CN104611318A - 一种调控核酸酶序列选择性的酶复合物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控核酸酶序列选择性的酶复合物及方法，建立了一种全新的化学调控手段，使原本没有序列特异性的核酸酶(DNase和RNase)获得序列选择性，并可以根据所需切割序列的需要灵活调控酶的序列选择性。从而为分子生物学研究、药物研制和基因工程技术开发等提供了强有力的新工具。

Description

一种调控核酸酶序列选择性的酶复合物及方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及对酶的性质进行人工调控的领域，具体涉及一种调控核酸酶序列选择性的酶复合物及方法。

背景技术

人工调控酶的底物选择性及催化活性在生命科学研究和生物工程应用方面都具有重要的意义。一方面，酶作为天然的生物催化剂，其催化性能强大，尤其是在催化大分子反应上，目前人工合成的催化剂种类还非常少，酶有着不可替代的广泛应用。另一方面，酶的制备周期长，产量小，现有酶的种类有限，还远远不能满足实际应用的需求。因此，对现有的酶进行改造，从而获得新的性质，可以极大地拓宽酶的应用范围，为相关研究和应用提供有力的技术手段。目前最常用的人工调控酶性质的方法主要是通过分子生物学的手段改变酶的氨基酸序列，而对酶进行后修饰的方法少有报道。

核酸酶(nuclease)是以核酸为底物、催化磷酸二酯键水解的一类酶。核酸酶包含脱氧核糖核酸酶(DNase)及核糖核酸酶(RNase)。核酸酶的序列选择性在基因工程中有着重要的应用，特定地切割某种序列的DNA或者RNA，能够帮助人们更方便灵活地剪切、拼装或去除特定的DNA或者RNA片段，实现多种应用。限制性内切酶是目前应用最为广泛的序列选择性切割酶，它们能够识别特定序列进行切割，是实验室研究和基因工程中重要的工具酶。但是已经发现的限制性内切酶只有300多种，每种限制性内切酶只能识别特定的一种序列，因此能够识别和选择性切割的序列也只有300多种。许多研究小组一直致力于通过突变氨基酸(Bloom,J.et al.Evolving strategies for enzyme engineering.Current Opinion in Structural Biology,2005,15,447-452)或者蛋白融合技术(Koide,S.Generation of new protein functions by nonhomologous combinations and rearrangements of domains and modules.2009，Curr Opin Biotech 20,398-404)来人工改造已有的限制性内切酶，希望获得新的识别序列。但这些方法的工作量大，而且不具备通用性。因此需要开发更简单有效的调控手段，使核酸酶获得更加丰富多样的序列选择性，从而在实际应用中，能够针对不同的目标切割序列，实现相应的选择性调 控。

发明内容

本发明的目的是提供一种调控核酸酶序列选择性的酶复合物及方法，建立一种全新的化学调控手段，使原本没有序列特异性的核酸酶(DNase和RNase)获得序列选择性，并可以根据所需切割序列(以下均称为“目标序列”)的需要灵活调控酶的序列选择性。

在建立本发明的过程中，申请人发现了一个重要的现象：

如图1所示，将一条磷酸骨架全硫代的DNA单链(用S-DNA表示)与DNase I按照一定的比例混合，在37℃下反应1h，超滤纯化后得到的DNase IS-DNA只能切割该S-DNA的互补链，而几乎不再切割其他序列无关的单链DNA、双链DNA及发夹型结构的DNA。这种由广谱序列切割活性到只对特定序列切割的性质变化，显示出S-DNA对DNase I的模板诱导作用，即S-DNA与DNase I形成了稳定的复合物，在结构上抑制了DNase I对无关目标链的切割，而只对该S-DNA模板链的互补链表现出较强的切割活性。实验还发现，DNase I与S-DNA链的结合作用非常稳定，室温放置一天后，DNase IS-DNA仍旧表现出序列选择性。

