CN104611294A - 一种视皮层神经元体外培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于视皮层神经元突触可塑性研究的神经元体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：1)取胎鼠大脑组织进行预处理，分离视皮层组织并进行蛋白酶消化，离心；2)加入接种培养基终止消化；3)吹打成单细胞悬液后过筛并计数；4)以2.5x10⁴-5x10⁴个/cm²的密度用接种培养基进行接种，进行全换液方式的贴壁培养；细胞贴壁后，进行半换液方式的后续培养。本发明还提供了所述神经元体外培养方法培养的大鼠视皮层神经元细胞系及其在视皮层神经元突触可塑性研究方面的用途。本培养方法高效简单，神经元纯度高、状态好，具有神经元突触可塑性的结构基础，能够反映神经元突触可塑性的功能状态，可用于大鼠视皮层突触可塑性的研究。

Description

一种视皮层神经元体外培养方法

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，具体涉及一种视皮层神经元体外培养方法。

背景技术

初级视皮层(brodmman17区)，位于大脑半球枕后部靠近小脑区域，是视觉高级中枢的重要组成部分。出生后人类和哺乳动物的视觉神经***能依据视觉环境改变其原有神经联系和突触结构,这一改变发生的最敏感时期被称为视皮层可塑性关键期，在人类此时期为出生后2-10岁，大鼠为出生后2-6周。期间异常的视觉经验将会引起视力下降，但眼部无器质性病变，即眼科临床常见的弱视。其病变部位主要在视皮层，与视皮层可塑性关系密切。视皮层可塑性关键期内，给予有效的视觉刺激，弱视可以治愈；关键期终止后，视皮层可塑性被抑制，此时异常的视觉环境将不再引起弱视，但已形成的弱视亦难以恢复，这也是10岁以上儿童及成年人弱视难以治愈的原因。为揭示弱视的发病机制和寻找成年弱视治疗途径，视皮层可塑性及其关键期的终止机制成为了目前研究的切入点。

目前对视皮层可塑性的研究多建立在动物活体和脑片水平上，常局限在神经环路上，难以深入研究神经元本身，而鉴于视皮层可塑性在神经元层面上表现为神经元的突触可塑性，因此对视皮层突触可塑性的研究成为了深入研究视皮层可塑性的切入点。同时因急性分离的神经元丧失完整的突起分枝，表面受体被部分破坏或丢失，胞间无法形成联系，不利于突触可塑性的研究，所以目前突触可塑性的研究主要建立在神经元细胞的培养水平上。基于此，建立一个适用于视皮层神经元突触可塑性研究的神经元培养体系对深入研究视皮层可塑性是非常必要的，同时该体系在眼科病理及药物反应和弱视发病、治疗机制等研究领域亦可发挥作用。而这样的培养体系在国内尚未见报道，国外类似研究体系多建立在海马上，尚未见报道建立用于视皮层神经元突触可塑性研究的神经元体外培养体系。

同时，目前对视皮层可塑性关键期终止机制的研究认为，GABA能抑制性中间神经元的成熟和神经元周围网络(Perineuronal nets，PNs)的表达增多对视皮层可塑性关键期终止有明显促进作用：关键期后期，神经元周围网络PNs表达增多且由可溶复合物转变为不可溶复合物，固化神经元突触结构，并包绕在GABA神经元周围促进其成熟；GABA神经元成熟后进一步抑制突触可塑性，和PNs共同参与可塑性关键期的终止。

LE大鼠，全名为long evans大鼠，因其眼部结构和人类较似，常被作为大鼠眼科实验研究对象，因此本实验采用LE大鼠为研究对象。培养发现，与出生后1-3d新生鼠相比，采用胎鼠获得的神经元纯度高，杂细胞少，胶质细胞***能力低；采用孕19-21d的胎鼠，其胶质细胞***能力较强，小于孕14d的胎鼠，其大脑视皮层区域生长尚未成熟，定位较困难，且神经元较为脆弱，培养后期易凋亡。实验发现，孕17-18d胎鼠培养的视皮层神经元纯度较高(80-90％)，活性较好，存活率高且存活时间长。

