CN105079783A - 药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
药物组合物及其制备方法和用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105079783A CN105079783A CN201410220064.2A CN201410220064A CN105079783A CN 105079783 A CN105079783 A CN 105079783A CN 201410220064 A CN201410220064 A CN 201410220064A CN 105079783 A CN105079783 A CN 105079783A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- solution
- pharmaceutical composition
- rada16
- skin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明提供了用于皮肤愈合和毛囊再生的药物组合物及其制备方法和用途，其中，该药物组合物包括：自组装多肽水凝胶，所述自组装多肽水凝胶是由RADA16-I和PRG的至少一种形成的；以及皮肤细胞，所述皮肤细胞设置于所述自组装多肽水凝胶内部。发明人发现，利用本发明的该药物组合物，能够有效促进皮肤愈合和毛囊再生。另外，本发明的药物组合物中的自组装多肽水凝胶全人工合成，不传播动物源性疾病，具有良好的组织特异性，有利于组织特异性干细胞分化微环境的构建，且材料来源更加稳定，质量标准易于控制。
Description
技术领域
本发明涉及再生医学、生物材料学及干细胞生物学领域，具体地涉及药物组合物及其制备方法和用途。
背景技术
皮肤作为人体最大的组织，是与外界环境接触的屏障，当由于外界损伤或疾病等因素造成皮肤缺损时，常常造成创面水分、电解质及蛋白质的丢失，开放的创面还增加了感染的概率。早期、有效地封闭创面可以减少上述并发症的发生，临床上常用的是凡士林纱布和断层/全厚皮片，其中自体断层皮片移植是公认的标准疗法。但是在大面积皮肤缺损患者，仍存在着供区不足及造成机体新的损伤等缺陷。
自组装多肽水凝胶材料是近十年刚刚兴起的研究领域，初步应用结果已显露出了其在组织工程和组织再生修复方面的巨大潜力。合成的具有仿生功能的自组装多肽RADA16-I(Ac-RADARADARADARADA-CONH2)是该类多肽的代表，该短肽由16个疏水和亲水氨基酸交替排列组成，形成稳定的β折叠，在适当pH的水溶液内自组装形成排列有序的纳米纤维。其水溶液吸水量高达99.5％以上，纳米纤维交叉形成具网状骨架的类似于细胞外基质的立体水凝胶结构，对细胞起支持作用。该材料具有良好的细胞和组织相容性，无毒，植入体内后可逐步被吸收，是理想的组织工程材料。
目前，将自组装多肽水凝胶用于皮肤的伤口愈合和毛囊再生尚未有报导。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效用于皮肤愈合和毛囊再生的手段。
在本发明的一个方面，本发明提供一种用于皮肤愈合和毛囊再生的药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包括：自组装多肽水凝胶，所述自组装多肽水凝胶是由RADA16-I和PRG(Ac-(RADA)4GPRGDSGYRGDS-CONH2)的至少一种形成的；以及皮肤细胞，所述皮肤细胞设置于所述自组装多肽水凝胶内部。发明人发现，利用本发明的该药物组合物，能够有效促进皮肤愈合和毛囊再生。另外，本发明的药物组合物中的自组装多肽水凝胶全人工合成，不传播动物源性疾病，可根据不同组织的特点和用途灵活添加不同分子的功能片段，使之更具有组织特异性，有利于组织特异性干细胞分化微环境的构建，且材料来源更加稳定，质量标准易于控制。
根据本发明实施例的药物组合物，还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，当所述水凝胶由RADA16-I和PRG共同形成时，在所述自组装多肽水凝胶中，所述RADA16-I和所述PRG的质量比为1：1。
根据本发明的实施例，在所述自组装多肽水凝胶中，所述皮肤细胞的含量为104-108个/mL。
根据本发明的实施例，所述皮肤细胞为选自真皮细胞和表皮细胞的至少一种。
根据本发明的实施例，所述真皮细胞为新分离的真皮细胞或培养0-30代的真皮干细胞。
根据本发明的实施例，所述表皮细胞为新分离的表皮细胞或培养0-30代的表皮干细胞。
