CN104558175B - 抗人vegf的重组嵌合抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明描述了与人血管内皮生长因子(hVEGF)结合的嵌合抗体或其抗原结合片段，并列出抗体重链与轻链可变区的核苷酸序列及其衍生的氨基酸序列。将此重链及轻链可变区基因分别与人免疫球蛋白gamma1(γ1)重链的恒定区及人kappa(κ)轻链恒定区基因连接成嵌合基因。再将含有此抗体或其抗原结合片段的基因的载体引入宿主细胞株表达抗体蛋白。此重组嵌合抗体或其抗原结合片段在体外测试可抑制或中和hVEGF的活性，适用于治疗与高VEGF表达水平和/或血管生成异常相关的疾病，所述血管生成异常至少部分被VEGF通路控制。

Description

抗人VEGF的重组嵌合抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及免疫学领域，特别是抗体方面，更具体地涉及一种抗VEGF的重组嵌合抗体及其用途。

背景技术

在迄今发现的20多种多肽类血管生长因子中，血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF,也可写作VEGF-A) 是针对内皮细胞特异性最高，促血管生长作用最强的关键调节因子，在多种原发性恶性肿瘤组织中均呈高表达，所述肿瘤包括肺、***、胃肠道、肾、胰脏和卵巢肿瘤 (Berkman RA等,1993, J Clin Invest, 91:153-159)。

VEGF家族除了原型成员VEGF-A外，还包括胎盘生长因子(placenta growthfactor, P1GF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D。VEGF-A是高度保守的同源二聚体糖蛋白，由两条分子量各为24kDa的单链以二硫键组成二聚体。人VEGF-A基因由8个外显子、7个内含子组成，由于mRNA不同的剪切方式，分别产生出VEGF₁₂₁、VEGF₁₄₅、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉、VEGF₂₀₆等至少5种蛋白形式，其中VEGF₁₆₅是体内表达最多且生物活性最强的亚型。VEGF家族通过与受体结合发挥作用。

贝伐单抗(Avastin)是FDA批准的第一个抗肿瘤血管生成的人源化单克隆抗体（美国专利No.08/833504；中国专利CN1259962A)。它是一种抗VEGF的抗体(IgGl)，93%的人源结构域和7%的鼠源结合区域(抗原决定簇，CDR)组成。贝伐单抗与VEGF的结合亲和力约为0.5nM，可抑制VEGF与VEGFRl和VEGFR2的结合。贝伐单抗在人体内的消除半衰期为17~21天。Avastin于2004年2月被美国FDA批准作为联合化疗治疗转移性结直肠癌的一线药物上市。随后几年，贝伐单抗又被FDA批准用于联合化疗或其他抗肿瘤药物作为晚期非小细胞肺癌、转移性肾细胞癌以及脑胶质瘤的一线治疗药物。另外，Avastin用于治疗HER2阴性乳癌的申请已获欧洲药监局EMA的批准。目前针对卵巢癌、转移性胃腺癌、复发性肝癌的贝伐单抗联合化疗的II/III期临床试验正在进行中。

除了癌症外，抗VEGF抗体也是治疗包括老年性黄斑变性(AMD)，糖尿病引起的眼底病在内的多种眼科疾病的一线药物。眼睛水状液和玻璃状液中VEGF的增加已与各种视网膜病相关联（Aiello LP等, N Engl J Med, 1994, 331:1480-1487)。为了治疗这些疾病，在Avastin的基础上，基因泰克公司又将其全抗体分子结构进行简化，保留能够中和VEGF的抗体片段，同时将给药途径由静脉注射改为玻璃体直接注射，由此成就另一药物——Avastin的孪生姊妹兰尼单抗(Lucentis)，即一种源自贝伐单抗的亲和力成熟的Fab片段。2006年，兰尼单抗被美国药监局批准用于治疗AMD，很快就成为治疗老年性黄斑变性和糖尿病引起的眼底病的首选药。

虽然贝伐单抗已应用于临床多年，对多种实体肿瘤的治疗都取得了良好的疗效，但贝伐单抗对VEGF亲和力不高，并且由独家生产，病人需要花费高额的费用，目前一个病人用药一年的费用约在5万至10万美元。此外，有效性和不良反应也是不容忽视的问题。用Avastin辅助治疗癌症会导致副作用，包括高血压、蛋白尿、血栓栓塞事件(thromboembolicevent)、出血和心脏毒性(Blower E等, Br J Nurs, 2009,18:351-6, 358)。另外，VEGF抗体针对同一靶点不同亚型的特异性会影响其治疗效果，已证实贝伐单抗不仅结合VEGF还可与VEGF_165b结合，并不适用于治疗体内高度表达VEGF_165b的患者(Harper SJ等, Cancer,2008, 8:880-887)。

因而，研发新的抗VEGF单克隆抗体，从而减少病人负担，降低治疗费用是一个亟待解决的问题。抗VEGF抗体药物升级需要获得和研究针对VEGF不同抗原表位或识别相同表位而亲和力不同的抗体CDR区。不同CDR免疫源性是不同的，这会造成抗体被耐受的速度和毒性的差异，直接影响药效。针对不同抗原表位或识别相同表位而亲和力不同的抗体CDR与抗原结合的亲和力也会有差异，高亲和力CDR的抗体药物每针剂用量预期可以下调。鉴于VEGF和其受体的多样性，针对VEGF不同抗原表位或识别相同表位而亲和力不同的VEGF抗体对肿瘤生长或其他与VEGF高表达相关疾病的抑制效果可能是不同的。此外，抗体的疗效还受抗体血浆半衰期和血管通透性等因素的影响。因此研究识别VEGF不同抗原表位或相同表位而亲和力更高的抗体，并进行人源化改造将有助于获得疗效更好的治疗性抗体。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种比现有技术中的小鼠抗体更加安全可靠的、功能更显著的抗VEGF的嵌合抗体。所述嵌合抗体与人VEGF的结合K_D值约0.01nM，能够高特异性地拮抗VEGF与VEGFR的结合，其结合VEGF能力是人源化抗体Avastin的10倍以上。因此，本发明所提供的人VEGF嵌合抗体具有更高的特异性，在临床应用中，有望提高安全性，且临床使用剂量仅需Avastin的1/10即可达到等同药效，大大降低患者的治疗成本。

