CN104548209A - 一种组织工程表皮及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于组织细胞学和组织工程学领域，公开了一种带有真皮细胞的组织工程表皮及其制备方法。该带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法包括：获得表皮细胞；接种所得表皮细胞，用表皮培养基培养至密度达到80％-100％，之后，更换为混合培养基，培养16h-24h，收集表皮细胞层，得组织工程表皮片；转移所得组织工程表皮至半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布上，得带有表皮细胞层的膜；培养真皮细胞，将所得真皮细胞铺在所得带有表皮细胞层的膜的表皮细胞层之上，培养1h-2h，即得。发明提供的制备方法操作简单，周期短，可以与受体自身皮肤组织相互刺激和诱导、促进受体完整表皮结构的形成。

Description

一种组织工程表皮及其制备方法

技术领域

本发明属于组织细胞学和组织工程学领域，特别涉及一种带有真皮细胞的组织工程表皮及其制备方法。

背景技术

皮肤是人体面积最大的器官，承担着保护身体、排汗、感觉冷热和压力等功能，使体内各组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物的侵袭。遗传疾病、烧烫伤、慢性皮肤创伤(如糖尿病)、白癜风、白化病等很多原因会对皮肤造成损害，影响皮肤美观、使皮肤留下疤痕甚至失去生理功能。当皮肤受到严重损害，如深度的大面积烧烫伤时，皮肤不能再进行自我恢复，会失去对细菌的抵御作用，导致大量细菌通过皮肤侵入人体，极易引发全身感染而导致死亡。

目前，最普遍的治疗皮肤烧烫伤的方法是采用手术移植人体自身其他部位没有损伤的皮肤至烧烫伤处，但是这种方法有很大局限性，具体体现在：首先，当皮肤大面积烧伤时，人体自身的正常皮肤来源有限；其次，移植后的皮肤存活率低，这也是临床上皮肤移植面临的重大挑战。

因此，利用体外培养技术来扩增皮肤细胞，在体外构建出组织工程皮肤，并通过组织工程皮肤移植来治疗皮肤创伤具有重要的意义。长期以来，皮肤学专家和皮肤科医生一直致力于具有生理功能的人类皮肤的再生研究。组织工程表皮早在20多年前就用于大面积烧伤的治疗，对提高烧伤病人的成活率起着重要作用，但普通的组织工程表皮产品移植到人体后有很多局限性，如表皮易起水泡不平整、表皮容易过度增生，而且因为没有真皮细胞通常会造成疤痕的收缩，不能形成真正具有完整生理功能的皮肤。因此，目前人工组织表皮除了用于临时覆盖伤口降低死亡率之外，在临床上的应用还比较少。近几年组织工程全程皮(包含表皮和真皮)，即在体外用培养的表皮和真皮细胞结合胶原蛋白而形成的，引起了人们的重视。越来越多的此类产品进入临床应用于创伤愈合，并且获得了较好的疗效。然而，目前的组织工程全层皮的制备方法复杂，需要较长时间的培养才能形成皮肤结构，严重限制了其推广和应用。另外人工真皮在临床上也有应用，但由于不带有活性细胞而且没有表皮部分形成不了正常的皮肤，造成其应用的局限性。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种带有真皮细胞的组织工程表皮及其制备方法。本发明提供的带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法简单、周期短，所得组织工程表皮可以与受体自身皮肤组织相互刺激和诱导、促进受体完整表皮结构的形成，可以形成带有毛发、皮脂腺、皮下脂肪等功能性的完整皮肤。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明提供了一种带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：获得表皮细胞；

步骤2：接种所得表皮细胞，用表皮培养基培养至密度达到80％-100％，之后，更换为混合培养基，培养16h-24h，收集表皮细胞层，得组织工程表皮片；所用混合培养基包含胎牛血清、DMEM培养基和F12培养基；

步骤3：转移所得组织工程表皮至半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布上，得带有表皮细胞层的膜；其中，表皮细胞层的分化细胞层与半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布接触；

步骤4：培养真皮细胞，将所得真皮细胞铺在所得带有表皮细胞层的膜的表皮细胞层之上，培养1h-2h，即得；

其中真皮细胞为从皮肤真皮中分离的真皮细胞或所述从皮肤真皮中分离的真皮细胞和黑色素细胞的混合物。

在本发明中，真皮细胞为从皮肤真皮中分离的真皮细胞中的一种或几种，其包含真皮成纤维细胞、成纤维细胞前体细胞、脂肪及脂肪前体细胞、毛***细胞、血管内皮细胞；或者从皮肤真皮中分离的真皮细胞中的一种或几种细胞和黑色素细胞的混合物。