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括：有利于细胞存活、生长的细胞活性因子和/或细胞外基质分子。根据本发明的实施例，所述细胞活性因子为选自bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、EGF(表皮细胞生长因子)的至少一种，所述细胞外基质分子为选自透明质酸、纤维粘连蛋白的至少一种。由此，能够有效促进皮肤细胞的存活和生长，进而促进皮肤愈合和毛囊再生的效果较好。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种制备前面所述的药物组合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)提供RADA16-I溶液和PRG溶液，其中，所述RADA16-I溶液的浓度为0.1-1g/100ml，所述PRG溶液的浓度为0.1-1g/100ml；(2)将所述RADA16-I溶液和所述PRG溶液等体积混合，以便获得混合水凝胶溶液；(3)在所述RADA16-I溶液、所述PRG溶液或所述混合水凝胶溶液中接种皮肤细胞，并在适于所述皮肤细胞生长的条件下进行孵育，以便获得所述药物组合物。发明人发现，利用本发明的该方法能够快速有效地制备前面所述的药物组合物，且操作简单、方便快捷、容易控制、易于实现规模化生产。
根据本发明的实施例，在步骤(2)之前，预先将所述RADA16-I溶液和所述PRG溶液进行0.22μm过滤除菌处理。
根据本发明的实施例，所述接种细胞进一步包括：用10％无菌蔗糖溶液将所述皮肤细胞配成浓度为104-108个/mL的细胞悬液，将所述混合水凝胶溶液和所述细胞悬液按照体积比为5：1的比例混合。
根据本发明的实施例，所述孵育进一步包括：每隔30分钟，移除孔板中的培养基，补加等体积新鲜培养基到孔板中，重复3-5次。根据本发明的实施例，所述培养基中包含有利于细胞存活、生长的细胞活性因子和/或细胞外基质分子，根据本发明的实施例，所述细胞活性因子为选自bFGF、EGF的至少一种，所述细胞外基质分子为选自透明质酸、纤维粘连蛋白的至少一种。由此，能够有效促进皮肤细胞的存活和生长，进而促进皮肤愈合和毛囊再生的效果较好。
根据本发明的实施例，所述RADA16-I溶液的浓度为1g/100mL。
根据本发明的实施例，所述PRG溶液的浓度为1g/100mL。
根据本发明的实施例，所述皮肤细胞为选自表皮细胞和真皮细胞的至少一种。
根据本发明的实施例，所述真皮细胞为新分离的真皮细胞或培养0-30代的真皮干细胞。
根据本发明的实施例，所述表皮细胞为新分离的表皮细胞或培养0-30代的表皮干细胞。
在本发明的又一方面，本发明提供了前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于皮肤愈合和毛囊再生。
在本发明的再一方面，本发明提供了一种用于皮肤愈合和毛囊再生的药物。根据本发明的实施例，该药物包含前面所述的药物组合物。发明人发现，本发明的药物能够有效用于皮肤愈合和毛囊再生。
附图说明
图1显示了根据本发明的实施例，本发明的药物组合物的外观形态图；
图2显示了根据本发明的实施例，培养1天时，药物组合物中真皮干细胞的共聚焦显微镜照片；
图3显示了根据本发明的实施例，培养3天时，药物组合物中真皮干细胞的共聚焦显微镜照片；
图4显示了根据本发明的实施例，药物组合物中真皮干细胞的AO/PI双染色图；
图5显示了根据本发明的实施例，药物组合物中真皮干细胞的碱性磷酸酯酶(AP)染色图；
图6显示了根据本发明的实施例，移植药物组合物3周后，裸鼠皮肤愈合和毛囊再生情况结果图；
图7显示了根据本发明的实施例，培养1天后，MSC在由不同浓度的混合水凝胶溶液形成的水凝胶中的倒置显微镜照片，其中，
图7A为MSC在由多肽浓度为0.1g/100mL的混合水凝胶溶液形成的水凝胶中的倒置显微镜照片，
图7B为MSC在由多肽浓度为0.5g/100mL的混合水凝胶溶液形成的水凝胶中的倒置显微镜照片，
图7C为MSC在由多肽浓度为1g/100mL的混合水凝胶溶液形成的水凝胶中的倒置显微镜照片；
图8显示了根据本发明的实施例，培养3天后，真皮干细胞在RADA16-I自组装多肽水凝胶中的生长情况。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在本发明的一个方面，本发明提供一种用于皮肤愈合和毛囊再生的药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包括：自组装多肽水凝胶，所述自组装多肽水凝胶是由RADA16-I和PRG的至少一种形成的；以及皮肤细胞，所述皮肤细胞设置于所述自组装多肽水凝胶内部。发明人发现，利用本发明的该药物组合物，能够有效促进皮肤愈合和毛囊再生。另外，本发明的药物组合物中的自组装多肽水凝胶全人工合成，不传播动物源性疾病，可根据不同组织的特点和用途灵活添加不同分子的功能片段，使之更具有组织特异性，有利于组织特异性干细胞分化微环境的构建，且材料来源更加稳定，质量标准易于控制。
根据本发明的实施例，所述自组装多肽水凝胶可以由RADA16-I和PRG的一种单独形成，也可以由RADA16-I和PRG的混合物形成，当所述水凝胶由RADA16-I和PRG共同形成时，在所述自组装多肽水凝胶中，所述RADA16-I和所述PRG的质量比为1：1。由此，自组装多肽水凝胶的性能较佳，能够有效支持皮肤细胞的生长和增殖。
根据本发明的实施例，在所述自组装多肽水凝胶中，所述皮肤细胞的含量不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况灵活选择。根据本发明的一些实施例，皮肤细胞的含量可以为104-108个/mL。由此，本发明的药物组合物促进皮肤愈合和毛囊再生的效果较佳。