发明内容

本发明运用B27搭配无血清培养基培养视皮层神经元，并对神经元的纯度、生长状态进行鉴定，同时对与关键期终止机制相关的GABA能抑制性中间神经元(GAD 65/67标记)和PNs阳性细胞(Neurocan标记)进行免疫荧光检测，及采用膜片钳技术检测神经元的功能发育状况，率先研发出用于视皮层神经元突触可塑性研究的神经元体外培养方法。

本发明的技术方案如下：

用于视皮层神经元突触可塑性研究的神经元体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取胎鼠大脑组织进行预处理，分离视皮层组织并进行蛋白酶消化，离心；

2)加入接种培养基终止消化；

3)吹打成单细胞悬液后过筛并计数；

4)以2.5×104-5×104个/cm2的密度用接种培养基进行接种，进行全换液方式的贴壁培养；细胞贴壁后，进行半换液方式的后续培养。

所述胎鼠为孕17-18天的雌性大鼠的胎鼠；所述预处理指将所述大鼠大脑组织浸泡在血清高糖解剖液里10分钟；所述分离视皮层组织在普通解剖液中进行。

所述血清高糖解剖液指DMEM/F12培养基中加入体积比为10％的马血清和2×105U/L的青链霉素；所述普通解剖液为Earle's平衡盐溶液中加入2×105U/L的青链霉素和体积比为1％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液。

所述吹打指，用口径分别为2μm、1.5μm、0.8μm的巴氏管依次对组织进行轻柔吹打，且用每种巴氏管吹打5-6次。

所述蛋白酶消化指取视皮层组织在解剖显微镜下剪成1mm×1mm小块，然后用37℃预热0.5小时的14U/ml的木瓜蛋白酶在37℃水浴中消化15-20分钟；所述离心是指在1500r/min的转速下离心3分钟。

所述全换液方式的贴壁培养指：接种2h后观察，若细胞碎片较多，应在接种6h后以接种培养基进行全换液，18h后用维持培养基全换液；如碎片较少，则24h后用维持培养基进行全换液；所述半换液方式的后续培养指用维持培养基2-3天进行一次半换液的方式进行培养。

所述维持培养基指Medium无血清培养基中加入体积比为2％的B27血清替代物和2×105U/L的青链霉素以及0.5mmol/L的L-谷氨酰氨。

所述接种培养基为DMEM/F12培养基中加入体积比为10％的马血清、2×105U/L的青链霉素和0.5mmol/L的L-谷氨酰氨。

所述神经元体外培养方法获得的大鼠视皮层神经元细胞系。

所述神经元体外培养方法在视皮层神经元突触可塑性研究方面的应用。

本发明所述的大鼠视皮层神经元培养方法有诸多改进之处。首先，本发明经培养发现，与出生后1-3d新生鼠相比，采用胎鼠获得的神经元纯度高，杂细胞少，胶质细胞***能力低；采用孕19-21d的胎鼠，其胶质细胞***能力较强，小于孕14d的胎鼠，其大脑视皮层区域生长尚未成熟，定位较困难，且神经元较为脆弱，培养后期易凋亡。实验发现，孕17-18d胎鼠培养的视皮层神经元纯度较高(80-90％)，活性较好，存活率高且存活时间长，因此本发明创新采用孕17-18d雌性大鼠的胎鼠作为取材对象。其次，为维持神经元正常代谢，减少神 经元损伤，本发明所述的培养方法将所述胎鼠的大脑组织浸泡在血清高糖解剖液里，使得取材至接种完成耗时缩短在2h内；此外，为减少可***杂细胞(如血管内皮细胞等)的存在，尽可能将软脑膜剥除干净；消化过程中，为保证组织消化完全，消化前所取视皮层组织先在解剖显微镜下剪成1mm×1mm小块，且木瓜蛋白酶亦先在37℃预热0.5h进行预激活；吹打过程中，为避免神经元细胞过度损伤和刺激胶质细胞***，吹打动作尽量轻柔，吹打次数不宜过多；关于接种密度，本发明研究发现接种密度大于50*104个/cm2时，细胞间空间资源不够，培养大于10d细胞形态异常，不利于电生理和形态学研究，而密度小于1*104个/cm2，则神经元间相互连接减少，难以彼此供应营养，影响后期生长；反复实验后，建议接种密度在2.5-5*104个/cm2较为合适；培养基上，虽有研究通过在含血清培养基内加入阿糖胞苷以抑制胶质细胞***生长，然而阿糖胞苷对神经元也有一定毒性作用[14]，因此本方法先采用含血清培养基助神经元贴壁和生长，待接种24h神经元基本贴壁后，换为含B27的无血清培养基[16]，以抑制胶质细胞***生长，同时促进神经元生长；后续培养为保证神经元可使用自身分泌的生长因子以及避免对培养环境(渗透压、pH等)造成剧烈改变，采取2-3天半换液原则换液；需要长期培养(培养超过20d)时，培养后期(培养15d后)换液次数可逐渐减少至7天半换液一次，以保证神经元培养环境的稳定。用以上方法培养出来的神经元，其存活率高、生长状态良好，纯度达80％-90％。

