CN104611248A - 复合生物活菌制剂及其制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种复合生物活菌制剂及其制备方法。有效活菌总数不少于10⁸cfu/ml。借助优选的益生菌种经配套培养基活化，扩大培养后混合、并借助于混合菌种培养基和发酵罐培育，过滤、浓缩、配比形成复合活菌制剂。该制剂中所含的各菌种以及有效活菌数的百分比为：光合菌-22～25%、酵母菌-21～24%、枯草芽孢杆菌-15～20%、乳酸片球菌-15～20%、粪链球菌-12～16%，嗜酸乳杆菌-12～16%。应用于农业种植、畜禽养殖、水产养殖、饲料添加和城市污水生活垃圾处理等领域。

Description

复合生物活菌制剂及其制备工艺

技术领域

    本发明属于微生物菌种的应用及其制作工艺，具体地说是一种可应用于农业种植、水产养殖、畜禽养殖、饲料加工、环境保护、污水处理等领域的新型复合生物活菌制剂及其制备工艺。

背景技术

上世纪40年代末学者们第一次发现了四环素对畜禽生长具有促进作用，从而开创了抗生素作为饲料添加剂的时代。在这个时代里，人们广泛使用亚治疗剂量的抗生素及其他化学药品用作饲料添加剂，促进动物的生长或预防病原菌感染、疾病的发生，对饲料工业及养殖业的发展作出了不可磨灭的贡献。但随着科学认识的深人，人们在获得经济效益的同时，对这些抗生素、化学药物所带来的副作用有了更深刻的认识。如滥用抗生素引起动物内源性或二重感染，产生耐药茵株，动物细胞免疫、体液免疫功能下降以及药物在动物产品中的残留等等，基于这些原因，很多国家和饲养者反对抗生素作为生长促进剂，甚至通过立法对愈来愈多的药物品种加以禁止。

我国加入WTO后，对我国的整体经济发展非常有利，但也出现了不容忽视的问题，许多出口农副产品，如肉、禽、蛋、奶、水产品等食品由于农药残留等问题而被拒之门外，减少了我国的国际市场份额，面对竞争激烈的国际市场，摆在我们面前的重要任务是最大限度地减少农药残留，生产无污染、无残留的绿色农副产品，使之在国际市场占有一席之地。

在这种背景下，人们纷纷把目光投向了具有多重功能的无毒、无副作用、无残留的活菌制剂。以乳酸菌为例，据有关资料记载显示普遍公认的几种乳酸菌，生理功效表现为：

嗜酸乳杆菌LA：有免疫增强作用，黏附在动物肠道上皮细胞，平衡肠道菌群。

干酪乳杆菌Shirota:防治肠道紊乱平衡肠道细菌，降低粪便中毒性酶活性。

罗伊代乳杆菌：定植于肠道，对动物疾病的防治效果很好，对人也有良好效果，如果将多种有益菌复合成制剂其功效会表现得更为全面更为突出。因此，开展复合生物活菌技术研究作用重大、意义深远、空间广阔。

进一步的研究发现，菌种之间有着相互影响抑制作用与相互激发的积极作用。经适当搭配可以极大的提高单一存在时的作用和效率，从而使应用范围和应用价值成倍提高。复合菌种的市场价值是为提高农副产品质量，生产绿色食品提升农副产品国际地位提供了有启发意义的思路，也是我们开展这一技术研究的重要依据。

发明内容

本发明以复合生物活菌制剂产品为目的，以多批次的实验、检测为基础，在常用、多见的益生菌种中筛选出经济适用的种属、比例的组合，可以经济、靠效率诱导复合生物活菌制剂的二次发酵生产出更加适用于农业种植、畜禽养殖、水产养殖、饲料添加和城市污水生活垃圾处理等领域的众多产品。以综合解决化学、激素残留、城市环境生活垃圾污染等问题。有益于循环农业、如无公害蔬菜、粮油、肉蛋食品，维护生态平衡。产生有益人民健康，提高经济效益和社会效益的多方面效果。借助适应性培养基相匹配，可以形成新型复合生物活菌制剂二次产品及其生产工艺。

本发明采用的技术方案是：

一、复合生物活菌制剂

本发明的试剂中有效活菌总数不少于10⁸cfu/ml。该制剂是借助混合菌种在装有配套培养基的试管中激活，经摇床培育，在发酵罐中生成，再经过滤、浓缩、配比形成活菌制剂，该制剂中所含各种菌种的有效活菌数的百分比为：

