋白以及类似的肽或蛋白质，向基因递送试剂添加了细胞核靶向活性(Medina Kauwe，2006；Medina-Kauwe等，2005)。尽管这些肽中的每一种都具备渗透细胞膜或靶向至细胞内区室(包括细胞核)的能力，但是当与另一分子共价结合或表达为与另一分子融合的融合蛋白时，它们的活性改变。而且，对这些肽的每一个不同变体进行实践检验是耗费时间和劳动密集的。所以，尽管合理设计和实践检验是已有解决该问题的方案，但是该方法有其局限性。
本文所述的本发明通过使用选择压力来分离已经获得增强的细胞渗透、细胞内运输、和/或亚细胞靶向的蛋白质突变体，避免了细胞渗透/细胞内运输蛋白质/肽的合理设计和实践检验需要的时间和工作量。因为通过人工进化/选择压力获得的增强的特征，源自该方法的蛋白质突变体具有相对于亲本蛋白质或目前使用的现有基因/药物递送蛋白质的独特优势。最后，通过下述方法分离的特定蛋白质因为它们增强的膜裂解和运输特征，因而优于现有的细胞穿透肽。所以，该特定蛋白质可用于加强基因和药物递送，因此增强纳米医学中使用的颗粒的治疗效力。
本发明提供了一种生产靶向至细胞器的药物递送分子的方法。该方法包括下述步骤：(a)获得编码五邻体基质基因的多核苷酸，并产生多核苷酸的突变体；(b)将突变的多核苷酸克隆至噬菌体载体，并产生包括噬菌体载体的噬菌体文库；(c)用噬菌体文库转化细胞；(d)分级分离前述转化的细胞，并从转化的细胞收获细胞器；(e)扩增来自前述收获的细胞器的噬菌体；(f)用扩增后的来自前述收获的细胞器的噬菌体转化细胞；(g)重复步骤(d)、(e)、(f)和(g)；(h)滴定来自每轮的前述收获的细胞器的噬菌体；(i)选择具有最高滴度的噬菌体，并从噬菌体获得突变的多核苷酸的序列；以及(j)产生由前述序列编码的多肽，其中该多肽是靶向至细胞器的药物递送分子。
在一些实施方式中，细胞器选自由线粒体、高尔基体、内质网、细胞核、核糖体、质膜和胞质溶胶所组成的组。细胞可以是哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞。可使用任何随机诱变方法或靶向诱变方法产生突变体。可用于产生突变体的方法的例子包括但不限于下述任何一种或多种：基于PCR的方法、化学诱变、紫外线诱导的诱变或其组合。五邻体基质基因中的突变可以为***、缺失、替换的任何一种或多种或其组合。
在本发明的实施方式中，药物递送分子包括靶向结构域、核内体裂解配体结构域和带正电荷的结构域。
本发明还提供了用于将治疗剂递送至细胞器的载体，其包括由突变的五邻体基质基因编码的多肽。五邻体基质基因中的突变可通过下述分离：a)获得编码五邻体基质基因的多核苷酸，并产生多核苷酸的突变体；(b)将突变的多核苷酸克隆至噬菌体载体，并产生包括噬菌体载体的噬菌体文库；(c)用噬菌体文库转化细胞；(d)分级分离前述转化的细胞，并从转化的细胞收获细胞器；(e)扩增来自前述收获的细胞器的噬菌体；(f)用扩增后的来自前述收获的细胞器的噬菌体转化细胞；(g)重复步骤(d)、(e)、(f)和(g)；(h)滴定来自每轮的前述收获的细胞器的噬菌体；(i)选择具有最高滴度的噬菌体，并从获得噬菌体获得前述突变的多核苷酸的序列；以及(j)产生由前述序列编码的多肽，其中该多肽是靶向至细胞器的药物递送分子。该载体进一步包括聚赖氨酸模体和靶向结构域，例如调蛋白的靶向结构域。
本发明进一步提供一种治疗剂，其包括上述载体、以及治疗性药物。该治疗性药物可以是例如治疗、抑制、预防、缓解疾病的影响、减少疾病的严重程度、减少发展的可能性、减缓疾病的进展和/或治愈疾病的药物。由治疗剂靶向的疾病包括但不限于癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞瘤、胚细胞瘤、各种免疫细胞上表达的抗原、和与各种血液学疾病相关的细胞上表达的抗原、自身免疫性疾病、和/或炎性疾病。治疗剂可以是化学治疗剂。