本发明分别采用GAD65/67和Neurocan对GABA神经元和PNs进行标记，结果表明本法获得的视皮层神经元上Neurocan和GAD65/67的表达均呈阳性，PNs阳性细胞比例一直维持在80％-85％,GABA阳性神经元比例一直维持在40％-45％。

通过本发明所述培养方法培养的视皮层神经元在恒流电刺激下，膜片钳记录得1-3d、7-14d、14d后的神经元分别被诱发出单峰型，瞬变型及持续型的动作电位，反映了所培养神经元的功能发育状态，且AP变化趋势和和体内可塑性关键期内PSCs的变化趋势基本一致[21]，表明本法培养的视皮层神经元具备突触可塑性研究的功能基础。

本发明获得的所述大鼠视皮层神经元细胞系纯度高、状态良好，能反映视皮层神经元突触可塑性的结构和功能状态，可用于视皮层神经元突触可塑性的相关研究。

附图说明

图1为本发明所述培养方法获得的视皮层神经元原代培养12h、4d后在相差显微镜下观察的细胞形态(A,C:X100；B,D:X200)

图2为本发明所述培养方法获得的视皮层神经元原代培养6d后经Neun化学染色后在荧光显微镜下观察的细胞形态(Neun染色，绿色，DAPI复染，蓝色)(A:X200；B:X400)

图3为为本发明所述培养方法获得的视皮层神经元原代培养4d后经Neurocan化学染色后在荧光显微镜下观察的细胞形态(A:X200,B:X400)

图4为本发明所述培养方法获得的视皮层神经元培养不同天数后经GAD65/67化学染色后在荧光显微镜下观察的细胞形态(GAD65/67染色，DAPI复染)A1、A2:培养5d(A1:X200；A2:X400),B1、B2：培养13d(B1:X200；B2:X400)

图5为本发明所述培养方法获得的视皮层神经元原代培养3、7、14d后经全细胞膜片钳记录的神经元动作电位诱发情况。电流钳方式记录动作电位：脉冲恒流刺激(A,C:3d和14d:40pA×1000ms，B:7d:40pA×300ms)

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。

生物材料的来源及记载出处

清洁级别的lang evans母鼠购买于三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心动检证字SCXK(渝)20020003

主要试剂

DMEM/F12培养基、Medium、B27、EBSS(Gibco,USA)、青链霉素(PS)、马血清(Hyclone,USA)、laminin、L-glutamin、D-多聚赖氨酸、Hepes(Sigma，USA)、木瓜蛋白酶(worthington,USA)、小鼠抗大鼠NeuN单抗、兔抗大鼠GAD67抗体(Millipore,USA)、荧光标记兔抗小鼠Alexa Fluor 647(Abcam,USA)、兔抗大鼠Neurocan(博士德，中国)、荧光标记驴抗兔Alexa Fluor 647(Gibco,USA)、DAPI核染液(碧云天，中国)