根据本发明的实施例，所述皮肤细胞的种类不受特别限制。根据本发明的一些实施例，皮肤细胞可以为选自真皮细胞和表皮细胞的至少一种。由此，能够有效促进皮肤愈合和毛囊再生。
根据本发明的实施例，所述真皮细胞的种类不受特别限制。根据本发明的一些实施例，真皮细胞可以为新分离的真皮细胞或培养0-30代的真皮干细胞。由此，所述真皮细胞在自组装多肽水凝胶中的生长状态良好，能够有效增殖，进而能够有效发挥促进皮肤愈合和毛囊再生的功效。
根据本发明的实施例，所述表皮细胞的种类不受特别限制。根据本发明的一些实施例，表皮细胞可以为新分离的表皮细胞或培养0-30代的表皮干细胞。由此，所述表皮细胞在自组装多肽水凝胶中的生长状态良好，能够有效增殖，进而能够有效发挥促进皮肤愈合和毛囊再生的功效。
根据本发明的实施例，所述药物组合物还可以进一步包括：有利于细胞存活、生长的细胞活性因子和/或细胞外基质分子。根据本发明的实施例，所述细胞活性因子的种类不受特别限制，只要能够有效促进皮肤细胞的生长和增殖即可。根据本发明的一个具体示例，细胞活性因子可以为选自bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、EGF(表皮细胞生长因子)的至少一种。根据本发明的实施例，所述细胞外基质分子的种类不受特别限制。根据本发明的一些实施例，细胞外基质分子可以为选自透明质酸、纤维粘连蛋白的至少一种。由此，能够有效促进皮肤细胞的存活和生长，进而促进皮肤愈合和毛囊再生的效果较好。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种制备前面所述的药物组合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
(1)提供RADA16-I溶液和PRG溶液，其中，所述RADA16-I溶液的浓度为0.1-1g/100ml，所述PRG溶液的浓度为0.1-1g/100ml。
根据本发明的实施例，所述RADA16-I溶液的浓度为1g/100mL。由此，所得到的自组装多肽水凝胶的性能较佳，皮肤愈合和毛囊再生的效果较好。
根据本发明的实施例，所述PRG溶液的浓度为1g/100mL。由此，所得到的自组装多肽水凝胶的性能较佳，皮肤愈合和毛囊再生的效果较好。
根据本发明的实施例，在进行后续步骤之前，预先将所述RADA16-I溶液和所述PRG溶液进行0.22μm过滤除菌处理。由此，能够有效对RADA16-I溶液和PRG溶液进行除菌，获得无菌的RADA16-I溶液和PRG溶液，便于后续步骤的操作。
(2)将所述RADA16-I溶液和所述PRG溶液等体积混合，以便获得混合水凝胶溶液。
根据本发明的实施例，在将RADA16-I溶液和PRG溶液混合前，可以预先将RADA16-I溶液和PRG溶液分别超声30分钟。
(3)在所述RADA16-I溶液、所述PRG溶液或所述混合水凝胶溶液中接种皮肤细胞，并在适于所述皮肤细胞生长的条件下进行孵育，以便获得所述药物组合物。
根据本发明的实施例，所述接种皮肤细胞进一步包括：用10％无菌蔗糖溶液将所述皮肤细胞配成浓度为104-108个/mL的细胞悬液，将所述混合水凝胶溶液和所述细胞悬液按照体积比为5：1的比例混合。由此，在适当pH条件下，混合水凝胶溶液中的RADA16-I和PRG可自发组装成纳米纤维，并进一步发生交联，形成多孔网状结构的水凝胶，从而有效获得内部设置有皮肤细胞的自组装多肽水凝胶，即本发明的药物组合物。
根据本发明的实施例，所述皮肤细胞的种类不受特别限制。根据本发明的一些实施例，皮肤细胞可以为选自表皮细胞和真皮细胞的至少一种。由此，促进皮肤愈合和毛囊再生的效果较好。
根据本发明的实施例，所述真皮细胞的种类不受特别限制。根据本发明的一些实施例，真皮细胞可以为新分离的真皮细胞或培养0-30代的真皮干细胞。由此，所述真皮细胞在自组装多肽水凝胶中的生长状态良好，能够有效增殖，进而能够有效发挥促进皮肤愈合和毛囊再生的功效。
根据本发明的实施例，所述表皮细胞的种类不受特别限制。根据本发明的一些实施例，表皮细胞可以为新分离的表皮细胞或培养0-30代的表皮干细胞。由此，所述表皮细胞在自组装多肽水凝胶中的生长状态良好，能够有效增殖，进而能够有效发挥促进皮肤愈合和毛囊再生的功效。
根据本发明的实施例，所述孵育进一步包括：每隔30分钟，移除孔板中的培养基，补加等体积新鲜培养基到孔板中，重复3-5次。由此，能够有效调节自组装多肽水凝胶的pH值，使其适合皮肤细胞的生长与增殖，从而有效用于皮肤愈合和毛囊再生。根据本发明的实施例，所述培养基中包含有利于细胞存活、生长的细胞活性因子和/或细胞外基质分子，根据本发明的实施例，所述细胞活性因子为选自bFGF、EGF的至少一种，所述细胞外基质分子为选自透明质酸、纤维粘连蛋白的至少一种。由此，能够有效促进皮肤细胞的存活和生长，进而促进皮肤愈合和毛囊再生的效果较好。
发明人发现，利用本发明的该方法能够快速有效地制备前面所述的药物组合物，且操作简单、方便快捷、容易控制、易于实现规模化生产。
在本发明的又一方面，本发明提供了前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于皮肤愈合和毛囊再生。发明人发现，在本发明的药物组合物中，自组装多肽水凝胶具有良好的细胞和组织相容性，无毒，能够有效支持皮肤细胞的生长与增殖，植入体内后可逐步被吸收，皮肤细胞在自组装多肽水凝胶中能够有效生长与增殖，在自组装多肽水凝胶的支持作用下，能够有效促进皮肤愈合和毛囊再生。