本发明还提供一种产生不具有增殖活性的载体的方法。该方法包括(a)获得编码调蛋白(Her)受体结合结构域的多核苷酸，并产生多核苷酸的突变体；(b)将突变的Her多核苷酸克隆至噬菌体载体，并产生包括噬菌体载体的噬菌体文库；(c)在存在有丝***抑制剂(例如紫杉醇)的情况下，用噬菌体文库转化MDA-MB-435细胞；(d)分级分离前述转化的细胞，并提取MDA-MB-435细胞的膜级分；(e)从膜级分收获膜噬菌体；(f)在存在有丝***抑制剂的情况下，将膜噬菌体转化为MDA-MB-435细胞；(g)重复步骤(d)、(e)和(f)；(h)监测每轮的MDA-MB-435细胞增殖，并选择具有最低MDA-MB-435细胞增殖的膜噬菌体；(i)获得前述选择的膜噬菌体中Her多核苷酸突变体的序列；以及(j)产生由Her序列和五邻体基质基因编码的多肽，其中多肽是不具有增殖活性的载体。Her基因的突变可以是***、缺失、替换的任何一种或多种或其组合。
本发明进一步提供一种用于将治疗剂递送至细胞核的载体，其包括由突变的Her序列编码的多肽，其中根据前述方法获得突变的Her。载体进一步包括编码五邻体基质蛋白的多肽和聚赖氨酸模体。五邻体基质蛋白可以是突变的蛋白质。
实施例
实施例1
分离增强运输的突变体。
之前，开发了重组体腺病毒五邻体基质蛋白用于将各种治疗性分子体外和体内靶向和递送至肿瘤细胞(Agadjanian等，2012；Agadjanian等，2009；Agadjanian等，2006；Medina-Kauwe等，2001a；Medina-Kauwe等，2001b；Rentsendorj等，2008)。目前，五邻体基质重组体蛋白质(与包括HerPBK10‘PB’结构域的五邻体基质重组体蛋白质相同，用于将治疗剂靶向至HER2+肿瘤细胞；(Agadjanian等，2012；Agadjanian等，2009；Agadjanian等，2006；Medina Kauwe等，2001b；Rentsendorj等，2008)通过细胞结合之后的多细胞进入途径而行进，一些但不是所有的途径支持膜渗透和进入胞质溶胶(Rentsendorj等，2006)。为了改善该功能并且增强治疗剂进入细胞靶的递送和渗透，使用定向进化方法，通过使用细胞核积聚作为读出信息，分离具有增强的细胞渗透活性的五邻体基质变体，因为核内体逃逸使得能够进入细胞核(Rentsendorj等，2006)。
程序：该两步法涉及：1.通过随机诱变产生突变体文库，和2.引入选择压力，以分离具有增强功能的变体，这取决于筛选方法。这里，分离存活进入胞质溶胶和/或细胞核的噬菌体将起到选择压力的作用，其预期产生具有增强的细胞渗透活性的变体(总结于图1)。因此，本发明人已经随机诱变了五邻体基质基因并且产生克隆至K.T7噬菌体载体的突变体文库。基于之前确立的定向进化研究(Cherry等，1999；Shafikhani等，1997；Wan等，1998；You和Arnold，1996)，发明人瞄准每个基因1-4个氨基酸改变(或2-7核苷酸改变)的突变频率。基于使用特定易错聚合酶链式反应(PCR)方法(GeneMorphIIRandom Mutagenesis Kit(随机诱变试剂盒)；Stratagene，La Jolla，CA，USA)的产物产量，本发明人实现了每个五邻体基质基因约8核苷/kb或13.6核苷的估计突变频率(图2)。本发明人将该产物***T7-选择噬菌体载体和包装的重组体噬菌体，以生产扩增的文库滴度为5x1010pfu/mL。
在HeLa细胞(其表达用于结合和摄入PB蛋白的整联蛋白受体)上淘选文库。在细胞上在4℃孵育噬菌体1h，以促进受体结合但非摄入，然后冲洗细胞并且在37℃孵育2h，以促进内化。摄入之后，收获的细胞进行分级分离，以分离细胞溶质和细胞核级分。然后，从每个级分扩增的噬菌体进行重复的生物淘选，并且从细胞收获物提取相应的连续级分(即扩增从第1轮分离的细胞核噬菌体并且再添加回细胞，随后重复分离细胞核级分，以再获得细胞核噬菌体)。在两轮或三轮的生物淘选之后，滴定从每次重复的级分分离的噬菌体，以测定与展示野生型五邻体基质的噬菌体相比，来自诱变文库的细胞核/细胞溶质噬菌体的相对富集。