本发明通过发明人大量的创造性劳动，意外发现在获得表皮细胞层之后，将表皮细胞层转移到半渗透性聚合物、或硅胶膜底物、或凡士林纱布上，获得带有表皮细胞层的膜，最后，加入真皮细胞通过较短时间的孵育，使真皮细胞完全附着表皮细胞，即得到了带有真皮细胞的组织工程表皮。本发明提供的制备方法简单、周期短，且所得组织工程表皮能够与受体自身皮肤组织相互刺激和诱导、促进受体完整表皮结构的形成。实验结果证实，当真皮细胞为真皮成纤维细胞与黑色素细胞的混合物时，所得的带有真皮细胞的组织工程表皮在移植动物之后，能够形成完整的皮肤结构，具有成熟毛囊、汗腺、皮脂腺，且具有自身愈合能力。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中的真皮细胞具体为从皮肤真皮中分离的真皮细胞中的一种或几种细胞和黑色素细胞的混合物。

优选地，本发明提供的制备方法中，步骤1中表皮细胞的制备方法为：

取皮肤组织，用中性蛋白酶孵育10h-20h，之后分离表皮，得表皮；

取所得表皮，切碎后，用胰酶酶解，收集，即得表皮细胞。

在本发明中，表皮细胞的来源不受本发明提供的制备方法的限制，本领域技术人员能够根据实际情况购买或者制备表皮细胞。本发明中所用到的皮肤组织可以是任何皮肤组织，例如胚胎、新生儿或成人的任何皮肤组织。在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，所用到的皮肤组织为成人***组织。

优选地，本发明提供的制备方法中，步骤2中的接种之前，还包括表皮细胞的传代培养；

接种所用的表皮细胞为P1代表皮细胞、P2代表皮细胞或P3代表皮细胞。

在本发明中，P1代细胞为原代分离的细胞传过1代之后的细胞；P2代细胞为原代分离的细胞传过2代之后的细胞；P3代细胞为原代分离的细胞传过3代之后的细胞。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)：表皮细胞分离：

(1-a)采集含有表皮的皮肤组织；

(1-b)将所述皮肤组织消毒后用含双抗的磷酸盐缓冲液冲洗；

(1-c)将所述冲洗后的皮肤组织切成长条状，浸没于中性蛋白酶酶液中，0℃-4℃消化孵育12h-20h；

(1-d)分离所述消化孵育后的长条状皮肤组织，收集表皮部分，得表皮，切碎成粘稠状，制得表皮匀浆；

(1-e)将所述表皮匀浆置于含胰酶的磷酸盐缓冲液中在37℃下消化25分钟-35分钟，制得表皮细胞悬液；

(1-f)向所述表皮细胞悬液中加入含胎牛血清的DMEM培养基，中和表皮细胞悬液；

(1-g)过滤中和后的表皮细胞悬液，离心、收集沉淀，得表皮细胞；

步骤(2)：所述表皮细胞的传代培养：

将所述表皮细胞作为初始细胞，接种，培养至密度达80％－100％，进行传代；

所述传代操作具体包括：

(2-a)将培养至密度达80％-100％的表皮细胞用磷酸盐缓冲液洗去残留的血清后，浸没于含乙二胺四乙酸的胰酶酶液中，在37℃下消化5分钟－15分钟；

(2-b)在显微镜下观察，当表皮细胞从培养板中脱落后，向其酶液中加入含胎牛血清的DMEM培养基中和后，离心，收集沉淀；向所述沉淀中加入含双抗的F12培养基重悬细胞后，离心分离，收集沉淀，得原代表皮细胞；

(2-c)将所述原代表皮细胞按1:2-3的比例传代，所述传代次数为1代-5代；

步骤(3)：组织工程表皮片培养：

(3-a)铺所述P1代表皮细胞、所述P2代表皮细胞或所述P3代表皮细胞到细胞培养皿中，铺板密度在50％-80％，然后加入表皮培养基培养；每隔一天更换新的所述表皮培养基；

(3-b)当细胞密度达80％-100％后，将表皮培养基换成混合培养基；所述混合培养基含胎牛血清、DMEM培养基和F12培养基；

(3-c)培养16-24小时后，用磷酸盐缓冲液冲洗，之后浸没于中性蛋白酶酶液中，在37℃下培养30分钟-45分钟，至表皮细胞成片分离下来，收集表皮细胞层，得组织工程表皮片；

步骤(4)：所述组织工程表皮片转膜并结合真皮细胞：

(4-a)用含胎牛血清的DMEM培养基反复清洗所述组织工程表皮片；

(4-b)将所述清洗后的组织工程表皮片的基底细胞表面向下放置，将半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布放置在所述组织工程表皮片上面，之后将所述组织工程表皮片的边缘提起贴附在所述半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布上，使表皮细胞层的分化细胞层表面紧贴在半渗透性聚合物透气性半渗透性聚合物、或硅胶膜底物、或凡士林纱布上，制得带有表皮细胞层的膜；

(4-c)培养真皮细胞，将所得真皮细胞铺在所述带有表皮细胞层的膜的表皮细胞层之上，然后在37℃下培养1小时-2小时，使真皮细胞上完全附着表皮细胞，即制得带有真皮细胞的组织工程表皮；