在本发明的一个方面，公开了一种与人血管内皮生长因子结合的抗体，其特征在于，该抗体的重链可变区的CDR-Hl为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，CDR-H2为SEQ ID NO：4所示氨基酸序列，和CDR-H3具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；以及该抗体的轻链可变区的CDR-Ll为SEQ ID NO：8所示氨基酸序列，CDR-L2为 SEQ ID NO：9所示氨基酸序列，和CDR-L3为SEQ ID NO：10所示氨基酸序列。

在该方面的一个优选例中，该抗体的重链可变区为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，相应地，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在该方面的另一个优选例中，该抗体的轻链可变区为SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，相应地，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

在该方面的还有一个优选例中，其重链恒定区序列是人IgGl的重链恒定区序列。

在该方面的还有一个优选例中，该抗体的轻链恒定区序列是人κ抗体轻链恒定区序列。

在该发明的一个优选例中，该抗体与hVEGF₁₆₅结合的K_D值为≤0.1nM，优选为0.01nM。

在第二个方面，本发明提供了编码上述嵌合抗体的分离核酸。

在第三个方面，本发明提供了含有上述核酸的表达载体。

在第四个方面，本发明提供了用上述表达载体转染的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

在本发明的第五个方面，提供了一种药物组合物，含有上述抗体和药物学上可接受的载体。

在本发明的第六个方面提供了所述药物组合物的用途，优选该药物组合物用于治疗任何与血管生成异常相关的疾病，特别是与VEGF信号通路相关联的血管生长增加，而导致、加剧、或以其他形式相关联的状态。这些疾病，通常与VEGF表达水平升高相关，包括与血管生成增加相关的眼部疾病，如湿性AMD或增殖性视网膜病变如糖尿病性视网膜病变，糖尿病肾病和其他糖尿病血管增生疾病，囊性纤维化病、多种依赖于新生血管生成的肿瘤(Amoroso A等, Eur Rev Med Pharmacol Sci, 1997,1:17-25; McColley SA等, Am J Respir Crit Care Med, 2000,161:1877-1880; Khamaisi M等, Nephrol Dial Transplant, 2003,18:1427-1430)以及炎症。所述癌症包括但不限于结肠转移癌、直肠转移癌、非鳞状非小细胞肺癌、HER2阴性乳癌、肾细胞癌、卵巢癌、胃肠道癌、骨肿瘤、***癌或肝癌等。所述炎症包括但不限于类风湿性关节炎、牛皮癣、硬皮病、慢性阻塞性肺部疾病或哮喘。

附图说明

图1竞争法ELISA筛选各孔内抗人VEGF鼠单克隆抗体对经HRP标记的抗VEGF人源化抗体Avastin与hVEGF的竞争结合能力。

图2 间接法ELISA测定抗人VEGF鼠单克隆抗体结合VEGF的效价。其中，鼠单克隆抗体TM12-15-1的效价最高。

图3抗人VEGF鼠单克隆抗体对经HRP标记的抗VEGF人源化抗体Avastin与VEGF的竞争结合测定。其中，抗hVEGF鼠单克隆抗体TM 12-15-1竞争Avastin结合抗原的能力最强。

图4 BLI分析鼠单克隆抗体TM12-15-1亲和力的动力学拟合曲线。

图5鼠单克隆抗体TM12-15-1与人VEGF结合平衡解离常数K_D值测定图。

图6抗人VEGF嵌合抗体C12-15-1的重链可变区的核苷酸序列(示于SEQ ID NO:1)及其演绎的氨基酸序列(示于SEQ ID NO:2)。以下划线标出互补决定区的氨基酸残基 CDR-Hl (SEQ ID NO：3)，CDR-H2 (SEQ ID NO: 4)和 CDR-H3 (SEQ ID NO: 5)。

图7抗人VEGF嵌合抗体C12-15-1的轻链可变区的核苷酸序列(示于SEQ TD NO：6)及其演绎的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。以下划线标出互补决定区的氨基酸残基 CDR-Ll(SEQ ID NO: 8)，CDR-L2 (SEQ ID NO: 9)和 CDR-L3 (SEQ ID NO: 10)。

图8嵌合抗体C12-15-1纯化蛋白与Avastin抗体的竞争结合测定。

图9抗人VEGF嵌合抗体C12-15-1和抗VEGF人源化抗体Avastin (20μg/mL, 10μg/mL, 5μg/mL, 2.5μg/mL) 在体外抑制HUVEC细胞增殖测定中抑制VEGF的能力。鼠源抗体TM12-151中和hVEGF诱导的HUVEC细胞增殖的能力显著高于Avastin。

具体实施方式

本发明的抗人VEGF抗体含有源自人和非人成份的抗体(Cabilly S等, Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81:3273-3277；Morrison S等, Proc Natl Acad Sci USA, 1984,81:6851-6855; Sun L等, Proc Natl Acad Sci USA,1987, 84:214-218)。其可变区源自小鼠，具有结合与中和人VEGF的特性。其恒定区则与人IgGl重链及κ轻链的恒定区完全一样。人IgGl在人体半衰期可达21天，而且具有效应子功能，可介导补体和抗体依赖性细胞毒性途径。因此，本发明的抗体比鼠源抗体更适用于病患，不仅对人体使用具有更高的相容性和安全性，并且在人体内能停留的时间更长、更有效。因此，本发明的抗体可治疗人体内与VEGF高表达和/或血管生成增加相关的疾病。

各种形式的抗体被包括在本发明之中。例如，抗人VEGF抗体可以是全长的抗体(例如具有完整的人Fc区)，或是抗体片段(如Fab、Fab或F(ab^')²)。此外，抗体可以用可检测的标记物进行标记，固定在固相载体上，和/或偶联于异源化合物(如细胞毒性物质)。

抗体的诊断和治疗用途被包括在内。在一种诊断应用中，本发明提供了一种确定VEGF是否存在的方法，它包括：将怀疑含有VEGF的样品暴露于本发明的抗体，然后测定抗体与样品的结合。对于该应用，本发明提供了一试剂盒，它含有抗体和使用抗体来检测VEGF的说明书。