结果：非诱变的亲本噬菌体T7-PB，产生的细胞核/细胞溶质噬菌体滴度比小于1，显示出在2h内到达细胞核的噬菌体的比例小于保留在细胞质中噬菌体的比例(图3)。相反，2轮的生物淘选和分离细胞核噬菌体之后(3-3a)，与细胞质保留相比，观察到朝向更高的细胞核积聚变化，与T7-PB相比具有显著的增加(P＝0.05)(图3)。即使从第3轮的细胞溶质级分淘选分离的噬菌体(1-1-1)显示与T7-PB相比，虽然不是非常显著(P＝0.07)，但是相对增加的细胞核分配(图3)。
在三轮的生物淘选和分离细胞溶质和细胞核突变体之后，本发明人对从每个富集群体随机挑取的克隆进行测序并且发现从细胞溶质和细胞核级分分离的大部分的克隆编码羧基-[C-]端截短蛋白质(图4)。位于野生型五邻体基质(wt PB)线性序列中部的287LDV和340RGD整联蛋白结合模体未保留在大部分的截短克隆中。截短突变体之一包含LDV，但没有RGD模体，而剩余的截短缺少LDV和RGD模体。通过生物淘选分离的全长克隆保留了LDV和RGD模体，但是也包含了引入潜在的改变功能的氨基酸变化的几个点突变(图4)。这些之中有细胞溶质级分克隆111C中的Leu60Trp替换；和细胞核级分克隆333F中Lys375Glu、Val449Met和Pro469Ser氨基酸改变。为了检测每个分离的变体对赋予增强的细胞溶质和/或细胞核渗透的能力，通过免疫荧光和共焦显微术，将每一个的细胞内运输与亲本蛋白质比较，并且通过亚细胞分级分离来确认。具体而言，因为全长突变体(111C和333F)和突变体331J保留整联蛋白结合模体，测试这些变体以与wt PB比较，因为预测它们经整联蛋白结合和摄入进入细胞。同时，因为保留的截短变体缺少任何受体-结合模体，这些将***HerPBK10以替换PB结构域，并且进行测试并与经人表皮生长因子受体(HER)结合和摄入进入细胞的亲本HerPBK10比较。
实施例2
信号传导减弱的受体-结合和内吞作用突变体的分离。
基本原理：肿瘤-靶向的细胞渗透蛋白质HerPBK10，通过包括调蛋白的受体结合结构域(这里命名为HerPBK10的‘Her’结构域)被特异性引导至人表皮生长因子受体(HER)(Medina-Kauwe等，2001b)。但是，调蛋白受体的连接可诱导信号传导，该信号传导可导致肿瘤细胞增殖、分化，并且在一些情况下导致细胞凋亡，这取决于几个因素，包括受体异源二聚物比例、配体亚型、细胞类型，和某些细胞内分子的存在(Aguilar等，1999；Lewis等，1996；Weinstein等，1998)。由于可能诱导不良作用(比如肿瘤进展)，因此检测有丝***抑制剂引入的选择压力是否可选择缺少增殖信号传导的受体结合和内吞作用突变体。本发明人提出如下进行测试，其产生展示Her变体的噬菌体文库，并且通过从静息细胞分离内化的噬菌体并且筛选文库从而使缺少增殖信号传导的Her种类内化，并且在非增殖性人乳腺癌细胞上再淘选。
程序：通过易错PCR和交错延伸，产生包含遍及编码序列分布的不同突变的Her序列的文库，在初始启动模板序列之后必须重复变性和简单退火/延伸的循环(Zhao等，1998)。所得文库***适当的载体臂，用于转染至T7选择(T7Select)噬菌体(其开发为展示全蛋白质)，并且按照制造商的说明产生重组体噬菌体(Novagen，Gibbstown，NJ，USA)。基于进化的AAV衣壳的生物淘选，将初始滴度为10^12的噬菌体添加至在培养基中培养的MDA-MB-435细胞，该培养基包含有丝***抑制剂比如紫杉醇，并且在约30-45min之后(结合和内化需要的时间；Medina-Kauwe等，2000)，通过胰蛋白酶/EDTA(去除非内化的噬菌体)收获细胞，并且进行膜提取，以分离粗病毒的小泡(vesicle)级分(Qproteome Plasma Membrane Protein Kit(质膜蛋白质试剂盒)，Qiagen Inc.,Valencia,CA,USA)，其然后可通过CsCl显带分离。进行三至四轮的选择(即添加分离的病毒至新鲜的细胞和重复膜提取)并且以下述方式表征分离的病毒。第一，将接收浓缩病毒的新鲜细胞固定并且处理用于使用抗噬菌体抗体的免疫荧光(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，以确认分离的噬菌体仍内化。通过代谢试验，与模拟品和未处理细胞比较，评估平行处理的分开的细胞的增殖速率。第二，将来自分离噬菌体的Her序列切下并且***细菌表达载体，用于重组体蛋白质的产生(Medina-Kauwe等，2001a)，然后与亲本Her以及模拟品和未处理的细胞比较，如之前描述的那样测试在MDA-MB-435人乳腺癌细胞中突变体Her的内化和增殖活性。对突变体克隆测序，以识别突变的区域，并且再***HerPBK10表达盒，替换亲本‘Her’。