其中真皮细胞为从皮肤真皮中分离的真皮细胞或所述从皮肤真皮中分离的真皮细胞和黑色素细胞的混合物。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤(1-c)中的中性蛋白酶酶液的浓度为2.5mg/mL。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，以g/mL计，步骤(1-e)中所用的含胰酶的磷酸盐缓冲液中胰酶的浓度为0.05％；

每5g所述表皮匀浆加入20mL所述含胰酶的磷酸盐缓冲液。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，以体积百分比计，步骤(1-f)中所述含胎牛血清的DMEM培养基中，所述胎牛血清的含量为5％-10％；

向所述表皮细胞悬液中加入与所述表皮细胞悬液体积相同的所述含胎牛血清的DMEM培养基。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤(2)中表皮细胞的培养方法具体为：

将所述表皮细胞置于含Rho激酶抑制剂的CNT-07培养基中重悬得表皮细胞悬液，将所述表皮细胞悬液接到铺有胶原蛋白的培养皿中培养。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤(2-b)中含双抗的F12培养基中的双抗为青霉素和链霉素溶液的混合液；

其中，所述青霉素的浓度为100U/mL，所述链霉素的浓度为100ug/mL。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤(3-b)中的混合培养基中，胎牛血清的体积为DMEM培养基和F12培养基体积之和的0.1％。在本发明的另外一些实施例中，混合培养基中，DMEM培养基和F12培养基的体积比为3:1。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤(4-b)中的半渗透性聚合物为聚对苯二甲酸乙二醇酯膜。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤(4-b)中的半渗透性聚合物具有孔径位3.0μm的透气性孔。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，所述从皮肤真皮中分离的真皮细胞的制备方法为：

取皮肤组织，用中性蛋白酶孵育12h-20h，之后分离真皮，得真皮；

取所得真皮，切碎后，用I型胶原酶酶解，收集，即得真皮细胞。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，当真皮细胞为从皮肤真皮中分离的真皮细胞时，步骤4中培养真皮细胞的方法具体为：

将真皮细胞直接铺板，细胞密度为200-300万/皿，用含20ng/mL表皮生长因子和20ng/mL成纤维细胞生长因子的1:3DMEM/F12混合培养基进行培养，培养温度为30℃-40℃。

在本发明中，表皮细胞和真皮细胞可以来自于同一皮肤组织，也可以来自不同的皮肤组织。本领域技术人员可以根据实际情况选择皮肤细胞、真皮细胞的来源和组合。在本发明的一些实施例中，表皮细胞和真皮细胞来源于同一皮肤组织。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法，包括如下步骤：

(1)表皮细胞和真皮细胞的分离和培养：

(1-a)采集含有表皮和真皮的皮肤组织；

(1-b)将采集的皮肤组织消毒后用含双抗的磷酸盐缓冲液冲洗；

(1-c)将冲洗后的皮肤组织切成长条状，浸没于中性蛋白酶酶液中，冷消化孵育过夜；

(1-d)将孵育过夜的长条状皮肤组织的表皮和真皮分离，并将分离得到的表皮和真皮分别切碎成粘稠状，制得表皮匀浆和真皮匀浆；

(1-e)将表皮匀浆置于含胰酶的磷酸盐缓冲液中在37℃下消化30分钟，消化过程中将聚团的表皮匀浆摇散，制得表皮细胞悬液；将真皮匀浆置于I型胶原酶中在37℃下消化30分钟，消化过程中将聚团的真皮匀浆摇散，制得真皮细胞悬液；

(1-f)向消化完的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中分别加入含胎牛血清的DMEM培养基，中和表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中的酶液；

(1-g)将中和后的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液分别用100μm的过滤筛网过滤后，用离心分离法将表皮细胞和真皮细胞分别从表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中分离出来；

(1-h)将分离得到的表皮细胞和真皮细胞即元代细胞分别接种并用不同培养基中培养；元代细胞培养5-10天达到80％－100％满进行传代。

(2)表皮细胞和真皮细胞传代：

(2-a)将步骤(1-h)中培养得到的表皮细胞和真皮细胞用磷酸盐缓冲液洗去残留的血清后，分别浸没于含乙二胺四乙酸的胰酶酶液中，在37℃下消化5－15分钟；

(2-b)在显微镜下观察，当表皮细胞和真皮细胞全部从培养板中脱落后，向其酶液中加入含胎牛血清的DMEM培养基中和后使用离心分离法分离一次，向分离得到的表皮细胞和真皮细胞中分别加入含双抗的F12培养基重悬细胞后再次使用离心分离法分离；