本发明还提供了：分离的编码该抗体的核酸；含有该核酸的载体，其中该核酸可任选地操作性连接于被载体所转化的宿主细胞所识别的控制序列；含该载体的宿主细胞；产生该抗体的方法，它包括培养该宿主细胞从而表达核酸，以及任选地从宿主细胞培养物(如从宿主细胞培养液中)中回收抗体。本发明还提供了一种组合物，它含抗VEGF抗体和药学上可接受的载体或稀释剂。用于治疗的组合物是灭菌的并且可以是冻干的。本发明还提供了治疗与血管生成异常相关疾病的方法，特别是与VEGF信号通路相关联的血管生长增加，而导致、加剧、或以其他形式相关联的状态。这些状态包括由依赖于新生血管才能生长的肿瘤，眼部疾病例如湿性AMD，以及炎症状态例如类风湿性关节炎、牛皮癣、硬皮病、慢性阻塞性肺部疾病，或哮喘。

本文的术语“治疗”指治疗性处理和预防性或防御性措施。需要治疗者包括已经患病以及要预防疾病的生物。

“抗体(Ab)”和“免疫球蛋白(Ig)”是有相同结构特征的糖蛋白。抗体表现出对特异抗原的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和缺少抗原特异性的抗体样分子。后一类多肽可由例如淋巴***低水平地产生，而由骨髓瘤高水平地产生。

“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”是约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(V_H)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(V_L)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。据信特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中被称为高变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区(分别是FR1、FR2、FR3和FR4)，它们大致上呈β-折叠构型，由三个高变区相连。这些高变区形成连接β折叠结构的环并且在某些情况下是β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的高变区一起形成了抗体的抗原结合部位(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological of Immunological Interest, (5th), Public HealthService, NIH,Bethesda, MD (1991)), pp:647-669)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应子功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

如本文所用，术语“高变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”即“CDR”的氨基酸残基和/或来自“高变环”的残基(即以及重链可变区的残基)。

木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个片段有单个抗原结合位点)以及一个残余的“Fc”片段(该名称反映了其容易结晶的能力)。用胃蛋白酶处理产生了一个F(ab' )2片段，该片段有两个抗原结合位点，并仍能与抗原交联。

Fab片段还含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于，在重链CH1区的羧基端多几个残基(包括来自铰链区的一个或多个半胱氨酸)。F(ab' )2抗体片段最初是以Fab'片段对的形式产生的，在其间有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联方式也是已知的。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为kappa(κ)和lambda(l))中的一类。

根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG4、IgA-1和IgA-2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为a,d,e,g和m。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

术语“抗体”被最广义地使用，并且具体地包括：单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性即可。

“抗体片段”包括完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab') ²和Fv片段；二体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一抗体获得的抗体，即该群体中包含的各抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变之外。单克隆抗体是高特异性的，针对单个抗原位点。而且，与常规的(多克隆)抗体制剂(它通常是包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性——即从基本均一的抗体群中获得的，而不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可用杂交瘤方法(Köhler G等, Nature,1975, 256:495)制得，或可用重组DNA方法(例如参见美国专利No.4,816,567) 制得。“单克隆抗体”还可利用例如Clackson T等, Nature, 1991, 352:624-628; Marks JD等, J Mol Biol, 1991,222:581-597)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离得到的。

单克隆抗体在此特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与某一特定物种的抗体对应序列相同或同源，或是属于特定的抗体类别或亚类，而链的其余部分则与另一物种的抗体对应序列相同或同源、或是属于另一种抗体类别或亚类，以及这种抗体的片段，只要该片段具有所需的生物活性即可(美国专利No.4,816,567和Morrison SL等, Proc Natl Acad Sci USA, 1984,81:6851-6855)。

“人源化”形式的非人(如鼠)抗体是嵌合的抗体，它们含有非人免疫球蛋白的最小序列。对于大多数情况，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者高变区残基被非人源(供者抗体)(例如有所需特异性、亲和力和活性的小鼠、大鼠、兔或非人灵长动物抗体)的高变区残基所代替。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基可被对应的非人残基代替。另外，人源化的抗体可包括既不存在于受者抗体、又不存在于供体抗体的残基。这些修饰能进一步提高抗体的性能。通常，人源化抗体包含了基本上所有的(至少一个、通常两个)可变区，其中所有或基本上所有的高变区对应于非人免疫球蛋白的高变区，而所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体最好还包括免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白)恒定区(Fc)的至少一部分。更详细的情况可参见如下引用文献(JonesPT等, Nature,1986, 321:522-525)。

“分离的”抗体是经鉴定的和分离和/或回收自其天然环境组份的抗体。其天然环境中的污染组份是指会干扰所述抗体的诊断或治疗性用途的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质类或非蛋白质类溶质。在优选实施方案中，抗体纯化至(1)经Lowry法测定，按重量计抗体纯度高于95%，最好高于99%，(2)其纯度足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个N末端残基或内部氨基酸序列，或者(3)用Coomassie蓝或最好用银染色法，经还原或非还原条件下SDS-PAGE测定时达到均质。分离的抗体包括存在于重组细胞内的原位抗体，因为该抗体天然环境的至少一种组份是不存在的。但是，通常，分离的抗体是经至少一步纯化步骤制备的。

术语“标记的”在此表示抗VEGF抗体被融合于“标记”。所述标记可以是“表位标记”(印itope tag)，它应具有足够的残基来形成可产生其对应抗体所需的表位，但又短到不至于影响VEGF抗体的活性。表位标记宜具有相当的独特性，以致针对其的抗体基本上不与其它表位交义反应。适宜的标记多肽一般具有至少6个氨基酸残基，一般介于约8至50个氨基酸残基(以约9至30个残基为宜)。例子包括Flu HA标记多肽及其抗体12CA5 (Field J等，Mol Cell Biol, 1988,8:2159-2165)；c-myc 标记及其抗体8F9、3C7、6E10、G4、B7 和 9E10(Evan GI等，Mol Cell Biol,1985, 5:3610-3616)；和单纯性疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记及其抗体(Paborsky LR等, Protein Eng,1990,6:547-553)。在某些例子中，表位标记是“补救受体结合表位”。如本文所述，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位，它负责提高IgG分子在体内血清半衰期。

