CN104542714A

CN104542714A - 根瘤菌Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020的应用

Info

Publication number: CN104542714A
Application number: CN201410828557.4A
Authority: CN
Inventors: 韦革宏; 孔召玉; 陈卫民
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2034-12-26
Also published as: CN104542714B

Abstract

本发明涉及根瘤菌Sinorhizobium？meliloti？CCNWSX0020的应用，具体涉及根瘤菌Sinorhizobium？meliloti？CCNWSX0020提高植物体内抗氧化酶***对重金属响应的应用。根瘤菌S.meliloti？CCNWSX0020在过量重金属胁迫条件下，对植物的生物量、株高、总N含量、重金属吸收量都有不同程度的提高作用。同时发明人发现该菌对过量重金属胁迫条件下的植物体内抗氧化酶***的响应也有明显的促进作用。并且根瘤菌S.meliloti？CCNWSX0020与其宿主植物天蓝苜蓿所建立起来的共生固氮体系在土壤重金属污染的生物修复中具有一定的应用潜力。

Description

根瘤菌Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020的应用

技术领域

本发明涉及土壤生物修复领域，具体涉及一株抗重金属铜的根瘤菌Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020，及其对宿主植物天蓝苜蓿生长、铜吸收量及抗氧化酶***响应的促进作用，以及与其建立的共生固氮体系在土壤重金属污染的生物修复中的应用潜力。

背景技术

氧是植物生命代谢活动中的重要物质之一。植物在自身有氧代谢过程中，会产生O^2-，H₂O₂，·OH等高活性的自由基。这些活性氧具有很强的化学活性，会对植物细胞造成伤害。六十年代末，生物自由基(Free Radical)伤害学说被提出后，已经被广泛地应用于需氧生物毒害作用的研究中。在正常情况下，植物体内自由基的产生和清除处于动态平衡中。而当植物处于一些极端环境下，如干旱，高盐，温度胁迫，重金属毒害等，植物体内的活性氧会加速积累，破坏植物活性氧产生和清除的动态平衡，从而造成植物体内活性氧大量积累，破坏细胞，最终导致植物死亡。为了有效地清除由于正常代谢及环境胁迫所产生的自由基，从而保证植物自身正常的代谢活动，植物细胞通过抗氧化酶***和抗氧化剂来清除自由基及有害的氧化中间产物。

过量的铜，或长时间的铜胁迫会使植物体内的抗氧化酶***平衡受到破坏，植物体内自由基含量上升，最终对植物造成毒害作用。这一现象已在多种不同植物体内得到证实。近几年，植物氧化胁迫及抗氧化酶***，尤其在逆境胁迫下以及在植物-微生物互作方面的研究引起了广泛的关注。已有研究表明，豆科植物的根瘤由于在固氮过程中，会进行高效率的呼吸作用，豆血红蛋白的大量生成，以及各种蛋白与非蛋白物质Fe的氧化还原反应，很容易积累大量的活性氧物质。已有大量研究探索了豆科植物根瘤中抗氧化酶***的数量以及多样性。也有研究已经报道了过量重金属胁迫会对豆科植物根瘤内SOD、CAT、POD等抗氧化酶活性都造成严重的抑制作用，进而导致植物细胞受到更加严重的氧化胁迫、固氮酶活性的降低以及豆血红蛋白功能受阻等影响。尽管如此，极少有研究表明豆科植物本身的抗氧化酶***在与其共生的根瘤菌作用下是如何响应重金属胁迫的。

发明内容

本发明提供了根瘤菌Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020用于提高植物体内抗氧化酶***对重金属响应的应用。

本发明又提供了根瘤菌Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020用于提高植物对重金属耐受性的应用。

本发明还提供了根瘤菌Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020与宿主植物共生在重金属污染土壤修复中的应用。

本发明所述的重金属为铜、铅、锌、镍、镉、钴或银。

本发明所述植物为天蓝苜蓿、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、刺槐或草木樨。

本发明的优点是：

根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020在过量重金属胁迫条件下，对植物的生物量、株高、总N含量、重金属吸收量都有不同程度的提高作用。同时发明人发现该菌对过量重金属胁迫条件下的植物体内抗氧化酶***的响应也有明显的促进作用。该根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020与其宿主植物天蓝苜蓿所建立起来的共生固氮体系在土壤重金属污染的生物修复中具有一定的应用潜力。

附图说明

图1为根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020与其宿主植物天蓝苜蓿形成根瘤及根瘤发育的不同阶段；其中：3dpi(A)；8dpi(B)；13dpi(C)；18dpi(D)；

图2为根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020在过量Cu胁迫条件下，在共生体系不同的发育阶段中，对天蓝苜蓿地上部分及根部丙二醛(MDA)含量的影响，该图中不同字母表示在同一时期，不同处理之间植物的MDA含量存在显著性差异(Duncan test,p<0.05)；

图3为根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020在过量Cu胁迫条件下，在共生体系不同的发育阶段中，对天蓝苜蓿地上部分及根部超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响，该图中不同字母表示在同一时期，不同处理之间植物的SOD活性存在显著性差异(Duncan test,p<0.05)；+代表没有测得活性；