光合菌                                 22~25%，

酵母菌                                 21~24%，

枯草芽孢杆菌                      15~20%

乳酸片球菌                          15~20%，

粪链球菌                           12~16%，

嗜酸乳杆菌                          12~16%。

二、复合生物活菌制剂的制备工艺

该工艺中包括以下步骤：

A、菌种选取与活化：

按照上述所选定的菌种种类、分别选取健康的菌株和配套的活化培养基在试管中进行斜面激活培养，

B、摇瓶培养基的确定和液体菌种的培育：

按如下体积份数比关系制得所需的摇瓶培养基：复合维生素水溶液2份、微量元素水溶液1份、与菌种配套的活化培养基1.5份混配摇匀分散植入烧瓶，然后加入激活后的菌种、在28-33℃无菌室内的摇床上培养24-48小时生成液体菌种，

C、菌种罐培养基的配比和混合菌种的发酵培育：

参照以下的组份重量比配置菌种罐培养基：35%硫酸1g、7水硫酸镁2g、氯化钠1g、 磷酸二氢钾0.5g、苹果酸钠2g、2水氯化钙0.5g、酵母浸出液0.5g、7水硫酸亚铁0.1g、微量元素水溶液1ml、复合维生素水溶液1ml、琼脂10g、蔗糖5g、蛋白胨5g、加入纯净水1L形成液体培养基，

在菌种罐中植入液体培养基后，调整复合液体菌种中各菌种有效活菌总数达到10⁶cfu/ml-10⁷cfu/ml，并参照各菌种活菌数量的如下百分比组成进行调整成为混合菌种：

光合菌                           20~22%，

酵母菌                              18~22%，

枯草芽孢杆菌                  17~20%

乳酸片球菌                      18~21%，

粪链球菌                          22~24%，

嗜酸乳杆菌                      22~18%，

然后按照体积比100:7~10加入到液体培养基中搅拌均匀，调整PH7.0、保持温度28-30℃，培养时间28天得到液体菌种。

以上所述微量元素水溶液由以下成分混合而成：

EDTA-2Na：190~210mg，2水钼酸钠：18~22mg，7水硫酸亚铁：80~120mg，6水氮化镍8~12mg：硼酸80~120mg，2水氯化铜：80~120mg，氯化锌：80~120mg，4水氯化锰：80~120mg，蒸馏水：0.8~1.2L。

以上所述的复合维生素水溶液由以下成分混合而成：

维生素B1：480~520g，对氨基苯甲酸：280~320g，维生素B₃：480~520mg，维生素B₁₂  40~60mg，维生素B₆：80~120mg、维生素B₇：40~60mg、蒸馏水0.8~1.2L。

 三、复合生物活菌粉剂。

四、在以上工艺步骤中C步骤完成之后，得到复合生物活菌液体剂。

再将液体制剂经干燥至水分＜15%的固留物，再经粉碎，过60目筛，包装，形成有效活菌总数不少于10⁷cfu/克的粉状制剂。

以上所述的复合菌种液体或粉剂产品，将分别直接或借助于二次发酵应用于农业种植、畜禽养殖、水产养殖、饲料添加和城市污水生活垃圾处理等领域，以解决化学、激素残留和城市环境污染等问题，生产绿色、无公害蔬菜、粮油、肉蛋食品，维护生态平衡，有益人民健康，提高经济效益和社会效益。

在本发明设计中首先考虑的是有益菌种的选择。首先是根据它的生产工艺环境、二次发酵产品的应用环境、发酵产品的技术性能特征出发，从它们各自的过程特点所决定的生物学特性去认识、比较，以找出优异健康的菌种。再把挑选到的每类菌种，按各菌种所需的条件要求，选择出适合生长繁殖的各级培养基。需要经初步选择、到分类型扩大培养个类活性菌进行混合培养实验。根据它们共生增殖、互相依存的所需要的条件中选择共生特征，再将它们有机的结合在一起进行复合培养的条件筛选出来。通过多次培养试验、反复筛选后确定的混合发酵罐中所需要的共生培养基配方，才能最终实施混合发酵培养、生成本发明所需要的复合菌种试剂。

本发明产生的有益效果是：直接应用或二次发酵产品可以应用到农牧水产领域产生积极地低成本高附加值的经济效益和充分利用生物质废料实现农业循环经济和改善环境效益：

1、本发明的复合生物活菌制剂能够直接应用在水产养殖方面：施用到水体或添加到饵料中，可使动物的消化道内及水体环境中建立有益菌群、抑制有害微生物的生长和繁殖。正常菌群可为养殖品种提供大量的营养素，增强其抗病能力，其菌体作用还能杀死或抑制病原微生物，消除有害物质，促进有益藻类的生长，为水产养殖动物提供良好的生长环境。