在本发明的再一方面，本发明提供了一种用于皮肤愈合和毛囊再生的药物。根据本发明的实施例，该药物包含前面所述的药物组合物。发明人发现，本发明的该药物组合物能够有效用于皮肤愈合和毛囊再生。
下面详细描述本发明的实施例，如无特殊说明，下述实施例中离体皮肤干细胞从C57小鼠的皮肤组织分离并培养；皮肤细胞的分离方法为：将小鼠皮肤剪成小块用dispaseII(sigma)，37℃消化2小时，剥离真皮和表皮，分别用I型胶原酶(sigma)消化得到新分离的真皮和表皮细胞；碳酸酯膜(transwell)购自于Corning公司，产品目录号为3470；细胞培养基组成为DMEM/F12(3:1)(购买于Invitrogen公司)，含2％B27(购买于Invitrogen公司)，40ng/μLbFGF(Peprotech)和20ng/μLEGF(Peprotech)，除实施例1外，其他实施例培养真皮干细胞的培养基均为此培养基；3M膜为TegadermTMFilm；培养皿为悬浮细胞培养皿，购自于广州杰特生物过滤制品有限公司，货号为MCD-000-090。实验动物均购自于广东省医学实验动物中心。
实施例1
利用人源间充质干细胞(MSC)测定自组装多肽水凝胶的细胞相容性，具体如下：
(1)采用固相合成方法进行多肽合成，通过多肽合成仪合成多肽分子，肽链的N端和C端通过乙酰化和酰胺化进行修饰，防止其迅速降解。合成后的多肽RADA16-I(Ac-RADARADARADARADA-CONH2)和PRG(Ac-(RADA)4GPRGDSGYRGDS-CONH2)用HPLC进行纯化后，冷冻干燥，分别得到RADA16-I和PRG多肽冻干粉。
(2)将步骤(1)中制备获得的RADA16-I和PRG多肽冻干粉分别用去离子水溶解，得到多肽浓度为1g/100mL、0.5g/100mL、0.1g/100mL的RADA16-I溶液和PRG溶液，然后，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到不同浓度的无菌的RADA16-I溶液和PRG溶液。
(3)将不同浓度的无菌的RADA16-I溶液和PRG溶液分别超声30分钟。
(4)将经过超声处理的相同浓度的RADA16-I溶液和PRG溶液等体积混合，具体地为各50μL，得到三种浓度的混合水凝胶溶液。
(5)将混合水凝胶溶液快速混匀后，加入24孔transwell中，然后沿着培养板孔壁缓慢加入培养基(DMEM，Corningcellgro，含10％胎牛血清)。
(6)在5％CO2、37℃培养箱中静置30min后，用枪头慢慢吸走培养基，再重新补加新鲜的培养基到孔板中。
(7)再静置30min，然后重复步骤(6)的操作。
(8)再静置30min，然后重复步骤(6)的操作。
(9)再静置30min或更长时间，然后重复步骤(6)的操作。
(10)将MSC种到自组装多肽水凝胶表面，并添加培养基，然后置于37℃，5％CO2培养箱中，静置培养。在倒置显微镜下观察细胞和自组装多肽水凝胶的粘附情况。培养1天后其形态图见图7，其中，图7A为MSC在由多肽浓度为0.1g/100mL的混合水凝胶溶液形成的水凝胶中的倒置显微镜照片，图7B为MSC在由多肽浓度为0.5g/100mL的混合水凝胶溶液形成的水凝胶中的倒置显微镜照片，图7C为MSC在由多肽浓度为1g/100mL的混合水凝胶溶液形成的水凝胶中的倒置显微镜照片。由图7可见，三种浓度的自组装多肽水凝胶都对细胞粘附有一定的支持作用，而1g/100mL的水凝胶中细胞可以更好地伸展，对细胞生长和粘附有更好的支持作用。
实施例2
(1)采用固相合成方法进行多肽合成，通过多肽合成仪合成多肽分子，肽链的N端和C端通过乙酰化和酰胺化进行修饰，防止其迅速降解。合成后的多肽RADA16-I(Ac-RADARADARADARADA-CONH2)和PRG(Ac-(RADA)4GPRGDSGYRGDS-CONH2)用HPLC进行纯化后，冷冻干燥，分别得到RADA16-I和PRG多肽冻干粉。
(2)将步骤(1)中制备获得的RADA16-I和PRG多肽冻干粉分别用去离子水溶解，得到多肽浓度均为1g/100mL的RADA16-I溶液和PRG溶液，然后，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到无菌的RADA16-I溶液和PRG溶液。
(3)将无菌的RADA16-I溶液和PRG溶液分别超声30分钟。
(4)将经过超声处理的RADA16-I溶液和PRG溶液等体积混合，具体地为各50μL，得到混合水凝胶溶液。
(5)将悬浮培养的第3代小鼠皮肤真皮干细胞(SKP)104个，离心去除培养基，用1mL10％无菌蔗糖溶液洗涤细胞，然后离心，去除上清，再加入20μL10％无菌蔗糖溶液配制成细胞悬液。
(6)将一倍体积细胞悬液与五倍体积混合水凝胶溶液快速混匀后，加入24孔transwell中，然后沿着培养板孔壁缓慢加入培养基。
(7)在5％CO2、37℃培养箱中静置30min后，用枪头慢慢吸走培养基，再重新补加新鲜的培养基到24孔transwell和孔板中，放回培养箱。