本发明中提供的抗体可与多种缀合物偶联或关联或联用（参见ConjugateVaccines, Contributions to Microbiology and Immunology, JM Cruse等, Carger Press, New York,1989)。这些缀合物与所述抗体的连接可通过共价键、亲和结合、夹入(intercalation)、协同结合、复合、关联、混合或添加等，以及其他方法。某些实施方式中，所述的抗体可通过工程化使其含有抗原表位结合部位以外的特定位点，这些位点可被用于结合一种或多种缀合物。例如， 这种位点可包括一种或多种反应性氨基酸残基，例如半胱氨酸或组氨酸残基，以促使其与某缀合物形成共价连接。在某些实施方式中，所述抗体可间接连接于某缀合物，或通过另一个缀合物连接。例如，所述抗体可与生物素缀合，然后间接缀合至另一种亲和素缀合的缀合物。

在某些实施方式中，与公开的抗体相连或联合使用的缀合物可包含一种或多种物质，这些物质旨在改变所述抗体的一种或多种药物代谢性质(PK)，例如聚乙二醇(PEG)可增加所述抗体的半衰期或降低其免疫源性(Katre NV等, J Immuno, 1990, 144(1): 209-213)。

本发明的抗体还可以与细胞毒剂联合。术语“细胞毒剂”在此指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素(例如I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、和 Rel⁸⁶)、化疗剂和毒素(例如来自细菌、真菌、植物或动物的酶活毒素或其片段)。

本发明的抗体还可以与化疗剂联合。“化疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化疗剂包括例如阿霉素(Adriamycin)、阿霉素(Doxorubicin)、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷 (Ara-C)、环磷酰胺、塞替派、白消胺、细胞毒素、红豆杉醇、甲氨蝶呤、顺氯铵钼、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊甙、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞宾、卡钼、替尼泊甙、道诺霉素、洋红霉素、氨基蝶呤、放线菌素D、丝裂霉素、Esperamicins (参见美国专利No. 4,675,187)、美法仑以及其它相关的氮芥。

词语“标记”在此指直接或间接与抗体偶联的可检测化合物或组合物。标记自身可以被检测到(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者，如果是酶标记，它们可催化化合物或组合物底物发生可检测的化学转变。

“固相”指本发明抗体可吸附于其上的非液态基质。固相的例子在此包括：部分或完全由玻璃(例如可控多孔玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷构成的固相。在某些实施方案中，根据上下文，固相可能包括测试板的孔；而在其它实施方案中，可能是纯化柱(例如亲和色谱柱)。该术语还包括分散的颗粒构成的不连续固相，如美国专利No. 4,275,149中所述的。

“分离的”核酸分子是经鉴定的，并且与通常与之相伴存在于该抗体核酸天然来源中的至少一种污染核酸分子分离的核酸分子。分离的核酸分子不是其天然形式或处于其天然环境中。所以，分离的核酸分子与存在于天然细胞内的核酸分子在形式上是不同的。但是，分离的核酸分子包括正常表达抗体的细胞内所含的核酸分子，例如，该核酸分子可以位于不同于天然细胞内的某个染色***置上。

术语“调控序列”指在特定的宿主微生物内表达与之可操作性连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适合原核细胞的调控序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知，真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和加强子。

当与另外的核酸序列形成功能关联的时，核酸是“操作性相连的”。例如，前序列(presequence)或分泌性前导序列的DNA是与多肽的DNA操作性相连的，如果它被表达成参与多肽分泌的前蛋白原(preprotein)；启动子或增强子是与编码序列操作性相连的，如果它影响序列的转录；或者，核糖体结合位点是与编码序列操作性相连的，如果它的位置能够促进翻译。通常，“操作性相连”指相连的DNA序列是毗邻的，而在分泌性前导序列情况下，是毗邻的并处于同一阅读框下。然而，增强子不必毗邻。可通过方便的限制性位点处的连接来实现相连。如果这样的位点不存在，则可按常规实践采用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

在本文中，“细胞” “细胞系”和“细胞培养物”是互换使用的，而且所有这些名称都包括子代。所以，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代细胞及其衍生的培养物(不论传代多少次)。还应理解，由于有意或无意的突变，所有子代也许在DNA内容上并不精确相同。它包括了筛选出的，具有与原始转化细胞相同功能或生物活性的突变型子代。当采用不同的命名时，可以从上下文中明显看出。

为了便于保存，可以通过将具有要求纯度的抗体与任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，制成冻干制剂或水溶液形式的抗体治疗用制剂(《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)第16 版, Osol A编(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用剂量和浓度对接受者是无毒的，它们包括例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸的缓冲液；包括维生素C和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苄基铵、氯化己烷双胺、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、苯酚、丁醇或苄醇、对羟苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环已醇、3-戊醇和间甲苯酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白、亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖或其它糖，其中包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海 藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物) 和/或非离子表面活性剂，例如吐温, Pluronics或聚乙二醇。

本发明制剂还可以包含一种以上治疗特殊状况所需的活性混合物，它们最好具有互补的活性但是不相互产生负影响。所述分子，以适合各自预定目的所需的有效含量相互组合。

活性成份还可以包裹在分别通过凝聚法或界面聚合法制备的例如羟甲基纤维素或明胶胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊中。亦可在胶态药物释放***(例如脂质体、白蛋白微珠、微乳液、毫微颗粒和毫微胶囊)或粗滴乳液(macroemulsion) (《雷明顿药物科学》(Remington, Pharmaceutical Sciences)第16版, Osol A编(1980))中叙述了此类技术。

用于体内使用的制剂必须是无菌的。通过灭菌滤膜过滤可以方便地做到这一点。

可以制备缓释制剂。合适的缓释制剂包括例如包含所述抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质体，所述的基质体是有形的物体，例如膜或微胶囊。合适的缓释基质体包括例如聚酯、水凝胶(例如聚甲基丙烯-2-羟基乙酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利No. 3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸二乙酯的共聚物、非降解性乙烯乙酸乙烯酯、诸如LupronDepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和leuprolideacetate组成的可注射微球)之类可降解乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。诸如聚乙烯/乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之类聚合物能够使分子释放持续100天以上，有些水凝胶可在较短的时间内释放蛋白质。当胶囊化的抗体在体内保留较长时间时，它们可能会因为在37°C接触水分而变性或凝聚，结果造成生物活性降低并可能造成免疫原性改变。根据有关的机制可以设计出合理的稳定化策略。例如，如果发现凝聚机制是通过硫-二硫键互换反应而形成了分子间的S-S键，稳定化可以是通过修饰巯基残基、冻干酸性溶液、控制含水量、使用合适的添加剂和设计特殊的聚合基质组合物而达到。