上述各种方法和技术提供了许多实施本申请的方式。当然，应当理解，根据本文所述的任何具体实施方式没有必要实现所描述的所有目标或优势。因此，例如，本领域技术人员将认识到，实施本方法的方式可以是实现或优化如本文教导的一个优点或一组优点而不必实现本文教导或提出的其他目标或优点。本文提到了各种可选方式。应当理解，一些优选的实施方式具体包括一个、另一个或几个特征，而其他的实施方式具体地不包括一个、另一个或几个特征，而另外其他的实施方式通过包括一个、另一个或几个有利的特征而减少特定的特征。
此外，技术人员认识到不同实施方式中各种特征的适用性。类似地，上面讨论的各种要素、特征和步骤，以及每种要素、特征或步骤的其他已知的等价形式可被本领域技术人员以各种组合使用，以根据本文所述的原理实施本方法。各种要素、特征和步骤中的一些要素、特征和步骤被包括在各种实施方式中，而一些将被不同的实施方式排除在外。
尽管在某些实施方式和实施例的背景下已经公开了本申请，但是，本领域技术人员理解，本申请的实施方式不限于具体公开的实施方式，而是扩展至其他可选的实施方式和/或用途和其变更和等价形式。
在一些实施方式中，在描述本申请具体实施方式的上下文中(尤其在某些所附权利要求的上下文中)使用的术语“一个(a、an)”和“所述(the)”以及类似的指代可解释为覆盖单数和复数。本文数值范围的叙述仅仅旨在用作单独提及落在该范围内各个分开值的速记方法。除非本文另外指出，每个个体值并入说明书，如同其在本文中单独叙述。本文所述的所有方法可以任何适当的顺序进行，除非本文另外指出或以其他方式明显与上下文相抵触。就本文某些实施方式提供的任何和所有实施例、或示例性语言(例如，“比如”)的使用仅仅旨在更好阐释本申请并且不限制另外要求保护的申请的范围。本说明书中的语言不应解释为限定权利要求未记载的任何对实施本申请必要的要素。
本文描述了本申请优选的实施方式，包括本发明人所知的实施本申请的最佳方式。当阅读前述说明书时，那些优选实施方式的变型对本领域技术人员显而易见。可认为技术人员能够适当采用这些变型，并且本申请可以以本文具体描述之外的其他方式实施。因此，本申请的许多实施方式包括本文所附权利要求叙述的主题的所有改变和等价形式，这被适当的法律允许。而且，在其所有可能变型中上述要素的任何组合包括在本申请中，除非本文另外指出或以其他方式明显与上下文相抵触。
本文引用的所有专利、专利申请、专利申请的公开，和其他材料比如文章、书籍、说明书、出版物、文档、物品和/或类似材料，通过该引用以它们的整体形式为了所有的目的而在这里并入本文中，但是与其相关的起诉历史文件、任何与本文档不一致或冲突的地方，或任何可能限制与本文档限制或稍后的权利要求书最宽的范围的地方除外。作为例子，如果任何并入的材料以及本文档中对于术语的描述、定义和/或使用存在任何不一致或冲突，以本文档中术语的描述、定义和/或使用为准。
总之，应当理解，本文公开申请的实施方式是本申请实施方式原理的例子。可采用的其他改变方式可在本申请的范围内。因此，作为例子，但不是限制性的，可根据本文的教导使用本申请实施方式的可选方式。因此，本申请的实施方式不限于准确显示和描述的那些。

Claims (24)

1.一种增强运输至细胞的方法，包括：
提供组合物，所述组合物包括具有增强进入至细胞的一个或多个突变的五邻体基质(PB)蛋白；以及