主要溶液及配方

DMEM/F12培养基：Dulbecco`s改良培养基和Ham`s F12培养基以1:1(质量比)混合而成

血清高糖解剖液：DMEM/F12培养基中加入10％马血清和2*105U/L PS。

普通解剖液：EBSS中加入2*105U/L PS和1％Hepes。

接种培养基：DMEM/F12(Gibco)加入10％马血清和2*105U/L PS以及0.5mmol/LL-glutamin。

维持培养基：Medium加入2％B27和2*105U/LPS以及0.5mmol/L L-glutamin。

电极内液：葡萄糖酸钾230mmol/L，MgCl2 2.1mmol/L，Na2AT P 2mmol/L，Na2GTP 0.3mmol/L，EGTA 0.5mmol/L，HEPE 5mmol/L，调整pH至7.2～7.5,用0.22nm滤孔径过滤，分装至0.5mlEP管内，放置在-20℃内保存备用。

细胞外液：NaCl 120mmol/L，KCl2.7mmol/L，CaCl22.5mmol/L，MgCl21.3mmol/L，NaH2PO41.2mmol/L，NaHCO326.5mmol/L,葡萄糖17mmol/L,丙酮酸钠1.7mmol/L,乳酸钠3.8mmol/L,调整pH至7.2～7.5,通以体积分数为95％O2和50％CO2 10min,使其达到饱和。

实施例1利用本发明所述的培养方法培养神经元

1.培养板处理： 

24孔板内预先放置直径14mm的圆形盖玻片，加入0.05g/L多聚赖氨酸进行包被，过夜，吸去多聚赖氨酸，无菌超纯水漂洗3遍，室温晾干，加入2mg/L laminin包被2h。

2.神经元培养： 

(1)取材：母鼠断颈处死，75％酒精消毒腹部后开腹取胎。取出胎鼠，取头。眼科镊固定鼠头，角膜剪自枕骨大孔沿两侧脑壳剪至眼球处，去除脑壳，取脑，于普通解剖液中剥去软脑膜。视皮层位于大脑枕区背侧面区域，大小约2mm*3mm，厚度约2mm*3mm，剪出视皮层。剪碎组织，普通解剖液洗两遍。加入37℃预热0.5小时的14U/ml的木瓜蛋白酶，37℃水浴消化15到20min，1500r/min,离心3min，加入适量接种培养基终止消化，以口径由大到小的3种巴氏管轻柔吹打组织(巴氏管管口应预先用酒精灯打磨圆润)，每种巴氏管吹打5-6次，至形成单细胞悬液，显微镜下观察吹打效果。细胞悬液用孔径为40nm的细胞筛过滤后，进行计数。

(2)接种及换液：用接种培养基以2.5x104-5x104cell/cm2的密度接种细胞，接种2h后观察，若细胞碎片较多，应在接种6h后以接种培养基进行全换液，18h后用维持培养基全换液。如碎片较少，则24h后用维持培养基进行全换液，往后采取维持培养基半换液的方式换液。培养前两周，每隔2-3d维持培养基半换液一次，往后每周维持培养基半换液一次。

实施例2用本发明所述大鼠视皮层神经元细胞系进行视皮层神经元突触可塑性研究

一、视皮层神经元纯度鉴定

方法：

取按照实施例1步骤(1)和(2)培养6d的大鼠视皮层神经元爬片，0.01M PBS漂洗2次，3min/次；4％多聚甲醛处理15min，0.01M PBS漂洗4次，5min/次；0.25％triton-100穿透处理15min,0.01M PBS漂洗4次，5min/次；加入含1％BSA和10％兔血清的封闭液，37℃封闭1h；加入小鼠抗大鼠的Neun一抗(1:500)，放置湿盒内，4℃孵育过夜。(5)0.01M PBS漂洗3次，5min/次；加入兔抗小鼠Alexa Fluor 647标志的二抗(1：800)，放置湿盒内，37℃避光孵育45mins,0.01M PBS避光漂洗2次，5min/次；避光，10％DAPI处理10min,0.01M PBS漂洗3次，5min/次；荧光抗淬灭剂封片，共聚焦显微镜下观看结果。

