CN104560912B - 酯酶及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酯酶及其编码基因和应用，该酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从假单胞菌Pseudomonas CGMCC NO.4184中克隆得到酯酶基因，该基因表达后获得的酯酶具有高表达量、高选择性和手性选择性的特点；本发明将包含酯酶基因的工程菌应用到催化rac‑2‑羧乙基‑3‑氰基‑5‑甲基己酸乙酯水解制备2‑羧乙基‑(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸乙酯中，能够控制反应的转化率在超过50％时，即可获得未被水解的高纯度2‑羧乙基‑(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸乙酯。

Description

酯酶及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种酯酶及其编码基因和应用。
背景技术
2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯是化学酶法合成普瑞巴林(Pregabalin，简称PGB，商品名为)的重要手性中间体。普瑞巴林是一种神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的三位异丁基取代物，其作为新一代抗癫痫药物，已被应用于治疗多种中枢神经***紊乱疾病，包括神经病理性疼痛，社交性焦虑障碍，泛发性焦虑症和辅助性治疗局限性部分癫痫发作等。由于该药物相较于其他同类治疗癫痫病药物具有明显的优势，由辉瑞公司生产并上市销售的年销售额呈逐年攀升之势，在2011年、2012年和2013年分别高达36.9亿、41.6亿和46.0亿美元。由于只有S构型的普瑞巴林具有药理活性，因此，获取光学纯的中间体2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯在有效减少服用剂量、提高治疗窗口、减轻非活性对映体所致副作用等方面具有重要的意义。
制备普瑞巴林主要有两类方法：一类是使用不对称催化剂、手性配体或者以手性化合物为原料的不对称合成法，另一类是使用化学手性拆分剂或者生物酶对外消旋反应中间体或外消旋普瑞巴林进行拆分的外消旋体拆分法。不对称合成法因需要昂贵的手性试剂，特殊的设备，苛刻的反应条件等，其应用受到了明显的限制。化学拆分法同样具有一些难以避免的缺陷，譬如反应步骤繁杂，劳动强度大，操作复杂，收率低，环境污染较大等。相比之下，生物拆分法则可有效避免这些问题，具备操作条件简单温和，对映选择性强，成本低，环境友好等优点，因此具有极大的开发潜力和广阔的应用前景。
目前，不少生物催化法制备普瑞巴林的途径已见报道。例如，具有高活力和高对映体选择性(转化率为45％，产物对映体过量值eep为98％)的腈水解酶AtNit1，能够实现高效地立体选择性水解异丁基琥珀腈，得到中间体(3S)-3-氰基-5-甲基己酸。来自南极假丝酵母的脂肪酶CALB也被应用于立体选择性合成手性中间体(S)-或(R)-异丁基-戊二酸酯(收率为96％，ee值为95.5％)。基于过程效率和产品成本的考虑，这些路径目前并不能满足制备普瑞巴林的工业化应用要求。
另外一条路径，即辉瑞公司利用商业脂肪酶选择性地水解2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，则成功实现了化学-酶法制备普瑞巴林的工业化生产。该方法所得到的2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸(转化率为45％-50％，ee值＞98％)的钠盐，经过后续化学反应步骤最终可制得(S)-普瑞巴林。这条工艺路线实现了手性中心的尽早确立以及2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的外消旋化再利用，大幅地减少了原料用量和废弃物产生量，使E因子由第一代(传统拆分)路线的86降至8。基于这条生物法拆分路线，其他作用于2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的酶或微生物陆续被开发和报道。如一株土筛得到的菌株KM8经紫外和硫酸二甲酯(DES)诱变，其转化率和eep值分别提高至76.1％和92.6％。另一株菌Morgarella morganii ZJB-09203及从中纯化得到的酯酶也被应用于选择性水解2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，当使用全细胞催化剂水解1.5M底物时，其转化率和eep值分别为45.3％和95％。来源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶Lip经过定点突变改造，酶活得到大幅提高，在1M底物投入量下实现了42.4％的转化率和98％的eep值。然而，上述路线的酶法拆分都无法获取更高光学纯度(ee＞99％)的S型产物。
因此，通过对映选择性水解2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯而留下未被水解的高光学纯度2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯是一种具有潜力的拆分选择。
发明内容
本发明提供了一种酯酶及其编码基因和应用，该酯酶具有高表达量、高选择性和手性选择性的特点。
本发明提供了一种酯酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
该酯酶(命名为EstZF172)是从假单胞菌Pseudomonas CGMCC NO.4184中克隆获得，由1146个碱基组成，能够催化酯酶水解生成酸和醇。
本发明还提供了一种编码所述的酯酶的基因。
作为优选，所述的基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种包含所述基因的表达盒、重组载体和转化子。
本发明还提供了一种所述的酯酶在催化酯类水解中的应用。
具体地，所述的酯酶在催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解制备2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯中的应用。
本发明还提供了一种制备2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的方法，包括以下步骤：