(2-c)将分离好的表皮细胞按1:2-3的比例传代，真皮细胞按1:5-10比例传代；通常传1-5代进行冰冻保持或用于步骤(3)和4(c)。

(3)组织工程表皮片培养：

(3-a)铺P1或P2或P3的表皮细胞到细胞培养皿中，铺板密度在50-80％，P1细胞为原代分离的细胞传过1代之后的细胞，P2为传过两代的细胞，P3为传过三代的细胞，然后加入表皮培养基(培养，每隔一天更换新的表皮培养基；(3-b)当细胞长满后，将原表皮培养基换成含胎牛血清的3:1DMEM/F12混合培养基；

(3-c)培养16-24小时后，将表皮细胞用磷酸盐缓冲液冲洗后浸没于中性蛋白酶酶液中，在37℃下培养30-45分钟，至表皮细胞成片分离下来形成表皮细胞层；

(4)表皮细胞层转膜并结合真皮细胞：

(4-a)用含胎牛血清的DMEM培养基反复清洗表皮细胞，不要损伤细胞层，每次清洗时留取少量DMEM培养基，使表皮细胞层漂浮于DMEM培养基表面；

(4-b)使清洗后的表皮细胞层基底细胞表面向下放置，将要转移的带有3.0μm透气孔径的半渗透性聚合物(如聚对苯二甲酸乙二醇酯膜)或硅胶膜底物或凡士林纱布放置在表皮细胞层上面，将表皮细胞层的边缘提起贴附在膜上，使表皮细胞层的分化细胞层表面紧贴在膜上，制得带有表皮细胞层的膜；

(4-c)将带有表皮细胞层的膜转移到培养皿中，取步骤(2-c)中培养好的真皮细胞溶于F12培养基或DMEM培养基或其它相似的培养基。后，均匀铺在膜上的表皮细胞层上，然后在37℃下培养1-2小时，使真皮细胞上完全附着表皮细胞，即制得带有真皮细胞的组织工程表皮。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，当步骤(4)中的真皮细胞为从皮肤真皮中分离的真皮细胞和黑色素细胞的混合物时，步骤(4-c)具体为：

将培养好的从皮肤真皮中分离的真皮细胞与黑色素细胞混合后溶于F12培养基中制得细胞悬液后，铺在带有表皮细胞层的膜上的表皮细胞层上，然后在37℃下培养1小时-2小时，使从皮肤真皮中分离的真皮细胞与黑色素细胞完全附着表皮细胞上，即制得带有真皮细胞的组织工程表皮。

本发明具有如下有益效果中的至少一个：

(1)本发明利用体外培养表皮细胞来形成组织工程表皮片，并结合真皮细胞后制得带有真皮细胞的组织工程表皮，所得组织工程表皮可直接用于移植，移植受体为人或者动物。当移植到皮肤创伤部位后，本发明提供的组织工程表皮可与受体自身皮肤组织相互刺激和诱导，促进受体完整表皮结构的形成，最终再生出具有完整功能的皮肤。

(2)本发明提供的带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法操作简单，周期短，更有力于组织工程表皮的制备、推广和应用。

(3)本发明提供的带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法只需获得极少的健康皮肤组织就可以体外增殖出大量的表皮细胞、真皮细胞，进而用于制备带有真皮细胞的组织工程表皮，所得的组织工程表皮不存在免疫排斥反应，大大提高了移植成功率，也缩短了治疗时间。

(4)当采用含有两种或两种以上真皮细胞制备带有真皮细胞的组织工程表皮时，所得的组织工程表皮移植后可以形成带有毛发、和/或皮脂腺、和/或皮下脂肪等功能性的完整皮肤。

(5)本发明提供的带有真皮细胞的组织工程表皮可以用于建立特殊皮肤疾病模型，如牛皮癣、皮肤癌、湿疹、斑秃、表皮水泡病、粉刺、白化病、皮肤老化等，也可以用于开发细胞产品用于临床上治疗白癜风、牛皮癣或皮肤白化病等，为人类多种皮肤疾病的治疗提供了崭新的途径。

附图说明

图1示移植6个月后裸鼠身上再生皮肤和毛发的照片；

图2示图1的再生皮肤的组织切片图。

具体实施方式

本发明公开了一种带有真皮细胞的组织工程表皮及其制备方法。本领域技术人员可以参考本文内容，使用该方法，制备获得该组织工程表皮，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员而言是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法及其应用已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种带有真皮细胞的组织工程表皮及其制备方法中所用到的试剂和原料均可由市场购得。

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此，实施例中的制备方法均为常规制备方法，不再详述。

实施例

带有真皮细胞的组织工程表皮的制备

(1)表皮细胞和真皮细胞的分离和培养：

(1-a)采集胎儿头皮、新生儿***含有表皮细胞和真皮细胞的皮肤组织；(1-b)将采集的皮肤组织用酒精消毒处理3分钟后用含2倍双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)处理2次，每次3分钟，然后将皮肤组织于含1倍双抗的F12培养基中在4℃下保存备用，皮肤组织的保存时间不超过72小时；