为了对照，申请人使用未经过任何处理的正常DNase I作用于上述的无关DNA链和S-DNA的互补链，发现对两种链均表现出较强的切割活性。申请人进一步将该方法应用到RNase A上，将RNase A与全硫代RNA链(S-RNA)按一定比例混合在37℃下温育反应一个小时后，超滤除去多余的S-RNA，获得的RNase AS-RNA复合物对S-RNA的互补链仍旧具有很高的切割活性，但对其他无关RNA链的切割活性受到很大的抑制，表明与RNase A结合的S-RNA也具有模板诱导作用。

申请人的重要发现可总结为：全硫代DNA单链在一定条件下会与DNase I形成紧密结合的DNase IS-DNA复合物，抑制DNase I切割其他DNA链的活性，但被抑制的DNase I在遇到该全硫代链的互补DNA链时，活性可以重启，快速切割该链。此方法也适用于RNase A，结合全硫代RNA链形成的RNase AS-RNA不再切割其他无关RNA序列，而只对该S-RNA链的互补链表现出切割活性。上述分别与DNase I和RNase A相结合的全硫代DNA单链和全硫代 RNA链以下均称为全硫代模板链。

根据上述重要发现，本发明提供一种调控核酸酶(DNase I/RNase A)序列选择性的酶复合物，所述酶复合物为核酸酶与全硫代模板链的复合物，可用于选择性切割与该全硫代模板链互补的目标序列。所述核酸酶与所述全硫代模板链的摩尔比为1：1～1：10。

进一步地，所述全硫代模板链的长度在15-50个核苷酸之间。

进一步地，所述核酸酶与所述全硫代模板链之间为非共价或共价连接。

进一步地，所述目标序列与全硫代模板链互补的碱基数目在15-30个之间，目标序列的总长度不限。

一种调控核酸酶序列选择性的方法，包括如下步骤：

1)设计合成与目标序列互补的全硫代模板链。

2)将核酸酶与全硫代模板链在pH7.0-8.0的缓冲溶液中混合反应，在37℃下温育1小时。

3)采用截止分子量在20-40kD之间的超滤膜超滤除去上述反应体系中游离的全硫代链，获得核酸酶全硫代链复合物。

4)利用核酸酶全硫代链复合物切割目标序列。

本发明中使用的全硫代模板链的序列通过化学法合成直接获得。其中全硫代的目的是防止该模板链被核酸酶水解。全硫代序列不宜过长，可以比待切割目标序列短。为了能够在超滤过程中有效除去游离的全硫代链，保留核酸酶与全硫代链的复合物，全硫代链长度控制在50个核苷酸以下较为合适。核酸酶的用量为10μg量级。

核酸酶与全硫代模板链的反应条件为：核酸酶浓度0.1mg/mL，全硫代链的浓度15-30μM(优选29μM)，核酸酶与全硫代链的摩尔比为1：1～1：10。反应温度为29-37℃(优选37℃)，反应时间45min-1h(优选1h)。反应溶液为中性缓冲溶液(pH范围：7.0-8.0，优选0.05M磷酸盐缓冲液，含0.15M氯化钠，pH 7.2)。在上述条件下，DNase I与全硫代DNA单链及RNase A与全硫代RNA链均可形成非共价稳定结合物，即DNase IS-DNA复合物和RNase AS-RNA。

在此基础上，也可以进一步将核酸酶与全硫代模板链进行共价连接，使核酸酶与全硫代模板链的结合更为牢固。可以使用的共价反应类型有：在全硫代模板 链的末端修饰-SH，利用SPDP(中文名：3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)或者SMCC(中文名：琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯)催化该-SH与蛋白上氨基的反应；或在全硫代模板链末端修饰-COOH，利用EDC/NHS(中文名：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺)催化-COOH与蛋白上氨基的反应等等。非共价连接或共价连接均可获得稳定、具有序列选择性的核酸酶全硫代链复合物，相比而言，非共价连接方法更加简单易行。