(1)制备包含所述基因的工程菌的静息细胞悬液；
(2)往静息细胞悬液中添加rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯进行水解反应，经后处理，得到2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。
所述的水解反应如下式所示：
本发明所述的催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解的反应，实际上是将rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯中的R构型的2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解得到2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸和乙醇，从而使反应体系中剩下光学纯的S构型的2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯；水解反应结束后，将反应液离心以除去体系中的细胞，向离心上清液中添加适量NaCl，并用乙酸乙酯反复萃取多次，将萃取液合并后，在35℃下进行真空旋蒸除去萃取剂，分离获得高纯度的2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。
在整个S构型的2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的制备过程中，rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯与静息细胞的用量比例，以及水解反应的温度和离子缓冲液的pH值都会对所述酯酶催化的水解反应的转化率有影响。作为优选，rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯与静息细胞的质量比为20～60∶1；所述水解反应的温度为20～55℃；水解反应过程中离子缓冲液的pH值为5～10.5。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明从假单胞菌Pseudomonas CGMCC NO.4184中克隆得到酯酶基因，该基因表达后获得的酯酶具有高表达量、高选择性和手性选择性的特点；
(2)本发明将包含酯酶基因的工程菌应用到催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解制备2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯中，当水解反应的转化率略超过50％时，即可获得未被水解的高纯度2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯；尤其是，当反应体系中rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯浓度为127.5g L-1时，反应7h后转化率为52.3％(即收率达47％以上)，此时ees＞99％。
附图说明
图1为重组质粒pET30a-estZF172表达质粒构建图。
图2为目标条带PCR产物电泳结果图；
1：目标条带；2：DNA marker。
图3为重组pET30a-estZF172表达质粒酶切验证电泳图；
1：Nde I单酶切；2：Xho I单酶切；3：Nde I/Xho I双酶切；4：DNA marker。
图4为重组蛋白诱导表达图；
1：没有外源基因的空白对照；2：BL21-pET30a-estZF172全细胞(IPTG诱导)；
3：BL21-pET30a-estZF172破胞后沉淀；4：BL21-pET30a-estZF172破胞后上清；
5：Protein marker。
图5为2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯和2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸脱羧物的手性气相色谱分析图谱；
峰1为2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸脱羧物(11.46min)；
峰2为2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸脱羧物(12.53min)；
峰3为2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(40.66min)；
峰4为2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(41.86min)。
图6为酯酶催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解制备2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的过程曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并非仅限于此。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，具体可参见J.萨姆布鲁克等编写的《分子克隆实验指南》。
本发明实施案例中所使用的限制性内切酶NdeI、Xho I和T4 DNA连接酶均购自TaKaRa；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒均购自Axygen杭州有限公司；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、质粒pET-30a(+)均购自Novagen公司；DNA marker、Protein Marker、琼脂糖电泳试剂均购自北京全式金生物技术有限公司。以上试剂使用方法参考商品说明书。本发明酯酶基因从假单胞菌Pseudomonas CGMCC NO.4184中克隆获得，该菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC NO.4184。
以下实施案例设计的检测方法如下：