2、本发明的复合生物活菌制剂应用在畜禽养殖方面：可调节动物微生态平衡、防止和克服微生态失调，提高畜禽免疫功能、增强其抗病能力，降低发病率和死亡率，进而少用或不用兽药，提高饲料转化率，抑制、消除圈舍有害气体，促进畜禽生长发育。

3、本发明的复合生物活菌制剂应用在种植业方面：能促进土壤有机质的分解，提高肥效；能改善土壤的理化性质，使之松软、透水、透气，从而促进种植作物的新陈代谢，预防和减少病虫害的发生，改善作物品质。

具体实施方式

本发明中的各益生菌均选用由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存的菌种，其中，光合菌（Inoculant of photosynthetic bacteria）的编号为1.2352，酵母菌（Saccharomyces sp）的编号为20122，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilissubsp.subtilis）的编号为1.0015，乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的编号为1.2696，粪链球菌（Lactobacillus acidophilus）的编号为10180，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）的编号为1.2686。

在购买馆藏菌种时，菌藏保管单位会给出不同菌种的应用方向上的配套标准活化培养基型号以供参考，如活化酵母菌的培养基为YPD，…活化培养基LB，…活化培养基MRS。以上的配套于菌种活化的培养基简称为配套培养基。

A、菌种选取与活化：

按照所选定的菌种种类、分别选取健康的菌株和配套的活化培养基在试管中进行斜面激活培养，

B、摇瓶培养基的确定和液体菌种的培育：

按如下体积份数比关系制得所需的摇瓶培养基：复合维生素水溶液2份、微量元素水溶液1份、与菌种配套的活化培养基1.5份混配摇匀分散植入烧瓶，然后加入激活后的菌种、在28-33℃无菌室内的摇床上培养24-48小时生成液体菌种，

C、菌种罐培养基的配比和混合菌种的发酵培育：

参照以下的组份重量比配置菌种罐培养基：35%硫酸1g、7水硫酸镁2g、氯化钠1g、 磷酸二氢钾0.5g、苹果酸钠2g、2水氯化钙0.5g、酵母浸出液0.5g、7水硫酸亚铁0.1g、微量元素水溶液1ml、复合维生素水溶液1ml、琼脂10g、蔗糖5g、蛋白胨5g、加入纯净水形成1L的形成液体培养基，

在菌种罐中注入液体培养基后，必须调整复合液体菌种中各菌种有效活菌总数达到10⁶cfu/ml-10⁷cfu/ml，并参照各菌种活菌数量的如下百分比组成进行调整成为混合菌种：

光合菌                           20~22%，

酵母菌                              18~22%，

枯草芽孢杆菌                  17~20%

乳酸片球菌                      18~21%，

粪链球菌                          22~24%，

嗜酸乳杆菌                      22~18%，

然后按照扩大培养的发酵罐大小以积比100:7~10加入到液体培养基中搅拌均匀，调整PH7.0、保持温度28-30℃，培养时间28天得到液体菌种。

以上所述微量元素水溶液，是适应于混合菌种中每一种均衡生长需求而经反复试验和配方比例调整而得出的经验配比。

实施例如下：

实施例（mg）      1               2             3               4 

EDTA-2Na        190           195         205           210

2水钼酸钠        18            19.5         20.5          22

7水硫酸亚铁     80            90           105           120

6水氮化镍        12            11           10            8

硼酸                80            90           105           120

2水氯化铜       80            90           105           120

氯化锌             80            90           105           120

4水氯化锰        80            90           105           120

加入蒸馏水                    1升

以上所述的复合维生素水溶液也是适应于混合菌种中每一种均衡生长需求而经反复试验和配方比例调整而得出的经验配比。具体实施例如下：

实施例如下：

实施例（g）      A              B            C            D 

维生素B1          480          490         505        520

对氨基苯甲酸     320          310         300        180

维生素B₃         480           490         505        520 

维生素B₁₂           40            50          55         60 

维生素B₆          120           110         95         80

维生素B                40             48          52         60 

蒸馏水（L）      1.2            1.1         9.5         8。

将所选取的6种益生菌分别活化、并进一步经摇床扩大培养成为液体菌种之后，活体菌总数量达到10⁶cfu/ml-10⁷cfu/ml。并且，混合菌种中各菌种活菌数量的比例应当符合接种时百分比组成规定。以保证在菌种发酵罐中，在特定的培养基中最终的产品能达到混合菌种产品的标准。