(8)再静置30min，然后重复步骤(7)的操作。
(9)再静置30min，然后重复步骤(7)的操作。
(10)再静置30min，然后重复步骤(7)的操作。
(11)将所得到的药物组合物置于37℃，5％CO2培养箱中，静置培养，得到药物组合物，其外观形态图见图1。
培养1或3天后，通过共聚焦显微镜(OLYMPUS)观察真皮干细胞在自组装多肽水凝胶中的生长情况，共聚焦显微镜照片见图2和图3，其中，图2为培养1天，真皮干细胞的共聚焦显微镜照片，图3为培养3天，真皮干细胞的共聚焦显微镜照片。由图2和图3可以看出，多数真皮干细胞开始伸展，表明真皮干细胞的生长状态良好。
用AO/PI双染色法鉴定细胞死活：AO/PI双染色图见图4，其中，绿色为活细胞，红色为死细胞。由图4可以看到，几乎看不到红色的死细胞，说明在本发明的药物组合物中，真皮干细胞具有较好的存活率。
用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶(AP)显色试剂盒(碧云天)检测真皮干细胞的干性。碱性磷酸酯酶(AP)染色图见图5。结果表明皮肤干细胞在自组装多肽水凝胶中保持了较好的干性。
实施例3
(1)采用固相合成方法进行多肽合成，通过多肽合成仪合成多肽分子，肽链的N端和C端通过乙酰化和酰胺化进行修饰，防止其迅速降解。合成后的多肽RADA16-I(Ac-RADARADARADARADA-CONH2)和PRG(Ac-(RADA)4GPRGDSGYRGDS-CONH2)用HPLC进行纯化后，冷冻干燥，分别得到RADA16-I和PRG多肽冻干粉。
(2)将步骤(1)中制备获得的RADA16-I和PRG多肽冻干粉分别用去离子水溶解，得到多肽浓度为1g/100mL的RADA16-I溶液和PRG溶液，然后，用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到无菌的RADA16-I溶液和PRG溶液。
(3)将无菌的RADA16-I溶液和PRG溶液分别超声30分钟。
(4)将经过超声处理的RADA16-I溶液和PRG溶液等体积混合，具体地为各50μL，得到混合水凝胶溶液。
(5)将悬浮培养的第3代小鼠皮肤真皮干细胞(SKP)(或新分离的新生鼠真皮细胞)106个，与新分离的新生鼠表皮细胞106个混合，离心去除培养基，用1mL10％无菌蔗糖溶液洗涤细胞，然后离心，去除上清，再加入20μL10％无菌蔗糖溶液配制成细胞悬液。
(6)将一倍体积细胞悬液与五倍体积混合水凝胶溶液快速混匀后，加入24孔transwell中，然后沿着培养板孔壁缓慢加入培养基。
(7)在5％CO2、37℃培养箱中静置30min后，用枪头慢慢吸走培养基，再重新补加新鲜的培养基到transwell和孔板中，放回培养箱。
(8)再静置30min，然后重复步骤(7)的操作。
(9)再静置30min，然后重复步骤(7)的操作。
(10)再静置30min，然后重复步骤(7)的操作。
(11)将所得到的药物组合物置于37℃，5％CO2培养箱中，静置培养，得到药物组合物。
实施例4
按照以下步骤，检测实施例3中制备获得的药物组合物促进皮肤愈合和毛囊再生的效果，具体如下：
将BALB/c裸鼠用1％的戊巴比妥钠麻醉，用打孔器在其背部皮肤上制造面积约7mm2的伤口，接着，将实施例2中制备获得的药物组合物移植到裸鼠皮肤伤口表面，并用3M膜覆盖裸鼠伤口表面，然后用绷带将裸鼠伤口包扎。正常饲养裸鼠，3周后拆开绷带去除3M膜，观察裸鼠皮肤愈合和毛囊再生情况。
实验结果如图6所示。由图6可以看出，裸鼠皮肤伤口完全愈合，并生长出毛发，表明本发明的药物组合物能够有效用于皮肤愈合和毛囊再生。
实施例5
(1)采用固相合成方法进行多肽合成，通过多肽合成仪合成多肽分子，肽链的N端和C端通过乙酰化和酰胺化进行修饰，防止其迅速降解。合成后的多肽RADA16-I(Ac-RADARADARADARADA-CONH2)，用HPLC进行纯化后，冷冻干燥，得到RADA16-I多肽冻干粉。
(2)将步骤(1)中制备获得的RADA16-I多肽冻干粉分别用去离子水溶解，得到多肽浓度为1g/100mL的RADA16-I溶液，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到无菌的RADA16-I溶液。
(3)将无菌的RADA16-I溶液超声30分钟。
(4)将悬浮培养的第3代小鼠皮肤真皮干细胞(SKP)104个，离心去除培养基，用1mL10％无菌蔗糖溶液洗涤细胞，然后离心，去除上清，再加入20μL10％无菌蔗糖溶液配制成细胞悬液。
(5)将20μL细胞悬液与100μL超声后的RADA16-I溶液快速混匀后，加入24孔transwell中，然后沿着培养板孔壁缓慢加入培养基。
(6)在5％CO2、37℃培养箱中静置30min后，用枪头慢慢吸走培养基，再重新补加新鲜的培养基到24孔transwell和孔板中，放回培养箱。
(7)静置30min，然后重复步骤(6)的操作。
(8)再静置30min，然后重复步骤(6)的操作。
(9)再静置30min，然后重复步骤(6)的操作
(10)将所得到的药物组合物置于37℃，5％CO2培养箱中，静置培养，得到药物组合物。