本发明的抗体可以用作亲和纯化试剂。在这种方法中，抗体利用本领域公知的方法固定在例如Sephadex树脂或滤纸的固相上。被固定的抗体与待纯化的含VEGF的样品接触，然后用合适的溶剂洗涤载体，所述的溶剂能够基本上去除样品中除了与固定化抗体结合的人VEGF之外所有其它物质。抗人VEGF抗体还可以用于VEGF的诊断性分析中，例如检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。这种诊断方法可用于诊断自身免疫疾病等的病因。

用于诊断时，抗体通常用可检测分子进行标记。有许多标记可以使用，它们可以大致如下分类：

(a)放射性同位素，例如³⁵S、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I。可以利用例如《现代免疫学方法》(Current Protocols in Immunology)第1和第2卷, Coligen等编, ffiley-Interscience, New York, Pubs. (1991))中所述的方法以放射性同位素来标记抗体，放射性可以利用闪烁计数法来测定。(b)荧光标记，例如稀土螯合剂(铕螯合剂)或萤光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，丽丝胺，藻红素和德克萨斯红。荧光标记可以利用例如上文《现代免疫学方法》中所述的方法与抗体偶联。荧光可以利用荧光计来定量。

(c)有各种酶底物标记可供使用，而美国专利No.4,275,149公开了其中部分。所述的酶通常催化可以用各种技术测定的生色底物的化学改变。例如，酶催化底物的颜色变化，这种变化可以用分光光度计来测定。或者，酶改变底物的荧光性或化学发光性。前文已经说明了定量测定荧光变化的技术。化学发光底物因化学反应而被电激发，并由此发光，发出的光可以被测定(例如利用化学光度计)或向荧光受体供能。酶标记包括例如萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,37,456)、萤光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮(2,3-dihydrophthalazinediones)、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。

酶-底物的组合包括，例如：

(i) 辣根过氧化物酶(HRP)和作为底物的氢过氧化物酶，其中的氢过氧化物酶使染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或盐酸3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB))氧化；

(ii) 碱性磷酸酶(AP)和作为生色底物的对硝基苯磷酸；

(iii) β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和生色底物(例如对硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-methylumbelliferyl-β-D-半乳糖苷酶。

对本领域技术人员来说还有许多其它酶-底物组合。对这些组合的综述可参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。有时，标记物与抗体间接偶联。技术人员也知道各种获得所述组合的方法。例如，抗体可以与生物素偶联，上述三大类标记中的任何一种都可以与亲和素偶联，或者正相反。生物素选择性地结合亲和素，标记可以间接方式与抗体偶联。或者，为了将标记与抗体间接偶联，抗体可以与小的半抗原(例如地高辛)偶联，而上述不同类型的标记之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)偶联。这样就获得的标记与抗体的间接偶联。

在本发明另一实施方案中，抗人VEGF抗体不必被标记，其存在可以利用标记过的结合该人VEGF抗体的抗体来检测。本发明抗体可以用在任一种已知的分析方法中，例如竞争性结合分析，直接或间接夹心分析和免疫沉淀分析(参见Zola等编,MonocloneAntibodiesi Manual of Techniques, CRC Press, Inc.,1987, pp.147-158)。竞争性结合分析依赖于标记过的标准物与被测样品中分析物竞争结合有限量抗体的能力。被测样品中VEGF的量与与抗体结合的标准物的量成反比。为了方便测定被结合标准物的量，通常令抗体在竞争前或竞争后不溶解，这样就可以方便地将与抗体结合的标准物和分析物与未结合的标准物和分析物分离。

夹心分析法涉及使用两种抗体，各自结合待测蛋白不同的免疫原性部位或表位。在夹心分析中，被测样品分析物与固定在固相载体上的第一抗体结合，然后第二抗体与分析物结合，由此形成不溶性三部分复合物。参见美国专利No.4,376,110。第二抗体本身可以是用可检测部分标记过的(直接夹心分析法)，或者利用被可检测部分标记的抗免疫球蛋白抗体来测定(间接夹心分析法)。例如，夹心分析法之一是ELISA，其中的可检测部分是酶。

对于免疫组织化学来说，肿瘤样品可以是新鲜的或者冷冻的或者包在石蜡和以***之类防腐剂固定的。

抗体还可以用于体内诊断分析。通常，以放射性核素(例如¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹⁴C、¹³¹I、¹²⁵I、³H、³²P或³⁵S)标记抗体，使得可以利用免疫闪烁照相术来定位患病部位。

为了方便，本发明抗体可以试剂盒的形式提供，即将预定量的试剂与进行诊断分析的说明书的包装组合在一起。如果抗体是用酶标记的，试剂盒将包含酶所需的底物和辅因子(例如提供可测定的生色团和荧光团的底物前体)。此外，还可能包括其它添加剂，例如稳定剂、缓冲剂(例如封闭缓冲剂或裂解缓冲剂)等。为了使所提供的试剂浓度能使得分析的灵敏度最高，各种试剂的相对量变化很大。具体地说，试剂可以是干粉，通常是冻干粉末形式的，可包括赋形剂在内，它们一经溶解将形成具有合适浓度的试剂溶液。

对于治疗用途，可将上述的在药学上可接受的剂型中的本发明抗-VEGF抗体，用已知方法施用于人。所述方法包括在静脉内(例如静脉注射浓缩药团(bolus)或在一段时间内连续输注)、肌内、腹膜内、脑脊髓腔内、皮下、动脉内、滑膜腔内、鞘内注射、口服、局部或吸入途径使用。抗体还可合适地通过瘤内、瘤周围、损伤部位内、损伤部位周围的途径给药，以发挥局部和全身的治疗效果。腹膜内途径预计特别有用，例如对于治疗卵巢癌。