本发明的有益效果在于：我们发展了一种简单易行的使核酸酶获得序列选择性的方法。通过用不同的全硫代模板链与酶形成复合物，可以选择性地切割不同的目标序列，为分子生物学研究、药物研制和基因工程技术开发等提供了强有力的新工具。

附图说明

图1是全硫代DNA单链(S-DNA)调控脱氧核糖核酸酶酶I(DNase I)序列选择性的原理图。

图2(a)是实施例1使用S-DNA与DNase I非共价结合后，生成的DNase IS-DNA切割荧光标记的目标DNA链和无关DNA链的实时荧光曲线图。

图2(b)是实施例1中DNase IS-DNA切割无标记的目标DNA链和无关DNA链后，对产物进行凝胶电泳的成像图。

图3(a)是实施例2中使用RNase AS-RNA切割目标RNA链后，对产物

进行凝胶电泳的成像图。

图3(b)是实施例2中使用RNase AS-RNA切割无关RNA链后，对产物进行凝胶电泳的成像图。

图4是实施例3中使用S-DNA与DNase I共价结合后，生成的DNase IS-DNA共价复合物切割荧光标记的目标DNA链和切割无关DNA链的速率比(图中编号2)与实施例2中获得的非共价复合物切割荧光标记的目标DNA链和切割无关DNA链的速率比(图中编号1)的对照图。

具体实施方式

下面结合附图，通过具体实施例进一步阐述本发明。本领域的技术人员应当 理解这些实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围。

实施例1<调控DNase I的序列选择性>

在该实施例中，目标DNA链序列为： 

5'-TAT CTG CAC TAG ATG CAC CTT-3'；

无关DNA链序列为： 

5'-CGGAAGACAGATGCUAAGTGCTTGACCTTCCG-3'；

合成的目标DNA序列的全硫代DNA模板链(S-DNA)的序列为： 

5'-AAAAAAAAAAAGGTGCATCTAGTGCAGATA-3'；

上述S-DNA与DNase I结合形成DNase IS-DNA及序列选择性测定的原理参见图1。

在本发明中，为了有效指示DNase I/RNase A对拟切割目标DNA/RNA序列和其他无关序列的切割情况，申请人使用了两种方法：

1)荧光探针指示法。如图1中所示，拟切割目标序列和无关序列均标记了荧光基团和猝灭基团，两种基团之间可发生高效率的FRET。常见的包括FAM与TAMRA；FAM与BHQ1；TET与BHQ2；Cy3与Cy5等等。当以上双标记序列保持完整时，荧光基团受激后发出的荧光被猝灭基团吸收，从而检测不到荧光。而当这些序列被DNase I/RNase A切割后，猝灭基团远离荧光基团，溶液产生的荧光能够被检测到，从而有效地指示所加入序列是否被与全硫代链结合的DNase I/RNase A切割以及切割反应的快慢和进行程度。

2)琼脂糖凝胶电泳法。将与全硫代链结合的DNase IS-DNA复合物或者RNase AS-RNA复合物与无标记的目标序列和无关序列反应后，取出少量产物溶液(9μL)溶液进行琼脂糖凝胶电泳实验。

具体实施步骤如下：

1)将1μL 5mg/mL的DNase I与1.45nmol全硫代DNA单链混合于50μL缓冲液中，缓冲液组成为：50mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH 7.2.将溶液置于37℃下温育1小时。

2)使用截止分子量为30kD，处理体积为500μL的超滤管超滤1)中得到的溶液。超滤所用缓冲液同1)中使用的缓冲液。第一次超滤所用转速为5000g，超滤时间15min。第二次超滤转速为3000g，时间为15min。

3)取3μL 2)中得到的DNase IS-DNA与1μL 50μM的目标DNA链或无关DNA链混合后，立刻放入实时荧光PCR仪(Rotor gene 6500)中测定荧光值。