1.气相检测方法：气相色谱分析仪使用浙江福立公司的9790型号气相***。色谱柱为手性气相柱Astec CHIRALDEXTM Capillary G-TA(30m×0.25mm×0.12μm)，检测器为FID检测器，检测条件为：进样器和检测器温度为250℃，柱温为135℃，载气(N2)流速为30mL/min，空气流速为300mL/min，氢气流速为30mL/min。在本发明反应结束后，取产物180μL，加入40μL浓度为1mol/L的盐酸终止反应，加入适量氯化钠至饱和，并加入3倍体积的乙酸乙酯进行萃取。离心后，上清液用无水硫酸钠干燥，取0.3μL进样检测，得到2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸，2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸，2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯和2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的气相图。
需额外说明的是，2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸在气相条件下会发生脱羧反应，生成3-氰基-5-甲基己酸乙酯。故产物峰对应物质实为2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的脱羧物，即3-氰基-5-甲基己酸乙酯。
按以下公式计算底物rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的转化率：
底物转化率(％)＝(初始底物浓度-剩余底物浓度)/初始底物浓度×100％。
按以下公式分别计算底物和产物的对映体过量值：
底物对映体过量值ees(％)＝[(AS，s-AR，s)/(AS，s+AR，s)]×100％。
产物对映体过量值eep(％)＝[(AR，p-AS，p)/(AR，p+AS，p)]×100％。
其中，AS，s，AR，s，AS，p，AR，p分别为气相色谱测得(S)-底物，(R)-底物，(S)-产物和(R)-产物的峰面积值。
2.测序：送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
实施例1 酯酶基因的重组质粒的构建
(一)酯酶基因的克隆
根据假单胞菌(Pseudomonas)CGMCC NO.4184基因组DNA序列，设计一对引物，引物序列如下：
上游引物为：5’-GGGAATTCCATATGCAGATCCAGGGTCACTATGAGCTGAAGTTCG-3’，(如SEQID NO.3所示)，其中划线部分为Nde I酶切位点；
下游引物为：5’-CCCCTCGAGAAGGCAAGTGCCAAGAACGCGTACCA-3’，(如SEQ ID NO.4所示)，其中划线部分为Xho I酶切位点。
以假单胞菌(Pseudomonas sp.)CGMCC NO.4184基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件如下：
PCR扩增体系：
PCR扩增条件：
1)预变性：95℃ 5min；
2)变性：98℃ 10s；退火：59℃ 15s；延伸：72℃ 20s；共循环30次；
3)延伸：72℃ 10min；
4)4℃保存2.0h。
PCR扩增结束后，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳来检测，结果如图2所示电泳图，其中，泳道1为包含酶切位点的长1146bp的目的片段。将目的片段进行测序，确认目的片段的序列如SEQ NO.1所示。
(二)表达载体的构建
将该目的片段用PCR清洁试剂盒进行清洁回收，得到回收产物a。将回收产物a用Nde I和Xho I在37℃条件下酶切3h，用PCR清洁试剂盒清洁回收，得到回收产物b。将pET-30a(+)载体用Nde I和Xho I在37℃条件下酶切3h，用PCR清洁试剂盒清洁回收，得到回收产物c。将酶切产物b和c混合，加入T4连接酶，16℃过夜连接，得到连接体系d。将连接了酯酶基因的质粒命名为pET30a-estZF172。连接体系如下表1所示：
表1 pET30a-estZF172重组表达质粒连接体系
将连接体系d转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有50μg/mL卡纳霉素的LB平板上，37℃培养16-24h后挑取单克隆培养得到重组细胞。将获得的重组细胞提取质粒进行测序，确认其具有如SEQ NO.1所示的序列。
实施例2 构建重组E.coli BL21(DE3)诱导表达酯酶
将带有pET30a-estZF172质粒的重组细胞接种于5mL LB液体培养基中(含有50g/mL卡纳霉素)中，37℃和200rpm条件下培养过夜。按1％的比例将上述培养物接种于含50mLLB液体培养基(含有50g/mL卡纳霉素)中，37℃和200rpm条件下培养至OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L。18℃和200rpm下诱导培养。12h后12,000×g离心收集菌体，用预冷的Tris-HCl缓冲液(300mM，pH 8.5)洗涤两次，所得的湿细胞储存于4℃。
实施例3
按0.085‰(0.085g干细胞/L)的比例将相应的湿细胞用14mL Tris-HCl缓冲液(300mM，pH 8.5)重悬，分成7份，每份2mL，分别加入底物rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，使得rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯相对于rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯和细胞重悬液总量的质量浓度为5g/L。将7份溶液分别放入温度为20℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃和55℃的转速均为200rpm的恒温摇床中，1h后用气相检测方法检测底物和产物的浓度，其在气相上的保留时间如图5所示，峰1为2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸脱羧物(11.46min)；峰2为2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸脱羧物(12.53min)；峰3为2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(40.66min)；峰4为2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(41.86min)。计算转化率和ees，结果如表1。从表1中数据可知，在20～35℃条件下，转化率随温度升高而升高，在35℃时底物转化率为53.5％，ees高于99％；在35～55℃条件下，随着反应温度的升高，由于酶在高温下容易失活，导致底物转化率反而下降，ees也随之下降。