为了预防或治疗疾病来说，抗体的合适剂量将取决于上述定义的待治疾病的类型、疾病的严重程度和病程、抗体给予是用来预防还是用来治疗、以前的治疗情况、患者病史和对抗体的应答性，以及主治医师的独立判断。抗体适合一次性或系列地给患者使用。

根据疾病的类型和严重程度，不论是一次或多次分开给药，还是连续输注，1微克/公斤至50毫克/公斤(例如0.1-20毫克/公斤)的抗体是给患者使用的最初候选剂量。典型的日剂量或周剂量可在约1微克/公斤-20毫克/公斤或以上，这取决于上述捉到的因素。对于几天或更长时间内的重复给药(这取决于病况)来说，治疗需持续直至疾病症状发生所期望的抑制。但是，也可以使用其它给药方案。所述治疗的进展可以方便地利用常规技术和分析方法来监测。

本发明另一实施方案提供了一种含有用于治疗上述疾病的材料的产品。该产品包括容器和标签。合适的容器包括例如普通瓶、药瓶、注射器和试管。容器可以用各种材料制成，例如玻璃或塑料。容器中含有治疗疾病的有效组合物，并具有一个无菌的出入口(例如容器可以是一个有塞子的静脉输液袋或药瓶，该塞子可用皮下注射针头穿透)。该组合物中的有效成份是抗人VEGF抗体。容器上或与容器相联的标签说明组合物所治疗的特定病症。产品还可以含有另一个容器，其中包含药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、林格氏(Ringer)溶液和葡萄糖溶液。根据商业上的需要或使用者的需要，它还可以包括其它材料，例如其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器、以及附有使用说明的包装说明书。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、抗人VEGF鼠单克隆抗体的制备

以重组人VEGF (hVEGF，购自PEPRO TECH, INC.) 20μg在完全辅佐剂中给四周龄的BALB/c小鼠皮下注射。每三至四星期注射一次，一共五次。最后，并在腹膜内单次注射50μg hVEGF。经血清测试后，鉴定出含有高水平抗rhVEGF抗体血清的小鼠。取出该小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞株相融合。混合5×10⁸ Sp2/0细胞与5×10⁸脾细胞在50%聚乙二醇(PEG，分子量为1450)和5%二甲基亚砜(DMSO)溶液中融合。用Iscove培养基(含有10%胎牛血清，100单位/mL青霉素，100μg/mL链霉素，0.1mM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤和16μg胸苷)来调整脾脏细胞数至7.5×10⁵/mL，以0.2ml加入96孔培养板的孔内。置于37°C，5% CO₂的培养箱内。10天后，取出各孔内的培养基测试其中鼠源抗体对Avastin与hVEGF结合的竞争作用，筛选出与Avastin竞争的阳性孔，其中第8，13和15阳性孔内鼠源抗体对Avastin的竞争作用最为显著（图1）。再将上述含有能够抑制HRP 标记Avastin与hVEGF结合的单克隆抗体的孔内融合细胞进行亚克隆，同样以竞争ELISA方法筛选得到三个高亲和力的鼠单克隆抗体TM12-8-21、TM12-13-31和TM12-15-1，方法同实施例2。再用间接ELISA法测定纯化抗体与hVEGF结合的效价，其中，以hVEGF（PEPRO TECH）包被酶标板，以HRP标记的羊抗鼠IgG的多克隆抗体（JacksonLaboratory）作为检测抗体，其结果示于图2。

实施例2、抗人VEGF鼠源抗体与Avastin抗体的竞争结合测定

以辣根过氧化物酶(HRP, Boehringer Manheim) 标记抗人VEGF的抗体Avastin(Roche)作为试剂。将 rhVEGF (50μL, 0.1μg/mL，购自PEPRO TECH, INC.)包被酶标板(Corning)，室温过夜。弃去包被溶液，用溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)的脱脂奶封闭各孔0.5小时，用含有0.05%吐温(Tween)20的PBS洗孔。然后每孔加入50μL生长培养基(DMEM+5%FBS, Invitrogen)与50μL HRP标记的Avastin抗体(250ng/mL)的混合液。以未标记的Avastin和含抗另一种抗原的非相关抗体(Irrelevant mAb)作为阳性与阴性对照。其中，鼠抗体TM12-8-21和TM12-13-31的竞争结合EC₅₀值分别为0.4μg/mL，即在高达0.4μg/mL浓度时，只能竞争掉约50% Avastin与hVEGF的结合。另一个鼠抗体TM12-15-1的 EC₅₀值为0.1μg/mL (相当于0.67nM)，即在大约0.1μg/mL浓度时，即可竞争掉约50% Avastin与hVEGF的结合，显著优于未标记的Avastin对HRP 标记Avastin的竞争结合能力（EC₅₀值为1μg/mL），即10倍于Avastin与hVEGF的结合能力，结果见图3。

实施例3、TM12-15-1抗体亲和力分析试验

采用生物薄膜干涉技术(BLI)对纯化的鼠单克隆抗体TM12-15-1与抗原的结合亲和力常数进行测定（ForteBio Octet RED&QK***，PALL公司）。多通道平行定量分析浓度梯度设定为：3.125、6.25、12.5、25、50和100nM，分别亲和偶联AMC传感器(Anti-mIgG FcCapture)。亲和力分析动力学拟合曲线见图4，各通道动力学参数测定结果见表1。分析以上数据计算得出亲和力常数（见图5），其结合常数kon值=4.688×10⁵/Ms，解离常数kdis值=1.331×10^-5/s，平衡解离常数K_D值=kdis/kon=2.850×10^-11M（0.0285nM），说明鼠单克隆抗体TM12-15-1针对人VEGF具有极高的结合亲和力，可达到10^-11M数量级。

表1. 鼠单克隆抗体TM12-15-1亲和力测定动力学参数

。

实施例4、克隆TM12-15-1鼠源抗体的重链与轻链

为表达C12-15-1抗体，首先须获得编码抗VEGF鼠源抗体TM12-15-1重链和轻链可变区的DNA片段。用mRNA纯化试剂盒(NEB) 从TM12-15-1小鼠杂交瘤细胞分离出mRNA，以此制备cDNA(SMARTer RACE试剂盒，Clontech)。通过聚合酶链反应(PCR)使用5’-引物混合液(Long (0.4 μM):