图4为根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020在过量Cu胁迫条件下，在共生体系不同的发育阶段中，对天蓝苜蓿地上部分及根部过氧化氢酶(CAT)活性的影响，该图中不同字母表示在同一时期，不同处理之间植物的CAT活性存在显著性差异(Duncan test,p<0.05)；

图5为根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020在过量Cu胁迫条件下，在共生体系不同的发育阶段中，对天蓝苜蓿地上部分及根部抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的影响，该图中不同字母表示在同一时期，不同处理之间植物的APX活性存在显著性差异(Duncan test,p<0.05)；

图6为根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020在过量Cu胁迫条件下，在共生体系不同的发育阶段中，对天蓝苜蓿地上部分及根部谷胱甘肽还原酶(GR)活性的影响，该图中不同字母表示在同一时期，不同处理之间植物的GR活性存在显著性差异(Duncan test,p<0.05)。

具体实施方式

本发明提供了一株根瘤菌Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020促进宿主植物天蓝苜蓿在过量重金属Cu胁迫下抗氧化酶***的响应，该共生固氮体系能够应用于重金属污染土壤的修复中。

本发明所述的抗Cu根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020分离自陕西凤县铜尾矿区生长的天蓝苜蓿根瘤。保藏于中国农业微生物菌种保藏中心，其保藏号为ACCC19736。

本发明提供的抗Cu根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020与其宿主植物天蓝苜蓿形成根瘤及根瘤发育的不同阶段。

本发明提供的抗Cu根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020在过量Cu胁迫条件下，对宿主植物天蓝苜蓿生物量、株高、总氮含量及Cu吸收量具有显著提高作用。

本发明提供的抗Cu根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020在过量Cu胁迫条件下，在接菌后对天蓝苜蓿地上部分及根部丙二醛(MDA)含量都有不同程度的降低作用。

本发明提供的抗Cu根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020在过量Cu胁迫条件下，在接菌后对天蓝苜蓿地上部分超氧化物歧化酶(SOD)活性具有显著的提高作用；在接菌后对植物根部SOD活性也均表现出明显的提高作用。

本发明提供的抗Cu根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020在过量Cu胁迫条件下，在接菌后对天蓝苜蓿根部过氧化氢酶(CAT)活性具有不同程度的提高作用；在接菌后3d对植物地上部分CAT活性也有明显的提高作用。

本发明提供的抗Cu根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020在过量Cu胁迫条件下，在接菌后对天蓝苜蓿地上部分抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性具有不同程度的提高作用。

本发明提供的抗Cu根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020在过量Cu胁迫条件下，在接菌后对天蓝苜蓿根部谷胱甘肽还原酶(GR)活性具有不同程度的提高作用；在接菌后18d对植物地上部分GR活性也有显著提高。

本发明提供的抗Cu根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020在过量Cu胁迫条件下，在共生体系不同的发育阶段中，对天蓝苜蓿地上部分和根部抗氧化酶基因的表达量表现出不同程度的上调作用。

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不限于这些实施例。

实施例：

菌悬液的制备与植物的种植

(1)供试菌株接种于TY液体培养液中，28℃摇床150r.min^-1振荡培养24-30h至OD600约至0.8，菌悬液于8000r.min^-1离心5min收集菌体，菌体用无菌ddH₂O₂清洗两次，重新悬浮于无氮营养液中备用。

(2)将100g植物种植基质蛭石与珍珠岩混合物(V/V＝2：1)至于盆钵中(直径为10cm)，盆底平铺一层纱布，以防渗漏，之后封口，121℃下高压蒸汽灭菌1h。之后将一定体积的Cu²⁺贮备液稀释于无菌无氮营养液中，浇入到灭菌后的盆钵中，浇透(每盆约180ml)，使盆钵中Cu²⁺胁迫的最终浓度为200mg/kg。将处理后的盆钵再次封口，于室温下平衡7d，使加入的Cu²⁺溶液充分均匀地分布于栽培基质中。选用均匀，饱满，大小一致的种子(所用的天蓝苜蓿种子由甘肃农业大学草业学院曹致中教授提供)，75％乙醇浸泡5min，之后用20％次氯酸钠溶液(有效氯为8％)浸泡10min，无菌水反复冲洗10次，于超净工作台播种于处理平衡后的栽培基质中，每盆播种8株，将盆钵置于植物光照培养箱中，培养条件如下：25℃，200μmol m^-2s^-1光照培养16h，21℃暗反应8h。约7d后第一片真叶长出，将制备好的菌悬液(约10⁹CFU ml^-1，每植株1ml)接种于植株根部，接种同体积无菌无氮营养液的植株作为空白对照，每个处理3盆重复。接菌后用透明的保鲜膜覆于盆钵口，避免外界杂菌的侵入及处理之间的交叉污染(约7d后将保鲜膜去除)。将接菌的当天记为0dpi(即接菌后0天)。植物生长期间按需浇无氮营养液(每盆每隔5-6d约150ml)。