表1 酯酶在不同温度下水解rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的反应转化率和ees值
实施例4
按0.085‰(0.085g干细胞/L)的比例将相应的湿细胞分别用2mL不同pH值的Tris-HCl缓冲液(300mM)重悬，pH分别为5.0，6.0，7.0，8.0，8.5，9.0，10.0，分别加入底物rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，使得rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯相对于rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯和细胞重悬液总量的质量浓度为5g/L。将7份溶液放入35℃，200rpm的恒温摇床中，1h后用气相检测方法检测底物和产物的浓度，计算转化率和ees，结果如表2。从表2中数据可知，在pH 5.0～8.5条件下，转化率随缓冲液pH值升高而升高，在pH 8.5时底物转化率为52.9％，ees高于99％；在pH 8.5～10.0条件下，随着缓冲液pH值的升高，由于在碱性更强的环境中，酶的稳定性不佳，且底物容易自水解，导致底物转化率反而下降，ees也随之下降。
表2 重组酯酶在不同pH下水解rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的反应转化率和ees值
实施例5
根据底物浓度的不同，选择适当的固定的底物/细胞质量比例，即：当底物质量浓度为5g/L和30g/L时，每5g/L底物加入细胞量为0.085‰(0.085g干细胞/L)；当底物质量浓度为60g/L和80g/L时，每5g/L底物加入细胞量为0.10‰；当底物质量浓度为150g/L和200g/L时，每5g/L底物加入细胞量为0.16‰；当底物质量浓度为350g/L和500g/L时，每5g/L底物加入细胞量为0.24‰。将相应的湿细胞分别用2mL的Tris-HCl缓冲液(300mM，pH 8.5)重悬，分别加入不同量的底物rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，使得rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯相对于rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯和细胞重悬液总量的质量浓度分别为5g/L，30g/L，60g/L，80g/L，150g/L，200g/L，350g/L，500g/L。将8份溶液放入35℃，200rpm的恒温摇床中，8h后用气相检测方法检测底物和产物的浓度，计算转化率和ees，结果如表3。从表3中数据可知，通过控制底物和投入的细胞的质量比例，能够实现在反应12h后，5g/L～127.5g/L的底物都被成功转化，ees均达到高于99％的水平，且转化率控制在62％以下。当底物浓度较低时，由于反应在更短的时间内已实现ees高于99％，故反应时间继续延长至12h会使更多底物被缓慢转化，导致反应转化率提高，2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的收率下降。底物浓度较高时，需要调节细胞加入量以改善反应抑制情况，ees高于99％所需时间也发生改变，总体而言所需时间延长。
表3 酯酶在不同底物浓度下水解rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的反应转化率和ees值
实施例6
按3.26‰(3.26g干细胞/L)的比例将相应的湿细胞用5mL Tris-HCl缓冲液(300mM，pH8.5)重悬，加入底物rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，使得rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯相对于rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯和细胞重悬液总量的质量浓度为127.5g/L，放入35℃水浴锅中，采用磁力搅拌，前2小时内每隔0.5h取样，之后每隔1h取样，用气相检测方法检测底物和产物的浓度，计算转化率和ees，结果如图6。从图6可知，随着反应时间的增加，底物的转化率不断增加，7h后转化率可达52.3％，ees＞99％，最终得到2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的浓度约为60.8g/L。

Claims (10)

1.一种酯酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种编码权利要求1所述的酯酶的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种包含权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体和转化子。
5.如权利要求1所述的酯酶在催化酯类水解中的应用。
6.如权利要求1所述的酯酶在催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解制备2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯中的应用。
7.一种制备2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的方法，包括以下步骤：
(1)制备包含权利要求2所述基因的工程菌的静息细胞悬液；
(2)往静息细胞悬液中添加rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯进行水解反应，经后处理，得到2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯与静息细胞的质量比为20～60∶1。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述水解反应的温度为20～55℃。
10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，水解反应过程中离子缓冲液的pH值为5～10.5。
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