(1-c)将皮肤组织从培养基中取出，沥净多余液体，称重并作好记录后切成长条状，均匀铺于100mm培养皿中，向培养皿中加入中性蛋白酶(Dispase)浓度为2.5mg/ml的中性蛋白酶(Dispase)酶液，每5g皮肤组织中加入20ml酶液，使每一块皮肤组织都完全浸没在酶液中，将皮肤组织在4℃下静止孵育过夜；

(1-d)将在中性蛋白酶(Dispase)酶液中孵育过夜的皮肤组织用尖形镊子将表皮从真皮上小心剥离下来，将表皮和真皮分别转入一个新的培养皿中，沥净多余液体，将分离得到的表皮和真皮分别切碎成粘稠状，制得表皮匀浆和真皮匀浆；

(1-e)将表皮匀浆置于含胰酶浓度为0.05％的磷酸盐缓冲液(PBS)中，每5g表皮匀浆中加入20ml上述酶液，在37℃下消化30分钟，消化过程中将聚团的表皮匀浆摇散，制得表皮细胞悬液；将真皮匀浆置于I型胶原酶中，每5g真皮匀浆中加入20ml上述酶液，在37℃下消化30分钟，消化过程中将聚团的真皮匀浆摇散，制得真皮细胞悬液；

(1-f)向消化完的表皮细胞悬液中加入与表皮细胞悬液体积相同的含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，中和表皮细胞悬液中的酶液，吹打20-30次，避免吹出气泡；向消化完的真皮细胞悬液中加入相同体积的含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中和真皮细胞悬液中的酶液，吹打20-30次，避免吹出气泡；

(1-g)将中和后的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液分别用100μm的过滤筛网过滤，过滤过程中用移液管搅动溶液，使其过滤完全，并根据皮肤组织量多少用适量(5-10ml)的含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(含双抗)冲洗过滤器；然后将过滤后的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液置于离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清；再向每个离心管中加入10mL不含双抗的F12培养基重悬沉淀后，1000rpm离心5分钟，将表皮细胞和真皮细胞分别从表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中分离出来，计数并做好记录；

(1-h)将分离得到的表皮细胞置于含10mM Rho激酶抑制剂(RockInhibitor)Y27632的CNT-07培养基中重悬得表皮细胞悬液，将细胞悬液接到铺有胶原蛋白的直径为100mm的细胞培养皿中培养，细胞密度为400-500万/皿；将分离得到的真皮细胞直接铺板，细胞密度为200-300万/皿，用含20ng/ml表皮生长因子(EGF)和20ng/ml成纤维细胞生长因子(FGF)的DMEM/F12(1:1)(Gibco,Cat.#11039)混合培养基中进行培养；培养环境接近人体生理环境，培养温度为35-37℃；

(2)表皮细胞和真皮细胞传代：

(2-a)将步骤(1-h)中培养得到的表皮细胞和真皮细胞用5-10ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗去残留的血清后，置于T75细胞培养瓶中，向培养瓶中加入3ml含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶浓度为0.05％的胰酶酶液中，在37℃培养箱中消化10分钟；

(2-b)在显微镜下观察，当表皮细胞和真皮细胞全部脱落后，每个细胞培养瓶中加入10ml含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中和(可轻柔吹打几次，然后将含有表皮细胞和真皮细胞的酶液中加入含FBS的DMEM中和)，然后将中和后的表皮细胞和真皮细胞溶液分别倒入50ml离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清；再分别加入10ml含双抗的F12培养基重悬细胞，计数，1000rpm离心5分钟，弃上清；

(2-c)将分离好的表皮细胞按1:3的比例传代，真皮细胞按1:6比例传代，表皮细胞培养到第二代，真皮细胞培养到第三代；

(3)组织工程表皮片培养：

(3-a)铺P1或P2或P3的表皮细胞到六孔细胞培养皿中，150万/孔，P1细胞为原代分离的细胞传过一代之后的细胞，P2为传过两代的细胞，P3为传过三代的细胞，加入3ml表皮培养基培养，每隔一天更换新的表皮培养基；

(3-b)当六孔板中每孔细胞长满后，将原表皮培养基换成3ml含0.1％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12(3:1)混合培养基；

(3-c)次日早上，将表皮细胞用1倍磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗一次后，每孔加入3ml中性蛋白酶(Dispase)酶液，放在37℃培养箱中培养30-45分钟，至表皮细胞成片分离下来形成表皮细胞层；

(4)表皮细胞层转膜并结合真皮细胞：

(4-a)将DMEM培养基提前在37℃下温浴30min，然后用温浴后的的DMEM清洗表皮细胞至少2次，不要损伤细胞层，每次清洗留取少量DMEM培养基，使表皮细胞层漂浮于DMEM培养基表面；

(4-b)使清洗后的表皮细胞层基底细胞表面向下放置，将要转移的硅胶膜(Invitrogen)放置在表皮细胞层上面，将表皮细胞层的边缘提起贴附在硅胶膜上，使表皮细胞层的分化细胞层表面紧贴在硅胶膜上，制得带有表皮细胞层的硅胶膜；