将有效剂量的所述组合物施用至所述细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个突变是111C和/或333F。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物靶向至所述细胞的细胞质和/或细胞核。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物进一步包括治疗性药物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个突变是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和/或SEQ ID NO：20。
7.一种生产靶向至细胞器的药物递送分子的方法，其包括：
a.获得编码五邻体基质(PB)基因的多核苷酸，并产生所述多核苷酸的突变体；
b.将突变的多核苷酸克隆至噬菌体载体，并产生包括所述噬菌体载体的噬菌体文库；
c.用所述噬菌体文库转化细胞；
d.分级分离所述转化的细胞，并从所述转化的细胞收获细胞器；
e.扩增来自所述收获的细胞器的噬菌体；
f.用扩增后的来自所述收获的细胞器的噬菌体转化细胞；
g.重复步骤(d)、(e)、(f)和(g)；
h.滴定来自每轮的所述收获的细胞器的所述噬菌体；
i.选择具有最高滴度的噬菌体，并从所述噬菌体获得所述突变的多核苷酸的序列；以及
j.产生由所述序列编码的多肽，
其中，所述多肽是所述靶向至细胞器的药物递送分子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞器选自由线粒体、高尔基体、内质网、细胞核、核糖体、质膜和胞质溶胶所组成的组。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞。
10.根据权利要求7所述的方法，其中使用下述的任何一种或多种产生突变体：基于PCR的方法、化学诱变、紫外线诱导的诱变或其组合。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述药物递送分子包括靶向结构域、核内体裂解配体结构域和带正电荷的结构域。
12.一种用于将治疗剂递送至细胞器的载体，其包括由增强进入至细胞的一个或多个五邻体基质(PB)突变编码的多肽。
13.根据权利要求12所述的载体，其中所述一个或多个五邻体基质(PB)突变包括111C和/或333F。
14.根据权利要求12所述的载体，进一步包括聚赖氨酸模体。
15.根据权利要求12所述的载体，进一步包括调蛋白的靶向结构域。
16.根据权利要求12所述的载体，其中所述一个或多个五邻体基质突变包括C-末端缺失。
17.一种治疗剂，其包括权利要求12所述的载体、以及治疗性药物。
18.根据权利要求17所述的治疗剂，其中所述治疗性药物是化学治疗剂。
19.一种生产不具有增殖活性的载体的方法，包括：
(a)获得编码调蛋白(Her)受体结合结构域的多核苷酸，并在所述多核苷酸中产生突变体；
(b)将突变的Her多核苷酸克隆至噬菌体载体，并产生包括所述噬菌体载体的噬菌体文库；
(c)在存在有丝***抑制剂的情况下，用所述噬菌体文库转化MDA-MB-435细胞；
(d)分级分离所述转化的细胞，并提取所述MDA-MB-435细胞的膜级分；
(e)从所述膜级分收获膜噬菌体；
(f)在存在有丝***抑制剂的情况下，将所述膜噬菌体转化为MDA-MB-435细胞；
(g)重复步骤(d)、(e)和(f)；
(h)监测每轮的MDA-MB-435细胞增殖，并选择具有最低MDA-MB-435细胞增殖的所述膜噬菌体；
(i)在所选择的膜噬菌体中获得所述Her多核苷酸的突变体的序列；以及
(j)产生由Her序列和五邻体基质基因编码的多肽，其中所述多肽是所述不具有增殖活性的载体。
20.一种用于将治疗剂递送至细胞核的载体，其包括由权利要求19所述的突变Her序列编码的多肽。
21.根据权利要求20所述的载体，进一步包括编码五邻体基质(PB)蛋白的多肽，以及聚赖氨酸模体。
22.根据权利要求20所述的载体，其中所述五邻体基质蛋白是突变的五邻体基质蛋白。
23.一种治疗剂，其包括权利要求19所述的载体、以及治疗性药物。
24.根据权利要求23所述的治疗剂，其中所述治疗性药物是化学治疗剂。
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