将生成的液体菌种经干燥至水分＜15%得到固留物，再经粉碎，过60目筛，包装，形成有效活菌总数不少于10⁷cfu/克的粉状制剂。

复合生物活菌制剂作为益生菌为基础原料混合菌种，本身具备分解生物质材料转化为生物质肥料的基本属性，又具有抑制有害菌类生长和分解污物的能力。根据不同的目的、目前已经开发出借助生物质培养基的组份和配套好氧、厌氧菌系的辅助组成发酵菌系，生成微生物营养互补，功能各异生长同步的效果效果。以本复合生物活菌制为基础的复合生物活菌制剂二次发酵产品已经广泛试用在水产、畜禽、农业种植和环境保护领域。十余种复合生物活菌制剂直接和间接产品已经展现出强大的生命力。 

Claims (5)

1.复合生物活菌制剂，有效活菌总数不少于10⁸cfu/ml，其特征在于：本制剂借助混合菌种在装有配套培养基的发酵罐中生成，经过滤、浓缩、配比形成活菌制剂，该制剂中所含各菌种的有效活菌数的百分比为：

光合菌                   22~25%，

酵母菌                   21~24%，

枯草芽孢杆菌             15~20%

乳酸片球菌               15~20%，

粪链球菌                 12~16%，

嗜酸乳杆菌               12~16%。

2.根据权利要求1所述的复合生物活菌制剂的制备工艺，其特征在于：该工艺中包括以下步骤：

A、菌种选取与活化：

按照所选定的菌种种类、分别选取健康的菌株和配套的活化培养基在试管中进行斜面激活培养，

B、摇瓶培养基的确定和液体菌种的培育：

按如下体积份数比关系制得所需的摇瓶培养基：复合维生素水溶液2份、微量元素水溶液1份、与菌种配套的活化培养基1.5份混配摇匀分散注入烧瓶，然后加入激活后的菌种、在28-33℃无菌室内的摇床上培养24-48小时生成液体菌种，

C、菌种罐培养基的配比和混合菌种的发酵培育：

参照以下的组份重量比配置菌种罐培养基：35%稀硫酸1ml、7水硫酸镁2g、氯化钠1g、 磷酸二氢钾0.5g、苹果酸钠2g、2水氯化钙0.5g、酵母浸出液0.5g、7水硫酸亚铁0.1g、微量元素水溶液1ml、复合维生素水溶液1ml、琼脂10g、蔗糖5g、蛋白胨5g、加入纯净水1L形成液体培养基，

在菌种发酵罐中注入上述液体培养基后，调整复合液体菌种中各菌种有效活菌总数达到10⁶cfu/ml-10⁷cfu/ml，并参照各菌种活菌数量达如下百分比组成的混合菌种：

光合菌                  20~22%，

酵母菌                   18~22%，

枯草芽孢杆菌             17~20%

乳酸片球菌           18~21%，

粪链球菌                 22~24%，

嗜酸乳杆菌           22~18%，

然后按照体积比100:7~10加入到液体培养基中搅拌均匀，调整PH7.0、保持温度28-30℃，培养时间28天得到液体菌种。

3.根据权利要求2所述的复合生物活菌制剂的制备工艺，其特征在于：所述微量元素水溶液由以下成分混合而成：

EDTA-2Na：190~210mg，2水钼酸钠：18~22mg，7水硫酸亚铁：80~120mg，6氮化镍8~12mg：硼酸80~120mg，2水氯化铜：80~120mg，氯化锌：80~120mg，4水氯化锰：80~120mg，蒸馏水：0.8~1.2L。

4.根据权利要求2所述的复合生物活菌制剂的制备工艺，其特征在于：所述的复合维生素水溶液由以下成分混合而成：

维生素B1：480~520g，对氨基苯甲酸：280~320g，维生素B₃：480~520mg，维生素B₁₂  40~60mg，维生素B₆：80~120mg、维生素B₇：40~60mg、蒸馏水0.8~1.2L。

5.一种复合生物活菌粉剂，按照权利要求2所说的的工艺步骤制作，其特征在于：在C步骤完成之后，将液体制剂经干燥至水分＜15%，再经粉碎，过60目筛，包装，形成有效活菌总数不少于10⁷cfu/克的粉状制剂。