(4-c)将带有表皮细胞层的膜转移到100mm的培养皿中，取步骤(2-c)中培养好的4百万真皮细胞和黑色素细胞溶于F12培养基制得75μl细胞悬液后，均匀铺在硅胶膜上的表皮细胞层上，然后在37℃下在CO2培养箱中培养1-2小时，使真皮细胞上完全附着表皮细胞，即制得带有真皮细胞的组织工程表皮，转移到冰盒中，低温保存待移植。

本发明制备出的带有真皮细胞的组织工程表皮在裸鼠上再生出具有色素沉着的人皮肤和毛囊的试验

本发明制备出的带有真皮细胞的组织工程表皮在裸鼠上再生出具有色素沉着的人皮肤和毛囊的试验：

1材料和方法：

1.1试验动物：免疫缺陷的裸鼠(或纯合子nu/nu突变鼠)或非糖尿病肥胖小鼠/重症联合免疫缺陷鼠，这两种鼠都因免疫缺陷使其降低对异体组织产生排异反应，因此适于作为各种异体组织移植和肿瘤移植。

1.2组织工程表皮的标记：

为了展示再生的皮肤来自移植的本实施例制备获得的组织工程表皮，培养过程的***角质细胞在移植前用绿色荧光蛋白-标记逆转录病毒感染，以便移植细胞在荧光显微镜下可追踪。

1.3带有真皮细胞的组织工程表皮的移植：

从有免疫缺陷的裸鼠背上切掉一块0.5-2.0平方厘米大小的完整皮肤组织，形成无皮肤组织但没损害皮下肌肉组织的创口；将附有带有真皮细胞的组织工程表皮的硅胶膜覆盖在整个伤口上，使组织工程表皮的细胞面接触伤口，硅胶膜面朝上，并将硅胶膜与裸鼠皮肤缝合，将涂有药膏的消毒纱布至于伤口上，并用消毒绷带包裹裸鼠。

2观察指标及结果：

2.1观察时间：

每周观察移植组织工程表皮后的裸鼠并拍照记录，观察12周到一年。

2.2组织学分析：

2.2.1光学显微镜检测分析所用再生皮肤样本的采集及处理：

移植3个月后用解剖光学显微镜检查在裸鼠身上再生的新皮肤，并切除、收集再生皮肤的样本，样本冷冻处理后做10μm组织生理切片，先在10％的***中浸泡定形，用1倍磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，再用苏木紫染色三分钟，用蒸馏水冲洗，然后用伊红染色30秒；再分别用浓度为70％、90％和100％的乙醇冲洗和脱水；脱水后的切片用二甲苯漂净，盖玻片覆盖，用二甲苯基定型剂固化定型，并用光学显微镜检测再生皮肤的组织结构。

2.2.1荧光免疫检验法分析所用再生皮肤样本的采集及处理：

移植3个月后用解剖光学显微镜检查在裸鼠身上再生的新皮肤，并切除、收集再生皮肤的样本，样本冷冻后做10μm组织生理切片，用4％多聚甲醛/磷酸盐缓冲液(PBS)固定10分钟，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，室温下封闭缓冲液孵育1小时，所述磷酸盐缓冲液(PBS)中含10％驴血清和2％牛血清蛋白。一抗孵育：基底膜标记一抗(共轭鼠抗牛血清白蛋白(CD49)α6-合素(干细胞,cat.10111))、表皮细胞或底层细胞层标记(抗人角蛋白(BD,cat.550951))或真皮(间叶)细胞标记(兔抗波形蛋白(细胞信号传导,cat.3932))，将切片置于以上抗体溶液中4℃孵育过夜。次日，将切片置于磷酸盐缓冲液(PBS)中冲洗，带有荧光标记的抗鼠的二抗常温下孵育1小时。用含有固形剂的DAPI(VectorLaboratory)固形，通过共聚焦显微镜分析来检查各蛋白的表达情况。

2.3观察结果：

移植4周后，移植处的创面已完全愈合，并形成有色素的新皮肤，没有疤痕形成，说明可以用于无疤痕的创伤愈合。

到第12周，皮肤表面产生肉眼清晰可辨的带有色素的毛发。因为免疫缺陷的裸鼠没有黑色素细胞不会形成色素的皮肤和毛发，所以说明新生的皮肤和毛发是来自移植的培养的细胞。

长出来的毛发持续增长，6个月可以达到3cm长，详见说明书附图图1-A、图1-B所示。这进一步证明在向移植区或周边皮肤注射或和皮肤细胞混合，并配合使用免疫抑制剂的情况下，同种异体的黑色素细胞可被应用到再生的皮肤和毛囊中，达到外观上接受的肤色。

6个月组织切片染色(苏木紫-伊红染色方法)分析显示，再生皮肤的结构和成人头皮的皮肤结构非常相似，含有表皮层、真皮层和皮下组织层，而再生的毛发其成熟毛干连接至皮脂腺和真皮乳突，详见说明书附图图2所示。