结果：

接种2h观察，可见细胞大部分已贴壁，并有部分长出突起。24h换液时见，细胞贴壁好，胞体浑圆透亮，可见细小突起生长。4d后观察发现，细胞表面饱满均质，折光度好，突起长度明显增长，见图1。7-11d时，可见神经元锥体细胞胞体饱满增大，表面光滑，胞体透亮折光好，突起交叉成网，神经元可存活30d左右。

荧光显微镜下，神经元(绿色)胞体饱满(Neun标记)，胞核(蓝色)完整，神经元突起细长明显，细胞突起之间彼此交织成网，见图2(Neun位于胞浆，阳性呈绿色，DAPI染核呈蓝色)，神经元纯度为80％—90％。

二、视皮层可塑性关键期终止相关免疫细胞化学染色

方法：

(1)取按照实施例1步骤(1)和(2)培养14d的大鼠视皮层神经元爬片，0.01M PBS漂洗2次，3min/次；冰上4％多聚甲醛处理15min，0.01M PBS漂洗4次，5min/次；0.25％triton-100穿透处理15min，0.01M PBS漂洗4次，5min/次；加入含1％BSA和10％驴血清封闭液，37℃孵箱处理1h；加入兔抗大鼠的GAD65/67一抗(1:2000)，放置湿盒内，4度冰箱，孵育过夜；0.01M PBS摇床漂洗3次，10min/次；加入驴抗兔FITC标志的二抗(1：1000)，放置湿盒内，室温避光孵育60mins，0.01M PBS避光摇床漂洗3次，10min/次；加入10％DAPI避光处理10min，0.01M PBS避光漂洗3次，10min/次；荧光抗淬灭剂封片，共聚焦显微镜下观看结果。

(2)取按照实施例1步骤(1)和(2)培养不同天数的大鼠视皮层神经元爬片，一抗为兔抗大鼠Neurocan(1:500)，二抗为驴抗兔Alexa Fluor 488标志二抗(1：400)，其他操作与上述步骤(1)相同。

结果：

(1)原代培养培养视皮层神经元上Neurocan的表达情况： 

Neurocan(绿色)主要表达在胞体和突起上，在4d上可见明显表达(比例约85％)，随着培养天数增加，其表达稳定，显示胞体增大，突起延长，反映神经元生长发育状态逐渐成熟，其阳性比例一直维持在80％-85％，见图3(Neurocan阳性呈绿色，DAPI染核呈蓝色)。

(2)原代培养视皮层神经元上GAD65/67的表达情况： 

GAD65/67主要表达在细胞胞体和突起上，在5d上便可检测明显表达(比例约45％)，见图4(GAD65/67阳性呈绿色，DAPI染核呈蓝色)，并随培养时间天数增加，其表达稳定，阳性比例一直维持在40％-45％。

三、原代培养大鼠视皮层神经元膜片钳检测

方法：

取培养1-15d视皮层神经元爬片，放置于内有细胞外液的膜片钳浴槽中，输液泵向浴槽里持续输入95％O2+5％CO2混和气体。用水平电极压制器压制制成的玻璃记录电极(尖端直径：1-1.6um)，往其内灌注电极液后玻璃电极电阻为5-10MΩ。以透光性好并表面光滑的视皮层神经元为记录对象，将玻璃电极和胞膜封接后，轻轻给予负压抽吸破膜后，形成全细胞膜片钳记录模式。在此模式下，通过电流钳，记录动作电位(AP)，后续数据采集和分析由Axon公司的pClmp10.1软件完成，详细操作步骤见“Shultz SR，MacFabe DF，Foley KA，et al.A single mild fluid percussion injury induces short-term behavioral and neuropathological changes in the Long-Evans rat:support for an animal model of concussion[J].Behav Brain Res.2011,224(2):326-335”和“姚军平侯文生刘慧等，新生LongEvans大鼠初级视皮层神经元的培养和鉴定[J]眼科新进展，2012，32:204-207”。