5'-ctaatacgactcactatagggc AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'(SEQ ID NO：11，引物1)和

Short (2μM): 5'-ctaatacgactcactatagggc-3'(SEQ ID NO：12，引物2)同3’-引物 5’-catcccagggtcaccatggagtta-3’ (SEQ ID NO：13，引物3) 从cDNA中分离重链可变区DNA片段。 3’-引物与小鼠IgG1重链恒定区同源反义。将这些得到的DNA片段克隆进TOPO TA载体(Invitrogen)（pTOPO-VH）并测序。所有的重链可变区克隆显示同一核苷酸序列(SEQID NO:1)。该核苷酸序列与其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)列于图6，并以下划线标出互补决定区的氨基酸残基CDR-Hl (SEQ ID NO：3)，CDR-H2 (SEQ ID NO: 4)和 CDR-H3(SEQ ID NO: 5) (互补决定区的定义参见Kabat E.等人的Sequences of Proteins ofImmunological Interest 第5版U. S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91-3242)。

以相似的PCR方法，使用SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的5’-引物混合液和另一个与小鼠免疫球蛋白κ 轻链恒定区同源反义的3’-引物5’-gactgaggcacctccagatgttaa-3’(SEQ ID NO:14，引物4)，从 cDNA中分离轻链可变区DNA片段。将这些得到的DNA片段克隆进TOPOTA载体（pTOPO-Vκ）并测序，得到编码TM12-15-1小鼠杂交瘤轻链的可变区序列。其核苷酸序列（SEQ ID NO:6）与其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)列于图7，并以下划线标出互补决定区的氨基酸残基CDR-Hl (SEQ ID NO：8)，CDR-H2 (SEQ ID NO: 9)和 CDR-H3 (SEQID NO:10)。

实施例5、抗体C12-15-1表达载体的构建

嵌合基因是用TM12-15-1鼠源抗体的重链与轻链可变区基因分别与人IgG1的重链恒定区及κ轻链恒定区基因连接而成的，可采用全人工合成的方法获得，再用DNA测序验证该基因的序列。将得到的重链与轻链嵌合基因分别***适当的载体，用以表达抗体。

将此重链嵌合基因与轻链嵌合基因分别***哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen) 接受载体，用以表达抗体的轻链蛋白。表达载体质粒含有在哺乳动物细胞中高水平表达所需的巨细胞病毒早期基因启动子-增强子。用以表达轻链抗体蛋白的质粒含有可选择性标记基因，从而在细菌中赋予氨苄青霉素抗性，而在哺乳动物细胞中赋予G418抗性。另外，用以表达重链抗体蛋白的质粒含有DHFR基因，在合适的宿主细胞中，能以氨甲蝶呤(MethOtrexate，MTX，Sigma)共扩增抗体基因和DHFR基因(参见，美国专利5,179,017号; Kaufman R等, J Mol Biol, 1982, 159 601-621)。

实施例6、C12-15-1抗体的表达

将上述含有编码重链和轻链基因的重组表达载体质粒(pcDNA-3，Invitrogen)转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达抗VEGF的C12-15-1抗体。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞(CHO) (美国专利4,818,679号)。优选的转染方法是电穿孔，也可以使用其他方法，包括磷酸钙共沉降、脂转染和原生质融合等。在电穿孔中，用设为250V电场和 960 uFd电容的Gene Pulser (Bio-RadLaboratories)，在比色杯内加入2×10⁷个细胞悬浮在0. 8ml的PBS中，并含有10μg用PvuI (Takara)线性化的表达载体质粒。转染2天后，加入含有0.5mg/mL G418以及200nM氨甲蝶蛉(methotrexate或MTX)。为了实现较高水平的表达，用受MTX药物抑制的DHFR基因共扩增转染的抗体基因。用极限稀释法亚克隆转染子。测定各细胞系的分泌率。选出高水平表达C12-15-1抗体的细胞株。收集含有C12-15-1抗体的条件培养基，用于与Avastin抗体的竞争结合测定和体外中和hVEGF的活性测定。

实施例7、C12-15-1抗体的定性

抗人VEGF嵌合抗体hC12-15-1的定性有两种测定法。一种方法是分别测定嵌合抗体C12-15-1与Avastin对hVEGF的竞争结合，另一种方法是测定嵌合抗体C12-15-1在体外抑制HUVEC细胞增殖测定中和hVEGF的能力。下文中分别对这两种方法及其实验结果进行了描述。

6.1、与Avastin抗体的竞争结合测定

以HRP标记抗人VEGF的抗体Avastin (Roche)作为试剂。将 hVEGF (100 μL, 0.1μg/mL)包被酶标板，室温过夜。弃去包被溶液，用溶解在磷酸盐缓冲盐水的脱脂奶封闭各孔0.5小时，用含有0.05%吐温)20的PBS洗孔。然后每孔加入50 μL生长培养基(DMEM+5% FBS,Invitrogen)与50μL HRP标记的Avastin抗体(250ng/mL)的混合液。以未标记的Avastin和含抗另一种抗原的非相关抗体(Irrelevant mAb)作为阳性与阴性对照。图8显示在此竞争结合测定中，C12-15-1抗体的EC₅₀值约为0.07μg/mL，即在低至0.07μg/mL浓度时，即可竞争掉约50% Avastin与hVEGF的结合，显著优于未标记的Avastin对HRP 标记Avastin的竞争结合能力（EC₅₀值为1μg/mL），即其与hVEGF的结合能力约为Avastin的14倍。

6.2、体外抑制内皮细胞增殖分析

在内皮细胞基本培养基(DMEM, Sigma)中，加入10%胎牛血清(购自Sigma)和生长因子(BulletKit，Lonza)，配制成内皮细胞生长培养基。当人脐静脉内皮细胞(HUVEC，ATCC，Cat No：CRL-1730)生长到致密单层时，以5×10³细胞/孔的密度接种于96孔板中，此时的分析培养液不加入生长因子。阳性对照抗体为Avastin，人源化VEGF抗体按一定稀释梯度加入，孵育1h后，加入hVEGF使其终浓度为10ng/mL。37°C，5% CO₂培养箱培养4天后，每孔中加入10μL MTT (Invitrogen)继续培养24h。在激发波长540nm和发射波长620nm时，利用酶标仪测定细胞的增殖情况。每个处理设3次重复，每个重复测定两次。