3结论：

3.1再生皮肤具有毛囊循环生长能力：

我们观察到不同生长期的毛囊出现在同一个组织切片上，这说明再生的毛囊是有功能的进行循环生长。毛囊循环生长的能力是衡量成熟毛囊的重要标准，为了更进一步监测毛发循环的功能，将裸鼠身上的毛发剪短以便观测毛发循环周期。在剪后一个月，发现再生的毛发能够重新生长出来，这进一步证明再生的毛发是有功能的。并且，在有些再生皮肤区域还观察到有汗腺的形成，而汗腺的再生以前没有被报导过。

为了进一步分析再生毛发的结构，我们利用碱性磷酸酶染色标识重组毛囊的真皮乳突(dermal papilla)。碱性磷酸酶是区分识别真皮乳突和其他真皮成纤维细胞的标志物。为了进一步标记再生毛发和皮肤，对第6周和第12周再生皮肤进行碱性磷酸酶染色标识再生的毛囊。染色显示移植后第6周早期阶段的毛发的乳突呈碱性磷酸酶阳性，而第12周成熟的毛发的毛囊及其周边呈碱性磷酸酶阳性，表明再生的毛囊是正常成熟的。

3.2再生皮肤来自移植组织工程表皮：

在移植后12周，将再生皮肤从移植体分离，在荧光显微镜下进行分析，发现所有的再生皮肤的表皮细胞部分其中包括表皮层、毛发和皮脂腺都呈现荧光绿，表明它们来源于绿色荧光蛋白-标记的培养的***角质细胞。与之相反，所有的真皮部分，包括毛囊的乳突，则对于绿色荧光蛋白都是阴性的。这个实验也建议我们可以体外对培养的细胞进行基因修饰来建立特殊皮肤疾病的模型。

为进一步证明再生的皮肤和毛囊不是由受体的老鼠细胞形成，而是来自移植的体外培养的人的皮肤细胞，我们用只识别人的细胞蛋白质抗体的免疫荧光染色法来分析再生的皮肤和毛囊。通过免疫荧光显微镜分析，再次确认再生的皮肤是来源于人体细胞。首先，我们用细胞角质蛋白(Pan-cytokeratin)抗体，该抗体可识别所有的人体表皮组织细胞。角质蛋白染色显示再生皮肤所有的表皮细胞的成分，包括表皮层、毛囊和皮脂腺，都显阳性，而鼠的表皮组织是阴性。然后，我们用抗人的波形蛋白抗体(vimentin)识别人体所有的真皮细胞。该染色显示再生的真皮组织包括真皮的乳突和皮下脂肪组织显阳性，但鼠的真皮组织是阴性。以上结果表明再生的皮肤完全是人体组织。

3.3再生皮肤有自身的愈合能力：

为进一步证明再生的皮肤是功能性的皮肤，我们在移植后12周，在裸鼠上形成的再生皮肤中间开一个直径和深度在2mm的创口，同时也在裸鼠身上开一个同样大小的创口作为对照，来观察再生的皮肤又没有能力愈合。我们发现再生的皮肤9天左右创口完全愈合，愈合过程和人的皮肤一致，但比鼠的皮肤愈合时间要长(鼠5-7天就愈合)。免疫染色显示愈合的组织也是人体皮肤组织，说明再生皮肤有自身的愈合能力。这结果进一步表明再生皮肤是使功能性的人体皮肤，可以用于各种疾病如创伤愈合的研究。

总之，从以上结果可以看出通过本发明用体外培养的表皮细胞混合真皮细胞和黑色素细胞后移植到免疫缺陷的裸鼠背上可再生出含有黑色素的人类皮肤组织，具备完整的有功能的皮肤和毛发，该技术可以用于建立特殊皮肤疾病模型，如牛皮癣，皮肤癌，湿疹，斑秃，表皮水泡病，粉刺，白化病，皮肤老化等；也可以用于开发细胞产品用于临床上治疗白癜风、牛皮癣和皮肤白化病等，为人类多种皮肤疾病的治疗提供了崭新的途径。

Claims (10)

1.一种带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：获得表皮细胞；

步骤2：接种所述表皮细胞，用表皮培养基培养至密度达到80％-100％，之后，更换为混合培养基，培养16h-24h，收集表皮细胞层，得组织工程表皮片；所述混合培养基包含胎牛血清、DMEM培养基和F12培养基；

步骤3：转移所述组织工程表皮片至半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布上，得带有表皮细胞层的膜；其中，所述表皮细胞层的分化细胞层与所述半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布接触；

步骤4：培养真皮细胞，将所得真皮细胞铺在所述带有表皮细胞层的膜的表皮细胞层之上，培养1h-2h，即得；

所述真皮细胞为从皮肤真皮中分离的真皮细胞或所述从皮肤真皮中分离的真皮细胞和黑色素细胞的混合物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述表皮细胞的制备方法为：