膜片钳共成功记录170个神经元，(1-7d:54个，7-14d:66个，14-18d:50个)，静息膜电位为-50—-70mV，在电流钳下，给予细胞恒流电刺激，诱使细胞产生动作电位(AP)，结果如下： 

培养1-3d神经元属于幼稚型神经元，能被诱发出单峰型AP；培养7-14d神经元属于中间型神经元，能被诱发出瞬变型AP；培养14d后神经元属于成熟型神经元，能被诱发出持续型AP，见图5:3d为单峰型AP，表现为脉冲时间内神经元只能被诱发出一个AP；7d为瞬变型AP，表现为脉冲时间内神经元被诱发出数量不等的AP，但AP在脉冲停止前结束；14d为持续型AP，表现为脉冲时间内神经元被恒流电刺激后能持续产生AP,且AP的频率随刺激电流强度增大而 增多，AP判断标准见参考文献“陈中山,阴正勤,王仕军,等,LongE～大鼠视网膜神经节细胞电生理学发育特性研究.[J]第三军医大学学报2003,21-1927-03,1000-5404”。

Claims (10)

1.用于视皮层神经元突触可塑性研究的神经元体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取胎鼠大脑组织进行预处理，分离视皮层组织并进行蛋白酶消化，离心；

2)加入接种培养基终止消化；

3)吹打成单细胞悬液后过筛并计数；

4)以2.5×10⁴-5×10⁴个/cm²的密度用接种培养基进行接种，进行全换液方式的贴壁培养；细胞贴壁后，进行半换液方式的后续培养。

2.根据权利要求1所述的神经元体外培养方法，其特征在于，所述胎鼠为孕17-18天的雌性大鼠的胎鼠；所述预处理指将所述大鼠大脑组织浸泡在血清高糖解剖液里10分钟；所述分离视皮层组织在普通解剖液中进行。

3.根据权利要求2所述的神经元体外培养方法，其特征在于，所述血清高糖解剖液指DMEM/F12培养基中加入体积比为10％的马血清和2×10⁵U/L的青链霉素；所述普通解剖液为Earle's平衡盐溶液中加入2×10⁵U/L的青链霉素和体积比为1％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液。

4.根据权利要求1所述的神经元体外培养方法，其特征在于，所述吹打指，用口径分别为2μm、1.5μm、0.8μm的巴氏管依次对组织进行轻柔吹打，且用每种巴氏管吹打5-6次。

5.根据权利要求1所述的神经元体外培养方法，其特征在于，所述蛋白酶消化指取视皮层组织在解剖显微镜下剪成1mm×1mm小块，然后用37℃预热0.5小时的14U/ml的木瓜蛋白酶在37℃水浴中消化15-20分钟；所述离心是指在1500r/min的转速下离心3分钟。

6.根据权利要求1所述的神经元体外培养方法，其特征在于，所述全换液方式的贴壁培养指：接种2h后观察，若细胞碎片较多，应在接种6h后以接种培养基进行全换液，18h后用维持培养基全换液；如碎片较少，则24h后用维持培养基进行全换液；所述半换液方式的后续培养指用维持培养基2-3天进行一次半换液的方式进行培养。

7.根据权利要求6所述的神经元体外培养方法，其特征在于，所述维持培养基指Medium无血清培养基中加入体积比为2％的B27血清替代物和2×10⁵U/L的青链霉素以及0.5mmol/L的L-谷氨酰氨。

8.根据权利要求1或6任一所述的神经元体外培养方法，其特征在于，所述接种培养基为DMEM/F12培养基中加入体积比为10％的马血清、2×10⁵U/L的青链霉素和0.5mmol/L的L-谷氨酰氨。

9.权利要求1～8任一所述的神经元体外培养方法获得的大鼠视皮层神经元细胞系。

10.权利要求1～8任一所述的神经元体外培养方法在视皮层神经元突触可塑性研究方面的应用。