荧光标记的目标DNA链序列为： 

5'FAM-TAT CTG CAC TAG ATG CAC CTT-3'BHQ-1 

荧光标记的无关DNA链序列为： 

5'FAM-CGGAAGACAGATGCUAAGTGCTTGACCTTCCG-3'Dabcyl。

4)利用2.5％琼脂糖凝胶电泳实验进一步证明3)中所得到的DNase I具备序列选择性。

实验结果： 

如图2(a)所示，DNase IS-DNA能够较为快速地切割目标DNA序列，无法切割无关DNA序列。普通的未经处理的DNase I既能快速切割目标DNA序列，又能快速切割无关DNA序列。

设计六组2.5％琼脂糖凝胶电泳实验，其中泳道1-3对应目标序列的检测结果，因目标序列为单链DNA，用Gelsafe核酸染料进行染色后观察。为增强荧光染料染色效果，三份反应产物溶液中均加入目标序列的互补链使之杂交成双链。泳道4-6对应无关序列的检测结果，由于无关序列自身为含6个互补碱基的发夹型结构，容易被染色，因此无需另外加入互补链：

泳道1：普通DNase I切割目标DNA序列。

泳道2：DNase IS-DNA复合物切割目标DNA序列。

泳道3：目标DNA序列。

由泳道3可见目标DNA序列本身与互补链杂交后的条带及多余互补链的条带。泳道1和2显示，普通DNase I和DNase IS-DNA复合物均可有效切割目标序列，目标序列与互补链杂交的条带已经几乎消失，而泳道中只能看到加入的互补链的条带。

泳道4：普通DNase I切割无关DNA序列。

泳道5：DNase IS-DNA复合物切割无关DNA序列。

泳道6：无关DNA序列。

由泳道4可见，无关DNA序列被普通DNase切割后条带已消失，而泳道5 显示DNase IS-DNA复合物几乎不切割无关DNA序列，其所对应的条带几乎没有变化。

实施例2<调控RNase A的序列选择性>

在该实施例中，

目标RNA链序列为：5'-UAUCUGCACUAGAUGCACCUU-3'；

无关RNA链序列为：5'-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'；

合成的全硫代RNA序列为：

5'-AUACAGCUAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUA-3'。

具体实施步骤如下：

1)将1μL 2mg/mL的RNase A与1.60nmol全硫代RNA链混合于50μL缓冲液中，缓冲液组成为：50mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH 7.2.将溶液置于37℃下温育1小时。

2)使用截止分子量为30kD，处理体积为500μL的超滤管超滤1)中得到的溶液。超滤所用缓冲液同1)中使用的缓冲液。第一次超滤所用转速为5000g，超滤时间15min。第二次超滤转速为3000g，时间为15min。

3)取2)中得到的RNase A 3μL与1μL 50μM的目标RNA链或无关RNA链混合后，立刻放入实时荧光PCR仪(Rotor gene 6500)中测定荧光值。

荧光标记的目标RNA链序列为： 

5'FAM-UAUCUGCACUAGAUGCACCUU-3'BHQ-1；

荧光标记的无关RNA链序列为： 

5'-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'。

4)利用2.5％琼脂糖凝胶电泳实验进一步证明3)中所得到的RNase A具备序列选择性。

设计六组2.5％琼脂糖凝胶电泳实验：

图3(a)中：所用RNA目标链标记了荧光基团和猝灭基团，因此采用535nm绿色荧光检测通道：

泳道1：RNase AS-RNA复合物切割目标RNA序列。

泳道2：普通RNase A切割目标RNA序列。

泳道3：目标RNA序列。图3(b)中：所用无关RNA序列未进行荧光标记，

用Gelsafe核酸染料染色后采用590nm荧光检测通道：

泳道1：无关RNA序列。

泳道2：RNase AS-RNA复合物切割无关RNA序列。

泳道3：普通RNase A切割无关RNA序列。

实验结果： 

如图3(a)所示：泳道3显示完整的目标RNA序列中FAM与BHQ-1构成FRET，荧光呈猝灭状态，因此看不到目标序列的条带；泳道1和泳道2显示目标RNA序列被相应的酶切割，释放出强烈荧光。