取皮肤组织，用中性蛋白酶孵育12h-20h，之后分离表皮，得表皮；

取所述表皮，切碎后，用胰酶酶解，收集，即得表皮细胞。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述接种之前，还包括表皮细胞的传代培养；

所述接种所用的表皮细胞为P1代表皮细胞、P2代表皮细胞或P3代表皮细胞。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

步骤(1)：表皮细胞分离：

(1-a)采集含有表皮的皮肤组织；

(1-b)将所述皮肤组织消毒后用含双抗的磷酸盐缓冲液冲洗；

(1-c)将所述冲洗后的皮肤组织切成长条状，浸没于中性蛋白酶酶液中，0℃-4℃消化孵育12h-20h；

(1-d)分离所述消化孵育后的长条状皮肤组织，收集表皮部分，得表皮，切碎成粘稠状，制得表皮匀浆；

(1-e)将所述表皮匀浆置于含胰酶的磷酸盐缓冲液中在37℃下消化25分钟-35分钟，制得表皮细胞悬液；

(1-f)向所述表皮细胞悬液中加入含胎牛血清的DMEM培养基，中和表皮细胞悬液；

(1-g)过滤中和后的表皮细胞悬液，离心、收集沉淀，得表皮细胞；

步骤(2)：所述表皮细胞的传代培养：

将所述表皮细胞作为初始细胞，接种，培养至密度达80％－100％，进行传代；

所述传代操作具体包括：

(2-a)将培养至密度达80％-100％的表皮细胞用磷酸盐缓冲液洗去残留的血清后，浸没于含乙二胺四乙酸的胰酶酶液中，在37℃下消化5分钟－15分钟；

(2-b)在显微镜下观察，当表皮细胞从培养板中脱落后，向其酶液中加入含胎牛血清的DMEM培养基中和后，离心，收集沉淀；向所述沉淀中加入含双抗的F12培养基重悬细胞后，离心分离，收集沉淀，得原代表皮细胞；

(2-c)将所述原代表皮细胞按1:2-3的比例传代，所述传代次数为1代-5代；

步骤(3)：组织工程表皮片培养：

(3-a)铺所述P1代表皮细胞、所述P2代表皮细胞或所述P3代表皮细胞到细胞培养皿中，铺板密度在50％-80％，然后加入表皮培养基培养；每隔一天更换新的所述表皮培养基；2 -->

(3-b)当细胞密度达80％-100％后，将表皮培养基换成混合培养基；所述混合培养基含胎牛血清、DMEM培养基和F12培养基；

(3-c)培养16-24小时后，用磷酸盐缓冲液冲洗，之后浸没于中性蛋白酶酶液中，在37℃下培养30分钟-45分钟，至表皮细胞成片分离下来，收集表皮细胞层，得组织工程表皮片；

步骤(4)：所述组织工程表皮片转膜并结合真皮细胞：

(4-a)用含胎牛血清的DMEM培养基反复清洗所述组织工程表皮片；

(4-b)将所述清洗后的组织工程表皮片的基底细胞表面向下放置，将半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布放置在所述组织工程表皮片上面，之后将所述组织工程表皮片的边缘提起贴附在所述半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布上，使表皮细胞层的分化细胞层表面紧贴在半渗透性聚合物或硅胶膜底物或凡士林纱布上，制得带有表皮细胞层的膜；

(4-c)培养真皮细胞，将所得真皮细胞铺在所述带有表皮细胞层的膜的表皮细胞层之上，然后在37℃下培养1小时-2小时，使真皮细胞上完全附着表皮细胞，即制得带有真皮细胞的组织工程表皮；

所述真皮细胞为从皮肤真皮中分离的真皮细胞或所述从皮肤真皮中分离的真皮细胞和黑色素细胞的混合物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1-c)中的所述中性蛋白酶酶液的浓度为2.5mg/mL。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，以g/mL计，步骤(1-e)中所述含胰酶的磷酸盐缓冲液中胰酶的浓度为0.05％；

每5g所述表皮匀浆加入20mL所述含胰酶的磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，以体积百分比计，步骤(1-f)中所述含胎牛血清的DMEM培养基中，所述胎牛血清的含量为5％-10％；

向所述表皮细胞悬液中加入与所述表皮细胞悬液体积相同的所述含胎牛血清的DMEM培养基。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述表皮细胞的培养方法具体为：

将所述表皮细胞置于含Rho激酶抑制剂的CNT-07培养基中重悬得表皮细胞悬液，将所述表皮细胞悬液接到铺有胶原蛋白的培养皿中培养。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2-b)中所述含双抗的F12培养基中的双抗为青霉素和链霉素溶液的混合液；

其中，所述青霉素的浓度为100U/mL，所述链霉素的浓度为100ug/mL。

10.如权利要求1至9中任一项所述的制备方法制备获得的带有真皮细胞的组织工程表皮。