将上述得到的药物组合物在37℃，5％CO2培养箱中培养3天后，通过倒置显微镜(Nikon)观察真皮干细胞在自组装多肽水凝胶中的生长情况，显微镜照片见图8。从图8可以看出，多数真皮干细胞可以在RADA16-I自组装多肽水凝胶中能够较好的生长。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种用于皮肤愈合和毛囊再生的药物组合物，其特征在于，包括：
自组装多肽水凝胶，所述自组装多肽水凝胶是由RADA16-I和PRG的至少一种形成的；以及
皮肤细胞，所述皮肤细胞设置于所述自组装多肽水凝胶内部。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，当所述水凝胶由RADA16-I和PRG共同形成时，在所述自组装多肽水凝胶中，所述RADA16-I和所述PRG的质量比为1：1。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，在所述自组装多肽水凝胶中，所述皮肤细胞的含量为104-108个/mL。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述皮肤细胞为选自真皮细胞和表皮细胞的至少一种，
任选地，所述真皮细胞为新分离的真皮细胞或培养0-30代的真皮干细胞，
任选地，所述表皮细胞为新分离的表皮细胞或培养0-30代的表皮干细胞。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括：
有利于细胞存活、生长的细胞活性因子和/或细胞外基质分子，
任选地，所述细胞活性因子为选自bFGF、EGF的至少一种，所述细胞外基质分子为选自透明质酸、纤维粘连蛋白的至少一种。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述的药物组合物的方法，其特征在于，包括：
(1)提供RADA16-I溶液和PRG溶液，其中，所述RADA16-I溶液的浓度为0.1-1g/100ml，所述PRG溶液的浓度为0.1-1g/100ml；
(2)将所述RADA16-I溶液和所述PRG溶液等体积混合，以便获得混合水凝胶溶液；
(3)在所述RADA16-I溶液、所述PRG溶液或所述混合水凝胶溶液中接种皮肤细胞，并在适于所述皮肤细胞生长的条件下进行孵育，以便获得所述药物组合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)之前，预先将所述RADA16-I溶液和所述PRG溶液进行0.22μm过滤除菌处理，
任选地，所述接种细胞进一步包括：
用10％无菌蔗糖溶液将所述皮肤细胞配成浓度为104-108个/mL的细胞悬液，将所述混合水凝胶溶液和所述细胞悬液按照体积比为5：1的比例混合，
任选地，所述孵育进一步包括：
每隔30分钟，移除孔板中的培养基，补加等体积新鲜培养基到孔板中，重复3-5次，
任选地，所述培养基中包含有利于细胞存活、生长的细胞活性因子和/或细胞外基质分子，
任选地，所述细胞活性因子为选自bFGF、EGF的至少一种，所述细胞外基质分子为选自透明质酸、纤维粘连蛋白的至少一种。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RADA16-I溶液的浓度为1g/100mL，
任选地，所述PRG溶液的浓度为1g/100mL，
任选地，所述皮肤细胞为选自表皮细胞和真皮细胞的至少一种，
任选地，所述真皮细胞为新分离的真皮细胞或培养0-30代的真皮干细胞，
任选地，所述表皮细胞为新分离的表皮细胞或培养0-30代的表皮干细胞。
9.权利要求1-5任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于皮肤愈合和毛囊再生。
10.一种用于皮肤愈合和毛囊再生的药物，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述的药物组合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410220064.2A CN105079783B (zh) | 2014-05-22 | 2014-05-22 | 药物组合物及其制备方法和用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410220064.2A CN105079783B (zh) | 2014-05-22 | 2014-05-22 | 药物组合物及其制备方法和用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105079783A true CN105079783A (zh) | 2015-11-25 |
| CN105079783B CN105079783B (zh) | 2018-06-19 |
Family
ID=54561701