结果见图9，在hVEGF有效浓度下，抗体对人脐静脉内皮细胞的增殖有较好的抑制作用，阳性对照抗体Avastin在三个剂量组（20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL）中对HUVEC细胞增殖的抑制率分别为28.4%，14.5%和13.9%，而嵌合抗体TM12-15-1对HUVEC细胞增殖的抑制率分别为58.5%，46.1%和26.2%，说明嵌合抗体TM12-15-1比对照抗体Avastin抑制内皮细胞增殖的作用显著，并均呈剂量依赖性。

综上所述，本发明的抗人hVEGF嵌合抗体具有与Avastin抗体相当的免疫效力，并且与人VEGF的结合亲和力更高、具有更高的特异性。

虽然说明并描述了本发明的优选例，应理解本领域的技术人员可根据本文的教导，作出各种改变，这些改变不违背本发明的范围。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 安源生物科技（上海）有限公司

<120> 抗人VEGF的重组嵌合抗体及其制备方法和用途

<130> 2014.12.15

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 360

<212> DNA

<213> 抗体重链可变区核苷酸序列

<400> 1

gaggtccagc tccagcaatc cggccccgag ctggtcaagc ctggagcttc cgtgaagatg 60

agctgcaagg cctccggcta caccttcacc aacttcgtga tccactgggt gatccagaag 120

cccggccagg gactggagtg gttcggctat atcaacccct acaacgacga caccaaatac 180

aacgagaaat tcaagggcaa agctcggctg acctccgaca agagcagccg gacagcctac 240

atggaactgt cctccctgac ctccgaggac agcgctgtgt tttactgcgc tatcagcagc 300

gacggctacc acggctggtt tgcttactgg ggacagggca ccctcgtgac agtgagcgcc 360

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 抗体重链可变区氨基酸序列

<400> 2

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe

20 25 30

Val Ile His Trp Val Ile Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Phe

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Arg Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Ser Ser Asp Gly Tyr His Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 抗体重链CDR-H1氨基酸序列

<400> 3

Asn Phe Val Ile His

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 抗体重链CDR-H2氨基酸序列

<400> 4

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 抗体重链CDR-H3氨基酸序列

<400> 5

Ser Ser Asp Gly Tyr His Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 336

<212> DNA

<213> 抗体轻链可变区核苷酸序列

<400> 6

gacgtgctga tgacacagcc tcctctcagc ctccctgtct ccctgggaga ccaagcctcc 60

atctcctgcc ggagcgacca atccatcgtc cacagcaacg gccacaccta cctcgagtgg 120

tacctccaaa agcccggcca aagccccaag ctgctcatct acaaggtgag caaccggttc 180

agcggagtcc ccgacaggtt ttccggatcc ggctccggaa ccgacttcac cctgaaaatc 240

agcagggtgg aggccgagga tctgggcctc tactactgct tccaaggatc ccacgtgccc 300

ttcaccttcg gctccggcac caagctggag attaag 336

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 抗体轻链可变区氨基酸序列

<400> 7

Asp Val Leu Met Thr Gln Pro Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asp Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly His Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 抗体轻链CDR-L1氨基酸序列

<400> 8

Arg Ser Asp Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly His Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 抗体轻链CDR-L2氨基酸序列

<400> 9

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 抗体轻链CDR-L3氨基酸序列

<400> 10

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr

1 5

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 引物1

<400> 11

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物2

<400> 12

ctaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物3

<400> 13

catcccaggg tcaccatgga gtta 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物4

<400> 14

gactgaggca cctccagatg ttaa 24

Claims (18)

1.一种与人血管内皮生长因子结合的嵌合抗体或其抗原结合片段，其含有一重链可变区，所述重链可变区包含以下重链CDR氨基酸序列：SEQ ID NO：3，SEQ IDNO：4，和SEQ IDNO：5。

2.如权利要求1所述嵌合抗体或其抗原结合片段，其还含有一轻链可变区，所述轻链可变区含有以下轻链CDR氨基酸序列：SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，和SEQ ID NO：10。

3.如权利要求1所述嵌合抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区含有如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

4.如权利要求2所述嵌合抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区含有如SEQ IDNO：7所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述嵌合抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定区序列为人IgGl的重链恒定区。

6.如权利要求2所述嵌合抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区序列为人κ抗体轻链恒定区序列。

7.如权利要求1-6任一项所述嵌合抗体或其抗原结合片段，其中所述嵌合抗体或其抗原结合片段与hVEGF₁₆₅结合的K_D值为≤0.1nM。

8.如权利要求7所述嵌合抗体或其抗原结合片段，其中所述嵌合抗体或其抗原结合片段与hVEGF₁₆₅结合的K_D值为0.01nM。

9.一种核酸，其包含编码根据权利要求1至8中任一项权利要求所述嵌合抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

10.一种载体，其包含根据权利要求9所述的核酸。

11.一种原核宿主细胞，其经根据权利要求10所述的载体转化。

12.一种真核宿主细胞，其经根据权利要求10所述的载体转化。

13.根据权利要求12所述的真核宿主细胞，其为哺乳动物细胞。

14.一种产生权利要求1-8任一项所述嵌合抗体或其抗原结合片段的方法，其包含：(a)培养根据权利要求12或13所述真核宿主细胞及(b)回收所述嵌合抗体或其抗原结合片段。

15.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有根据权利要求1至8任一项权利要求所述嵌合抗体或其抗原结合片段以及药物学上可接受的载体。

16.权利要求15所述药物组合物在制备用于治疗结肠转移癌、直肠转移癌、非鳞状非小细胞肺癌、转移性HER2阴性乳癌、肾细胞癌、卵巢癌、胃肠道癌、骨肿瘤、***癌或肝癌的药物中的用途。

17.权利要求15所述药物组合物在制备用于治疗老年黄斑变性、视网膜静脉阻塞或糖尿病性视网膜病变的药物中的用途。

18.权利要求15所述药物组合物在制备用于治疗类风湿性关节炎、牛皮癣、硬皮病、慢性阻塞性肺部疾病或哮喘的药物中的用途。