如图3(b)所示：泳道1显示无关RNA序列的条带位置；泳道2显示无关RNA序列不能被RNase AS-RNA复合物切割；泳道3显示普通RNase A可以切割无关RNA序列。

实施例3

申请人曾使用SPDP法在DNase I与S-DNA结合后进行共价偶联反应，反应步骤如下：

1.利用0.05M磷酸钠缓冲液(含0.15M氯化钠，pH 7.2)配制浓度为10mg/mL的DNase I溶液。在1mL该DNase I溶液中，加入25μL浓度为6.2mg/mL的溶于DMSO中SPDP溶液，室温下放置过夜。

2.超滤除去多余的SPDP，超滤所用的缓冲液组成为：0.05M磷酸钠，0.15M氯化钠，0.01M EDTA，pH 7.2。

3.将末端标记了-SH的S-DNA与步骤2中得到的DNase I溶液按摩尔比1：1的比例混合，室温下放置过夜。

6.超滤除去游离的DNase I和S-DNA。

由上述步骤制得的DNase IS-DNA共价复合物也表现出对S-DNA互补链的特异性切割。图4对比了DNase IS-DNA共价复合物切割荧光标记的目标DNA链和切割无关DNA链的速率比(图中编号2)与实施例2中获得的DNase IS-DNA非共价复合物切割荧光标记的目标DNA链和切割无关DNA链的速率比(图中编号1)，可见二者选择性切割目标序列的能力基本一致。

Claims (10)

1.一种调控核酸酶序列选择性的酶复合物，所述酶复合物为核酸酶与全硫代模板链的复合物，用于选择性切割与该全硫代模板链互补的目标序列，所述核酸酶与所述全硫代模板链的摩尔比为1：1～1：10。

2.如权利要求1所述的调控核酸酶序列选择性的酶复合物，其特征在于，所述全硫代模板链的长度在15-50个核苷酸之间。

3.如权利要求1所述的调控核酸酶序列选择性的酶复合物，其特征在于，所述核酸酶与所述全硫代模板链之间为非共价或共价连接。

4.如权利要求1所述的调控核酸酶序列选择性的酶复合物，其特征在于，所述目标序列与全硫代模板链互补的碱基数目在15-30个之间。

5.一种调控核酸酶序列选择性的方法，包括如下步骤：

1)设计合成与目标序列互补的全硫代模板链；

2)将核酸酶与全硫代模板链在pH7.0-8.0的缓冲溶液中混合反应，在37℃下温育1小时；

3)采用截止分子量在20-40kD之间的超滤膜超滤除去上述反应体系中游离的全硫代链，获得核酸酶全硫代链复合物；

4)利用核酸酶全硫代链复合物切割目标序列。

6.如权利要求5所述调控核酸酶序列选择性的方法，其特征在于，所述全硫代链长度在50个核苷酸以下。

7.如权利要求5所述调控核酸酶序列选择性的方法，其特征在于，所述核酸酶的用量为10μg量级。

8.如权利要求5所述调控核酸酶序列选择性的方法，其特征在于，所述核酸酶与全硫代模板链的反应条件为：核酸酶浓度0.1mg/mL，全硫代链的浓度15-30μM，核酸酶与全硫代链的摩尔比为1：1～1：10，反应温度为29-37℃，反应时间45min-1h。

9.如权利要求5所述调控核酸酶序列选择性的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为含0.15M氯化钠，pH 7.2的0.05M磷酸盐缓冲液。

10.如权利要求5所述调控核酸酶序列选择性的方法，其特征在于，所述核酸酶与全硫代模板链为非共价连接或共价连接。