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410220064.2A Active CN105079783B (zh) | 2014-05-22 | 2014-05-22 | 药物组合物及其制备方法和用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105079783B (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106492269A (zh) * | 2016-12-09 | 2017-03-15 | 广东颜值科技有限公司 | 一种温敏水凝胶及其制备方法 |
| CN107126556A (zh) * | 2017-05-17 | 2017-09-05 | 何伟 | 一种干细胞提取物及其制备方法与在制备皮肤创面修复制剂中的应用 |
| CN107174653A (zh) * | 2016-03-10 | 2017-09-19 | 深圳培元生物科技有限公司 | 一种促进皮肤毛囊再生的方法 |
| CN108014328A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-05-11 | 吴广印 | 一种预防脱发、促进生发物质的配方及其制备方法 |
| CN109771694A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-05-21 | 江苏瑞思坦生物科技有限公司 | 自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料的制备方法及应用 |
| CN110804580A (zh) * | 2019-11-21 | 2020-02-18 | 山东大学 | 一种体外形成早期微毛囊的培养方法及其应用 |
| CN111885999A (zh) * | 2018-03-15 | 2020-11-03 | 艾得佩索拉公司 | 凝胶形成性多肽 |
| EP4125995A4 (en) * | 2020-03-31 | 2024-04-10 | 3-D Matrix, Ltd. | STERILIZATION OF SELF-ASSEMBLING PEPTIDES BY IRRADIATION |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101036780A (zh) * | 2007-04-27 | 2007-09-19 | 四川大学 | 自组装短肽在治疗烧伤创面的药物中的应用 |
-
2014
- 2014-05-22 CN CN201410220064.2A patent/CN105079783B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101036780A (zh) * | 2007-04-27 | 2007-09-19 | 四川大学 | 自组装短肽在治疗烧伤创面的药物中的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JEAN G. TOMA，ET AL: "Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin", 《NATURE CELL BIOLOGY》 * |
| JEFFREY BIERNASKIE，ET AL: "SKPs Derive from Hair Follicle Precursors and Exhibit Properties of Adult Dermal Stem Cells", 《CELL STEM CELL》 * |
| XIAOXIAO WANG,ET AL: "Self-assembling peptide hydrogel scaffolds support stem cell-based hair follicle regeneration", 《NANOMEDICINE: NANOTECHNOLOGY, BIOLOGY, AND MEDICINE》 * |
| 刘茜等: "自组装多肽纳米纤维水凝胶在细胞三维培养中的应用及特征", 《中国组织工程研究》 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107174653A (zh) * | 2016-03-10 | 2017-09-19 | 深圳培元生物科技有限公司 | 一种促进皮肤毛囊再生的方法 |
| CN107174653B (zh) * | 2016-03-10 | 2020-11-17 | 深圳培元生物科技有限公司 | 一种促进毛囊再生的方法 |
| CN106492269A (zh) * | 2016-12-09 | 2017-03-15 | 广东颜值科技有限公司 | 一种温敏水凝胶及其制备方法 |
| CN107126556A (zh) * | 2017-05-17 | 2017-09-05 | 何伟 | 一种干细胞提取物及其制备方法与在制备皮肤创面修复制剂中的应用 |
| CN108014328A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-05-11 | 吴广印 | 一种预防脱发、促进生发物质的配方及其制备方法 |