所用无氮营养液成分及配方如下(g/L)：

Gibson微量元素液(g/L)

天蓝苜蓿形成根瘤及根瘤的发育过程

据植物根瘤生长情况观察，确定天蓝苜蓿形成根瘤及根瘤成熟的发育过程，即接菌后3天(3dpi，无根瘤形成)，8天(8dpi，微小，白色根瘤形成)，13天(13dpi，小的，粉色根瘤形成)，18天(饱满的粉色根瘤可见)。如图1所示。

植物生长指标、抗氧化酶活性的测定及抗氧酶基因表达量的分析

分别于3dpi、8dpi、13dpi和18dpi取样测定植物地上部与根部抗氧化酶的活性。同时于每一取样时间分别称取大约0.1g地上部，根部，迅速放入液氮中保存，待后期提取总RNA用，以便利用qRT-PCR技术对植物地上部分和根部抗氧化酶基因的表达量进行分析。植物生长至18dpi后收获进行生长指标的测定，用自来水小心地将根部清洗干净，用吸水纸将植株表面多余水分吸干，将植株地上部和根部分开，分别测量记录其鲜重，干重，株高，总氮含量及Cu吸收量。

(1)结果表明，与不接种的植物相比，接种S.meliloti CCNWSX0020的植物在200mg/kg Cu²⁺胁迫条件下，对植物地上部分及根部干重分别提高了28.3％和67.1％；对植物的株高提高了16.1％；对植物地上部分和根部总N含量分别提高了34.7％和55.6％；对植物地上部分和根部Cu的总吸收量分别提高了33.9％和120.4％(表1)。

(2)在200mg/kg Cu²⁺胁迫条件下，与不接菌的植物相比，接菌S.melilotiCCNWSX0020的植物在接菌后8d，13d，18d地上部的MDA含量分别降低了15.0％，25.2％和27.2％。同样，接菌植物的根部MDA含量也分别降低了13.3％，13.2％和16.0％(图2)。

(3)在200mg/kg Cu²⁺胁迫条件下，较不接菌植株相比，接菌植物地上部分SOD活性在接菌后3d，13d和18d分别显著提高了26.3％，62.7％，40.0％。同样，接菌植物根部SOD的活性在接菌后8d，13d，18d也显著提高了21.8％，43.1％和12.4％(图3)。

(4)在200mg/kg Cu²⁺胁迫条件下，较不接菌植株相比，接菌植物根部CAT活性在接菌后的3d，13d和18d分别显著提高了44.8％，28.5％和31.2％；在接菌后3d，接菌的植株地上部分CAT活性也表现出了明显的提高(图4)。

(5)在200mg/kg Cu²⁺胁迫条件下，接菌植物地上部分APX活性较不接菌植物相比在接菌后8d和18d分别显著提高了93.4％和23.8％(图5)。

(6)在200mg/kg Cu²⁺胁迫条件下，接菌植物根部的GR活性较不接菌植物相比，在接菌后8d，13d和18d分别显著提高了49.8％，54.2％和14.3％。接菌植物的地上部分GR活性在接菌后18d测定也比不接菌植物有显著的提高(图6)。

(7)在200mg/kg Cu²⁺胁迫条件下，无论是植物地上部分还是根部，抗氧化酶基因的表达量在共生体系不同发育时期的变化差异较大，尽管如此，接种S.meliloti CCNWSX0020仍对植物地上部分的CuZnSODc，CuZnSODp，CAT和APXc的表达量起到了上调的作用；同样，根部的CuZnSODc，CuZnSODp，CAT，APXc和GR的表达量也表现出了上调(表2-3)。无论对于接菌还是不接菌的植物，在有无Cu胁迫的条件下，抗氧化酶基因的表达随着共生体系的不同发育阶段均表现出很大差异，说明植物抗氧化酶***在接种根瘤菌或Cu处理下随着共生体系发育过程一直处于动态的变化中，也说明抗氧化酶***中各个成员均始终处于严密的控制之下，以此相互协调平衡。

上述实施例所提供的抗Cu菌S.meliloti CCNWSX0020对植物生长及其抗氧化酶***响应的促进作用的研究是通过盆栽实验实现，采用S.melilotiCCNWSX0020的宿主植物天蓝苜蓿，采用灭菌后的蛭石与珍珠岩混合物(V/V＝2：1)作为植物种植基质，选用浓度为200mg/kg的Cu²⁺溶液处理作为Cu胁迫条件。植物生长过程所需要水分与营养通过无菌的无氮营养液适时适量补充。本发明针对该共生体系发育的不同阶段下，植物地上部分及根部的生物量、总氮含量、Cu吸收量、MDA含量、抗氧化酶(SOD，CAT，APX和GR)的活性，及其相应的抗氧化酶基因表达量分别进行测定与分析。

Claims

1.根瘤菌Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020用于提高植物体内抗氧化酶***对重金属响应的应用。

2.根瘤菌Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020用于提高植物对重金属耐受性的应用。

3.根瘤菌Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020与宿主植物共生在重金属污染土壤修复中的应用。