| CN111885999A (zh) * | 2018-03-15 | 2020-11-03 | 艾得佩索拉公司 | 凝胶形成性多肽 |
| CN109771694A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-05-21 | 江苏瑞思坦生物科技有限公司 | 自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料的制备方法及应用 |
| CN110804580A (zh) * | 2019-11-21 | 2020-02-18 | 山东大学 | 一种体外形成早期微毛囊的培养方法及其应用 |
| CN110804580B (zh) * | 2019-11-21 | 2021-09-28 | 山东大学 | 一种体外形成早期微毛囊的培养方法及其应用 |
| EP4125995A4 (en) * | 2020-03-31 | 2024-04-10 | 3-D Matrix, Ltd. | STERILIZATION OF SELF-ASSEMBLING PEPTIDES BY IRRADIATION |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105079783B (zh) | 2018-06-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105079783A (zh) | 药物组合物及其制备方法和用途 | |
| Han et al. | Application of collagen-chitosan/fibrin glue asymmetric scaffolds in skin tissue engineering | |
| CN101775366A (zh) | 一种含毛囊组织工程皮肤的制备方法 | |
| CN102086451B (zh) | 一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法 | |
| CN101856517B (zh) | 基于组织工程材料的黑素细胞的培养方法及其应用 | |
| US10398735B2 (en) | Compositions and methods for producing reconstituted skin | |
| CN104312970A (zh) | 一种细胞治疗用临床治疗级表皮干细胞应用人类细胞外基质筛选及规模化培养制备方法 | |
| JP2017525438A (ja) | 組織移植片 | |
| CN104263698A (zh) | 临床治疗级细胞治疗用成纤维细胞规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法 | |
| CN107254431B (zh) | 一种新型组织工程皮肤制备方法 | |
| KR100527623B1 (ko) | 세포외기질을 포함하는 인공장기 제조용 생분해성 고분자기질 및 그의 제조방법 | |
| US8013121B2 (en) | Isolated nature-identical collagen | |
| KR20010072553A (ko) | 살아있는 키메릭 피부 대체물 | |
| CN107802891A (zh) | 组织工程皮肤及其制备方法 | |
| CN109771694A (zh) | 自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料的制备方法及应用 | |
| CN104971382A (zh) | 一种用无血清和牛垂体提取物培养液构建的创口贴式人工活性组织及其构建方法 | |
| CN105963795A (zh) | 一种基于胶原制备组织工程表皮的方法 | |
| US20120276154A1 (en) | Creation of hair follicles in tissue-engineered skin grafts | |
| CN109722410B (zh) | 一种3d全层皮肤模型及用于其形成的培养基、制备方法 | |
| AU2007220117A1 (en) | An interactive wound cover | |
| CN105238740A (zh) | 组织工程皮肤种子表皮角质形成细胞高拟体内细胞外基质附着体外筛选培养方法 | |
| CN1363398A (zh) | 以壳多糖或其衍生物为基质网架的复层人工皮肤 | |
| CN1415384A (zh) | 组织工程全层皮肤的制备方法 | |
| CN1210005C (zh) | 含有血管结构的组织工程皮肤及其构建方法 | |
| RU2736480C2 (ru) | Способ производства коллаген-ламининового матрикса для заживления язв, ожогов и ран кожи человека |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |